Summary
طرق لإعداد جيل من مصفوفة حقن الأنسجة decellularized وحقنه في الفئران عضلة القلب
Abstract
هذا البروتوكول يوفر أساليب للإعداد للحقن هلام خارج الخلية (ECM) مصفوفة لعضلة القلب تطبيقات هندسة الأنسجة. باختصار ، هو مجفد decellularized الأنسجة ، والمضروب ، إنزيمي هضمها ، وتقديمهم إلى درجة الحموضة ثم الفسيولوجية. وlyophilization يزيل كل محتوى الماء من الأنسجة ، مما أدى إلى ECM الجافة التي يمكن أن تكون الأرض إلى مسحوق ناعم مع طاحونة صغيرة. بعد الطحن ، يتم هضمها ومسحوق ECM مع البيبسين لتشكيل مصفوفة تعطى عن طريق الحقن. بعد تعديل درجة الحموضة 7.4 ، يمكن حقن مادة سائلة مصفوفة في عضلة القلب. وقد أظهرت نتائج فحوصات توصيف المواد الهلامية المصفوفة السابقة التي تنتج من نسيج عضلة القلب والتامور decellularized الاحتفاظ مكونات ECM الأصلية ، بما في ذلك البروتينات المختلفة ، والببتيدات الجليكوزامينوجليكان. نظرا لاستخدام هذه المواد للهندسة الأنسجة ، في توصيف فيفو يكون مفيدا بشكل خاص ، وهنا ، وهي طريقة لأداء حقنة جماعية في البطين الأيسر (LV) وتقدم مجانا الجدار كوسيلة لتحليل استجابة المضيف للهلام في مصفوفة نموذج حيوان صغير. وتمكنت من الوصول إلى تجويف الصدر من خلال الحجاب الحاجز ويتم حقن قليلا فوق قمة في الجدار الحر LV. يمكن للسقالة مشتقة بيولوجيا يمكن تصور وضع العلامات التي البيوتين قبل الحقن وتلوين ثم أقسام الأنسجة مع الفجل البيروكسيداز - مترافق neutravidin ووضع تصور عن طريق تلوين (DAB) diaminobenzidine. ويمكن أيضا تحليل للمنطقة الحقن يمكن القيام به مع تلوين النسيجية والمناعية. في هذه الطريقة ، وأظهرت دراسة سبق الهلام مصفوفة التامور وعضلة القلب لتشكيل ليفي ، وتعزيز شبكات مسامية تشكيل سفينة داخل منطقة الحقن.
Protocol
1. قبل معالجة الأنسجة التحضير
- قبل استخدام هذا البروتوكول ، يتعين على المرء أن يكون بالفعل decellularized النسيج في الاختيار. لهذا المثال ، يتم decellularized الخنازير الطازجة وعينات تأمور الإنسان باستخدام مفرط التوتر ويشطف ناقص التوتر في الماء (DI) منزوع الأيونات وسلفات الصوديوم دوديسيل (SDS).
- على وجه التحديد ، وغسل أول تأمور الخنازير في الماء لمدة 30 دقيقة DI ، ثم يقلب باستمرار في SDS 1 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 24 ساعة ، تليها المياه ساعة DI 5 الشطف. لpericardia الإنسان ، وشطف الأولى في المياه DI مدة 30 دقيقة ، ثم يقلب باستمرار في SDS 1 ٪ في برنامج تلفزيوني عن 60-65 ساعة ، يعقبها DI بين عشية وضحاها الشطف. إزالة جميع العينات من الحل النهائي وشطف مرة أخرى تحت الماء يشغل دي 1.
- للتحقق من decellularization ، وإزالة قطعة صغيرة ، طازجة تجميده في أكتوبر تجميد المتوسطة ، ويستغرق 10 ميكرومتر أقسام الأنسجة كل 100 ميكرومتر في جميع أنحاء عينة للفحص عن طريق التحليل النسيجي ، كما ذكرت سابقا 34-36.
