Summary
RNA干扰（RNAi）技术为基础的疗法的发展，一种新型的战略发展，transkingdom RNA干扰（tkRNAi）。该技术使用非致病性细菌产生并传递到靶细胞治疗短发夹RNA（shRNA）。在这里，tkRNAi成功地应用于古典ABCB1介导的多药耐药（MDR）的癌细胞逆转。
Abstract
RNA干扰（RNAi）代表一个特定的mRNA表达抑制的高效机制。除了其作为一个功能强大的实验室工具的潜力，RNAi途径似乎是有希望的治疗利用。对于RNA干扰（RNAi）技术为基础的治疗，交付的发展RNA干扰调解剂对靶细胞的主要障碍之一。一种新的策略，以克服这一障碍是transkingdom RNA干扰（RNAi的TK）。这种技术采用非致病性细菌，如大肠杆菌 ，产生并传递到靶细胞治疗短发夹RNA（shRNA）诱导的RNAi。第一代TK的RNAi介导载体，跳闸，含有噬菌体T7启动子表达调控治疗的shRNA利益。此外，行程由耶尔森氏菌pseudotuberculosis发票编码invasin的轨迹，允许自然的非侵入性细菌进入β1整合素阳性哺乳动物细胞和单核细胞增生李斯特菌HlyA基因，产生listeriolysin O.这种酶可以使治疗的shRNA摆脱项囊泡内的靶细胞的细胞质中。 TRIP结构是一个称职的非致病性大肠埃希氏菌菌株，编码T7 RNA聚合酶对T7启动子驱动的shRNA的合成所必需的引入。一个良好的特点与癌症相关的，针对不同的RNAi战略目标分子是ABCB1（MDR1/P-glycoprotein，MDR1/P-gp）。这ABC转运行为，作为药物挤压泵和调解“经典”ABCB1 -介导的多药耐药（MDR）的特点是由一个特定的交叉耐药模式的人类癌症细胞的表型。不同的ABCB1表达MDR肿瘤细胞治疗与反ABCB1 shRNA表达载体轴承 E. 大肠杆菌 。此过程导致癌细胞内的RNAi途径激活一个相当大的下调ABCB1编码的mRNA以及相应的药物挤出泵的。因此，增强药物蓄积在质朴的耐药癌细胞MDR表型逆转。通过这种模式，数据提供的证据的概念，TK RNAi是适用于癌症相关的因素，如ABCB1在人类癌细胞中，调制。
Protocol
1）细菌的shRNA的交付
- 与细菌培养开始之前，人们已经准备LB培养基和LB琼脂。
- LB培养基掂量出酵母提取物（0.5％W / V），细菌用胰蛋白胨（1.0％W / V），氯化钠（0.6％W / V）和稀王水bidest这些组件。制备的溶液，在高压灭菌器消毒，然后准备使用。
- 对于细菌用琼脂（1.5％W / V）的LB琼脂平板已经被添加到前杀菌的LB培养基。
- 在微波加热直到完全溶解的LB琼脂的LB琼脂。让我们冷静下来解决方案可触及，直到瓶子很容易灼伤。选择阳性克隆进一步的步骤添加卡那霉素（100毫克/毫升）。
- 吹打LB琼脂溶液20毫升到10厘米的Petri菜，准备在层流工作台（无菌条件下）的LB琼脂平板。让板冷静下来，直到液体已成为坚实的。板块现在已经准备好使用，并可以储存在4 ° C。
- 编码shRNA的表达载体转化为主管大肠杆菌大肠杆菌 ceq221热休克， 使用氯化钙程序。
- 含100μg/ ml卡那霉素的LB琼脂板的板转化菌，盖上盖子，用封口膜密封板和培育倒挂在37 °彗星在夜间。
- 采摘生长的菌落，用牙签，接种细菌阳性克隆的迷你文化。转移到7.0毫升含100毫克/毫升卡那霉素和培养在37℃以上夜间在200转筛的新鲜LB培养基牙签。
- 接种100毫升的新鲜LB培养基含37 100 mg / ml的卡那霉素1:100迷你文化在夜间，在1升的锥形瓶中，并培育℃以上夜间在200转筛。
- 种子25 × 10 4（种子细胞的数量取决于根据细胞株的细胞生长速度;汇合应播种后24小时〜70-80％）人胃癌细胞每孔（EPG85 257RDB）6 -以及菜肴，并培育这些在37℃，5％的CO 2，水蒸汽在夜间饱和的气氛。
- 前癌细胞感染，超过TK RNAi载体含有大肠杆菌的夜间文化大肠杆菌是衡量一个光度计来确定的OD 600。稀释细菌的解决方案，直到0.5的光密度达到 （外径600 = 0.5 = 1.6 × 10 8细菌细胞/ ml）。
- 更换对FCS的培养基30分钟以前的细菌共同培养的癌细胞FCS含细胞培养液中。
- 1 × PBS洗两次细菌，并在无血清Leibovitz的L - 15培养基稀释。
- 添加稀释细菌癌细胞（感染复数=每个肿瘤细胞的细菌细胞的数量），在需要的教学语言和共同培育的细菌和2个小时的癌细胞在37 ° C。
- 合作培养的癌细胞后2小时内与1X x PBS洗两次，一旦与含血清的L - 15 100 U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素，2.5微克/ 150微克/毫升霉素，莱博维茨培养基毫升庆大霉素，和100μg/ ml卡那霉素。