- استخدام الهيماتوكسيلين والبقع يوزين (H & E) لفحص الأنسجة لعدم وجود نوى. يمكن للمرء أيضا استخدام Hoescht الفلورسنت 33342 صمة عار (1.0 ميكروغرام / مل) من الحمض النووي للتحقق من H & نتائج E ؛ لفترة وجيزة ، وإصلاح الأجزاء ، ترطيب وشطف في الماء ، وصمة عار لمدة 10 دقيقة ، وثم شطف جيدا وتخزينها في الظلام. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام عدة مثل الدم DNeasy Qiagen وطقم الأنسجة ، الذي صمم لقياس محتوى الحمض النووي من مجموع العينة.
2. إعداد حقن ECM
- Lyophilization
- بعد التحضير المناسب ، وتجميد العينات decellularized مع النيتروجين السائل أو عن طريق تخزين في -80 درجة مئوية. Lyophilize العينات حتى تجف تماما. اعتمادا على النظام الخاص بك ومحتوى الماء من العينات الخاصة بك ، وهذا قد يستغرق من 12 إلى 72 ساعة.
- الطحن
- مرة واحدة جافة تماما ، ويستخدم مصنع صغير لطحن ايلي ECM الجافة الى مسحوق ناعم. اختيار حجم غربال المناسبة لأغراضك ، وهنا يتم استخدام شبكة قياس 40. بمجرد أن غالبية العينة قد حان من خلال تصفية وإزالة جمع جرة مع مسحوق ECM المضروب. إذا كان هناك ليست سوى عينة صغيرة ، ويمكن استخراج ما تبقى من العينة من مصنع في مجموعة متنوعة من الطرق ، وهنا يتم استخدام Q - تلميح لإزالة ECM عالقا خلف ريش ثابتة للطاحونة.
- دائما التأكد من أن طاحونة نظيفة وخالية من الحطام. من المهم أيضا للتأكد من أن كلا من طاحونة وعينتك جافة تماما ، أي الرطوبة المتبقية سوف يتسبب في ECM لتجميع وتتجمع معا ، ومنع طحن ناجحة. ECM قد تلتقط الرطوبة من الهواء وهكذا يجب ان تذهب مباشرة من lyophilizer إلى الطاحونة.
- الهضم
- لتشكيل ECM عن طريق الحقن ، يتم هضم مسحوق البيبسين. تم تعديل بروتوكول التالية من Freyetes ، وآخرون. (2).
- فمن المهم للحفاظ على كمنتج العقيمة وقت ممكن ، كما سيتم حقنه في الجسم الحي والتلوث قد يسبب مضاعفات. وهكذا ، واستخدام قوارير معقمة وتزن الملاعق وتصفية كل الحلول قبل الاستخدام. وستكون الخطوة lyophilization بعد الطحن وقبل الهضم يساعد أيضا الحفاظ على العقم.
- تزن من أصل المبلغ المطلوب من مسحوق ECM الى قنينة التلألؤ المناسبة. لمجموع كميات أصغر من 1 مل ، من المستحسن استخدام قارورة سعة 2 و لكميات أكبر ، قارورة 20 مل. هذا يضمن أن هناك ما يكفي من السائل في الجزء السفلي من القارورة لاثارة بفعالية.
- تزن من أصل المبلغ المطلوب من البيبسين إلى قارورة التلألؤ. إضافة حمض الهيدروكلوريك 0.1 M بحيث البيبسين هو بتركيز 1 ملغ / مل. تأكد يذوب تماما البيبسين (أي الجسيمات) قبل الاستعمال ويمكن بواسطة هذا سارعت vortexing الحل البيبسين.
- إضافة الحل البيبسين / حمض الهيدروكلوريك على القارورة التلألؤ مع مسحوق ECM ECM بحيث يتم التركيز على 10 ملغ / مل.
- يحرك باستمرار لإيجاد حل 60-65 ساعة وتجريف دورية باستمرار على الجانبين من القارورة بملعقة تزن أو الملعقة.
- تعديل درجة الحموضة
- يتم تنفيذ هذه الخطوة لجلب المواد السائلة إلى مصفوفة درجة الحموضة والفسيولوجية لإبطال نشاط البيبسين ، والحفاظ عليها من الشق في ECM أخرى. مرة أخرى ، تأكد من استخدام الحلول التي تمت تصفيتها مع الماء ميليبور.
- يضاف 1 م هيدروكسيد الصوديوم ليكون 10/01 حجم الأصلي. اختبار درجة الحموضة عند هذه النقطة وإضافة كميات صغيرة (2-10 ميكروليتر) من هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك بحيث يتم الوصول إلى درجة الحموضة المطلوبة (7.4). تتبع جميع المبالغ الصغيرة المضافة لتحييد أو إزالتها لفحص الحموضة. مرة واحدة وقد تم تحييد الحل ، إضافة إلى برنامج تلفزيوني 10X 10/01 الحجم النهائي (1 / 9 الحجم الحالي). تحديد تركيز ECM عن طريق الحقن ومن ثم إضافة 1X PBS المشترك للوصول إلى النهائي المطلوبncentration هنا 6 ملغ / مل.
- ويمكن أن يتم توصيف ECM عبر حقن SDS - PAGE ، Blyscan الفحص GAG اللونية ، والتحليل الطيفي الشامل.
- عند هذه النقطة ، يمكن حقن هذه المادة في الجسم الحي مصفوفة لتشكيل سقالة للهندسة الأنسجة عضلة القلب.
- البيوتين وصفها
- يمكن المفتاحية للECM مع البيوتين قبل الحقن لرؤية سهلة للحقن ECM.
- يعد حل 10MM من البيوتين وإضافة إلى حقن ECM في نسبة 0.3mg/mg. ينبغي أن تكون في ECM التركيز المطلوب للحقن. إذا حقن بتركيز 6 ملغ / مل ، إضافة البيوتين 40 ميكرولتر في 1 مل من ECM. قبل الحقن ، والحفاظ على الحل البيوتين ECM على الثلج لمدة ساعة على الأقل 1.
- لا يمكن أن يؤديها كل خطوات المعالجة في درجة حرارة الغرفة. للحفاظ على حقن مصفوفة من التبلور ، قد فعلت الخطوة تعديل درجة الحموضة على الجليد.
3. حقن عضلة القلب
- إعداد الحقن
- للإناث الفئران (225-250 ز) المستخدمة هنا ، أعدت 75 ميكرولتر الحقن الرقم الهيدروجيني 7،4 ECM حقن في 0.1 مل يميل المحاقن مع الإبر قياس 30. إذا استخدمت الفئران الذكور (375-400 ز) ، يمكن حقن 90 ميكرولتر.
- ويجب تعقيم جميع المستلزمات الجراحية قبل الجراحة ، وهنا نستخدم حزمة تعقيمها الجراحية التي تحتوي على كافة الأدوات اللازمة.
- في يوم من الجراحة ، وهو سبراغ داولي هارلان الفئران باستخدام تخدير isoflurane بنسبة 5 ٪ ، باستخدام منظار الأذن intubated ، وحافظت على 2.5 ٪ ثم isoflurane طوال الإجراء.
- إضافة مرهم مصطنعة المسيل للدموع لعيون الحيوان للوقاية من الجفاف والشعر. إدارة 3 مل من محلول لترطيب قارعو الأجراس Lactated أثناء الجراحة. وينبغي أن يتم ذلك عن طريق الحقن تحت الجلد في منطقة البطن السفلى.
- وضع الحيوانات في موقف ضعيف على طاولة العمليات الجراحية والشريط أسفل بلطف أطرافه. استخدام مقص لإزالة الشعر على البطن وفراغ الشعر الحر قبل الغسل.
- اتخاذ سلسلة من الحقن صغيرة (حوالي 50 ميكرولتر لكل منهما) من 2 ٪ ليدوكائين على طول قطري من عملية zyphoid إلى الجانب الأيمن السفلي من البطن. فرك ثم ثلاث مرات مع betadine ، بدءا في الوسط ، والانتقال الى الخارج. كرر مع الايثانول 70 ٪. تغطية الحيوانية باستخدام ثنى الجراحية مع نافذة دائرية مسبقة الصنع ؛ آمنة مع المشابك منشفة ، إذا لزم الأمر.
- باستخدام مشرط رقم 10 إجراء شق 3-4 سم من عملية سيفي الشكل إلى الجانب الأيمن السفلي من البطن. تحديد موقع العملية سيفي الشكل وتشريح أسفل عموديا عبر العضلات للحق ، والحرص على تجنب سفينة كبيرة على اليمين. وبمجرد الانتهاء من تشريح العضلات من خلال استخدام المقص لقطع أفقيا من خلال العضلات ، وتعريض الحجاب الحاجز. نتوخى الحذر لتفادي الكبد.