- 继续培养癌细胞在37℃，5％的二氧化碳 ，水蒸气饱和的气氛。
- 细菌治疗的效果，可以可视化的实时定量RT - PCR测定mRNA水平，荧光显微镜和免疫印迹分析蛋白水平，并与功能分析，如流式细胞仪分析，细胞增殖实验显示。 （如果需要，这些程序可以在详细描述）。
2）代表性的成果
如果协议是正确执行，其结果应与图所示的。
荧光显微镜
图1显示了三个小时后，细菌治疗的人胃癌细胞相比，未经处理的细胞（B）（a）在。围绕处理的细胞的细胞核，可以检测出细菌。
图1：荧光显微镜细菌治疗（1:500）后人类胃癌细胞和未经处理的人胃癌肿瘤细胞作为对照，DAPI染色，DAPI带通滤波器（Λem= 640纳米），40倍的目标。
实时定量RT - PCR
一个约70％的MDR1 mRNA的下调（黑梁）图2可以看出，治疗后与治疗细菌。亲代细胞作为阳性对照，由于缺乏MDR1基因的过度表达。 257RDB P170包括细胞株的质粒表达抗多药耐药基因的shRNA小号transkingdom RNAi技术直接比较其他RNAI沉默策略。未经处理的耐药细胞株EPG85 257RDB过度表达的多药耐药，缺乏的shRNA表达质粒的细菌处理相同的细胞系，并治疗细菌携带质粒表达反MRP2的shRNA治疗这个细胞系作为阳性对照。
图2：实时定量RT - PCR MDR1基因治疗后与治疗大肠杆菌 mRNA的表达大肠杆菌 ceq221表达抗多药耐药基因的shRNA（教学语言1：500）。用看家基因醛缩酶正常化。未经处理的细胞的细胞线EPG85 257RDB MDR1/aldolase比例分别为100％。使用学生的t -检验计算P值（* = P <0.05，** = P <0.005，*** P <0.001）。
Western blot分析
图3显示多药耐药基因也下调了细菌处理后的蛋白质水平上进行。这显示缺乏父母的药物敏感细胞株（EPG85 257P），未经处理的耐药细胞株（EPG85 257RDB）MDR1的表达和处理的样品MDR1的表达MDR1的表达。可以观察到的细菌处理的细胞MDR1的一个明显的下调。 
图3：免疫印迹分析未经处理的药物敏感EPG85 - 257P MDR1的表达水平，未经处理的耐药EPG 257RDB，EPG85 - 257RDB与E.共同孵育后。 大肠杆菌 ceq221 + P43 MDR1的。小学AB C219 1:100，抗肌动蛋白二级AB抗鼠1:10 000 1:5 000。
细胞毒试验
如图4所示的细胞毒性实验等功能的分析也transkingdom的RNAi的运作指标。亲本细胞株和ANIT - MDR1基因的shRNA表达质粒的细胞株，其中包含不显示任何柔红霉素的阻力。耐药细胞株EPG85 257RDB和另外两个对照组不显示在抗多药耐药基因的shRNA表达柔红霉素的阻力可以逆转约90％的细菌处理的样品相比，在电阻的显着变化。
图4：细胞毒试验。药物由一个细胞存活的细胞毒试验的具体确定的IC50值。使用学生的t -检验计算P值（* = P <0.05，** = P <0.005，*** P <0.001）。
蒽环类药物的积累检测
据降低细菌处理的样品的电阻（图4），蒽环类抗多药耐药基因的shRNA处理的细胞积累增加约90％，如图5所示。父母的细胞株和细胞系257RDB P170表现出强烈的柔红霉素积累高达100％。耐药变异显示很少任何积累。抗多药耐药基因的shRNA表达细菌处理的细胞显示anthracyline积累增加了90％。
图5：蒽环类药物的积累检测。蒽环类药物的积累通过流式细胞仪检测细菌治疗后6天的癌细胞。使用学生的t -检验计算P值（* = P <0.05，** = P <0.005，*** P <0.001）。
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Discussion
接种感染的细胞数和相应的教学语言的使用，关键取决于下观察细胞系，他们的增长速度。为了找到最佳的手机号码，播种，预实验，以确定的速度增长，强烈推荐。除此之外，不同的水分应进行测试，由于有限的延长，细胞可以站立，没有压力的死亡细菌的入侵。下观察基因的下调可能会有所不同的最佳时间点。建议执行超过一定的时间来寻找最佳条件内实验。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
授予没有工作是支持的。 01GU0615的“Bundesministerium献给Forschung和TECHNOLOGIE（BMBF）的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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