- باستخدام طول 36 بوصة من الدرز Vicrile 3-0 وزوج من المرقأة ، قيادة واحدة إبرة من خلال عملية zyphoid وسحب الخيط منتصفه. الشريط طرفي الخيط معا وذلك لإصلاح نقطة أعلاه وراء رفع الحيوانية أساسا zyphoid صعودا وكشف الحجاب الحاجز. مع آخر طوله 36 بوصة من 3-0 خياطة Vicrile ، محرك إبرة من خلال العضلات الأقرب إلى عملية سيفي الشكل ، ومرة أخرى ، من خلال سحب وتحديد تاريخ إنتهاء إلى نقطة أخرى على يمين طاولة الجراحة ، وتعريض كامل تجويف الجراحية.
- عند هذه النقطة ، يجب أن تكون قادرا على رؤية القلب من خلال الحجاب الحاجز. باستخدام زوج صغيرة من الفئران microforceps الأسنان ، والاستيلاء على مركز للحجاب ، تخلعها نحوك وإجراء شق صغير جدا مع مقص حادة. فمن المهم للغاية لاستخدام مقص حادة للغاية من أجل تجنب بدس الرئتين. مرة واحدة وأحرز هذا الثقب ، وسوف يتراجع في الرئتين ، مما يسمح لك لجعل شق 2-3 سم رأسيا من خلال الحجاب الحاجز لتصور القلب.
- إدراج 3 بوصة Q - تلميح إلى اليسار من تجويف لدفع الرئتين للخروج من الطريق. استخدام منشفة المشبك لتأمين Q - غيض في المكان. Q - استخدام آخر لنقل معلومات سرية في الرئة اليمنى من الطريق من أجل تحديد موقع كيس التامور. باستخدام زوج من microforceps وزوج من ملقط مسنن كبير ، المسيل للدموع خلال كيس التامور ، وفضح ذروة القلب. إذا كان الحيوان خضع سابقا إجراء احتشاء ، سوف يكون بالفعل تأمور غائبة.
- الاستيلاء على قمة القلب مع microforceps الأسنان وحقن الفئران المواد السائلة مصفوفة ثلث الطريق صعودا من القمة. أدخل الإبرة موازية للسطح epicardial وضخ مع مشطوف حافة من الإبرة إلى اليسار. تأكد من تجنب الوريد كبيرة في القلب. انتظر بضع ثوان قبل إزالة الإبرة. سترى تبييض الأنسجة في موقع الحقن.
- تنظيف الدم في التجويف وإزالة المشبك منشفة وس بلاغ الذي عقد في الرئة اليمنى. microhemostats المنحنية واستخدام الفئرانالأسنان microforceps لإغلاق الحجاب الحاجز. جعل عقدة الأولي ثم استخدم ملقط مسنن وmicrohemostats لإغلاق الحاجز مع خياطة مستمرة وإبرة مدبب. قبل أن يغلق تماما ، تضاف PE160 أنابيب الشفط واستخدام الحقنة 10 مل لاخلاء تجويف الصدر كما شددت خياطة.
- عندما أجلت بشكل صحيح والمغلقة ، وينبغي أن يكون الحجاب الحاجز مقعرة. والحجاب الحاجز محدب يشير إلى أن هناك ما زال الهواء في تجويف.
- عند هذه النقطة يمكن ان يتحول الى isoflurane الى 1 ٪.
- تأخذ بها كل من الغرز 3-0 Vicrile عقد تجويف مفتوحة. استخدام الماء المعقم على ترطيب العضلات ، ومحو الزائدة بعيدا مع * نصيحة أو شاش معقم. استخدام جديد من طول 3-0 خياطة لإغلاق طبقة العضلات مع خيوط متقطعة.
- عند هذه النقطة ، يمكن تشغيل isoflurane قبالة.
- تنظيف المنطقة بالماء المعقم والسلع الاساسية لإغلاق استخدام الجلد. إذا الدبابيس وسوف تتدخل في الدراسة ، ويمكن أيضا 5-0 خياطة البرولين استخدامها. في هذه الحالة ، استخدم عكس القطع (RC) لإغلاق الإبرة في الجلد مع خيوط متقطعة. في كلتا الحالتين ، بقعة الغراء خلال شق جراحي مغلقة.
- استخدام Q - تلميح لأدهن موقع شق مع مرهم مضاد حيوي ثلاثي.
- السماح للحيوان لاسترداد تحت الأوكسجين بنسبة 100 ٪.
- عندما يبدأ في التنفس الحيوانات حول المروحة ، إزالة أنبوب القصبة الهوائية.
- بمجرد أن الحيوانات هي القصية ، تدير الحقن تحت الجلد من 0.05 ملغم / كغم من هيدروكلوريد البوبرينورفين وإعادتهم إلى وطنهم في قفص منشفة معقمة.
- ينبغي أن تتلقى الحيوانات بعد الجراحة المراقبة والرعاية.
- في الوقت نقطة من الاهتمام ، والموت الرحيم والحيوانات وقلوب إزالة للتحليل. تؤخذ مقاطع عرضية قصيرة المحور ويمكن ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) لتحليل الأنسجة الإجمالي. في نقطة زمنية قصيرة ، فإن المنطقة تبدو وكأنها حقنت شبكة والوردي ليفي الذي انتشر interstitially. في نقاط وقت لاحق ، وسوف يلاحظ المرء تدفق الخلايا وتدهور في نهاية المطاف من المصفوفة حقن بعد 2 إلى 3 أسابيع. إذا كان المسمى ECM مع البيوتين قبل عن طريق الحقن ، ويمكن تصور أن يكون أكثر مباشرة من تلطيخ والبيوتين ، مترافق مع HRP streptavidin. ويمكن استخدام تلطيخ المناعى لتحديد خلايا معينة أو الهياكل في منطقة الحقن ، وهنا كانت الشرائح شارك الملطخة مع isolectin FITC - مترافق التي تربط الخلايا البطانية والأخضر وتتفلور أكتين العضلات الأضداد المضادة للسلسة مع ثانوية Alexafluor الأجسام المضادة التي تقارير SMCs باللون الأحمر.
4. ممثل النتائج
تظاهر توصيف المواد السابقة من مصفوفة أعدت في هذا الطريق والإبقاء على العديد من الجزيئات. على وجه التحديد ، تم تحديد البروتينات الليفية متعددة وعبر جليكوبروتينات مطياف الكتلة (الجدول 1). إذا تم العثور على المواد المصفوفة تجهيزها وفقا لهذا البروتوكول لم يعد يحتوي على مجموعة معقدة من الجزيئات ، فإنه يمكن أن البروتوكول يعمل decellularization قاس جدا. مرة واحدة مجفف بالتجميد الكامل ، والمجففة تأموري ECM يشبه الورق ، وتكوم قاسية جدا. سوف أنواع الأنسجة الأخرى تشبه التعبئة الفول السوداني. إذا المطحون جيدا ، وينبغي أن تندرج ECM من خلال غربال ويتم جمعها في الجرة في القاع. إذا كان هناك يسار الرطوبة في العينة ، سوف تتجمع معا ECM وتتعثر في غرفة الطحن. بعد الهضم ، وينبغي أن يكون الحل ECM لون حليبي وخالية تماما من الجسيمات مرئية. وسوف يكون أيضا أكثر قليلا لزجة من حمض الهيدروكلوريك وحدها. إذا ECM لا تهضم جيدا ، وسوف تكون هناك جسيمات الكبيرة في القارورة ، بدلا من ذلك ، قد يتلف ECM من الحل. بعد تعديل درجة الحموضة ، وليس هناك تغيير ملحوظ في الحل ، وECM ما زال غائما ، سائلة متجانسة. إذا كان يبدأ في هلام ، فإن زيادة اللزوجة ، وسوف يكون من الصعب أو المستحيل استخلاص المواد تصل الى حقنة. إذا حدث هذا ، تنفيذ الخطوة تعديل درجة الحموضة على الجليد ، وقبل حلول مبردة. مرة واحدة وقد أعد هذه الحقن ، والاحتفاظ بها على الجليد حتى الاستخدام. إذا كان الحقن ناجحا ، ومنطقة حول الطرف إبرة يبيض وبلعة الصغيرة مرئيا. إذا لم تلاحظ ذلك ، قد ذهبت الى غرفة الحقن بدلا من داخل الجدار. عندما يصل الحيوان خياطة بعد الحقن ، وإغلاق دقيق للحجاب هي الخطوة الأكثر أهمية. إذا فعلت بشكل صحيح ، سوف تكون مشددة ضد الحجاب الحاجز والرئتين وسيظهر مقعرة. إذا كان هناك أي هواء اليسار داخل الرئتين ، وسوف يظل الحجاب الحاجز محدب ، أو لديها مساحة من حيث البالونات. عند فحص الأنسجة في منطقة الحقن في وقت مبكر نقطة (30 دقيقة الى 4 ساعات بعد الحقن) ، ينبغي للمرء أن يرى الوردي ، ومنطقة ليفي أن يخلو من هذه الخلايا هي المادة المصفوفة تجميعها بعد الحقن (الشكل 2) . شبكة وغالبا ما ينتشر interstitially قد تكون موجودة في جميع أنحاء قطاعات كثيرة. A possتفسير ible لرؤية سوى مساحة صغيرة جدا من هلام مصفوفة هو أن جزء من الحقن اخطأت الهدف وجماعية تم حقن إما في غرفة LV أو تسربت من مكان الحقن. بالإضافة إلى ذلك ، اعتمادا على الوقت تهليم ، قد تختلف من انتشار خلالي.
الشكل 1. هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) النتائج. (أ) معيار الوزن الجزيئي. (ب) نوع الكولاجين ذيل فأر الأول (2.5 ملغ / مل) بالمقارنة مع الإنسان solubilized (C) والخنازير (D) تأموري ECM (7 ملغ / مل). لاحظ وجود الكولاجين وكذلك البروتينات وغيرها من العديد من الببتيدات في عينات المصفوفة التامور.
الجدول 1. مكونات ECM تحديدها مع التحليل الطيفي الشامل.
الشكل 2 حقن عضلة القلب : تهليم في الجسم الحي. H & E صمة الإنسان (A) والخنازير (ب) مصفوفة تأموري الحقن التي تبلور في الجسم الحي بعد 45 دقيقة. سهام دلالة الموقع مصفوفة ملون الوردي أخف من عضلة القلب. شريط الحجم هو 500 ميكرون.
الشكل 3. الوعائية تسلل خلية. فلوري البقع للسفن في حقن الإنسان (ميلان) والخنازير (مدافع) مصفوفة المواد الهلامية في اسبوعين. وصفت الخلايا البطانية الخضراء (A ، D) ، في حين وصفت خلايا العضلات الملساء الحمراء (B ، E). وتظهر الصور المدمجة في شريط جيم وواو المقياس هو 100 ميكرون. خطوط بيضاء منقطة تشير مجال حقن مصفوفة ، على النحو الذي يحدده H & E تحليل مقطع المجاورة.
الشكل 4. الخلايا الجذعية داخل المنطقة حقن المصفوفة. وصمة عار للHoescht النوى (الأزرق) و C - مجموعة (الأخضر) ويحدد في الخلايا الجذعية البشرية (A) والخنازير (B) مناطق الحقن المصفوفة. شريط النطاق هو 50 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب يسمح لجيل من السقالات ، والمستمدة من الناحية البيولوجية لهندسة الأنسجة حقن عضلة القلب. وقد وضعت في البداية على الرغم من هذه الطرق لصنع واختبار في الجسم الحي من هلام مصفوفة عضلة القلب وقدمت هنا مع هلام تأموري مصفوفة ، ويمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع أي نوع من الأنسجة ، شريطة أن تكون الأنسجة decellularized مناسب. يجب أن يتم تنفيذ Decellularization والتحقق منها قبل استخدام هذه الأساليب ، لأن وجود الحمض النووي في المصفوفة هلام يمكن أن تسبب رد فعل غير مرغوب فيها المناعي. وهناك مجموعة متنوعة من الطرق لdecellularize المادية ، ولقد كتبت عدة مراجعات جيدة على الموضوع 3 ، 4.
عند إعداد مصفوفة هلام ، فمن الضروري أن يتم مجفف بالتجميد الكامل للعينة ، لأن أي رطوبة المتبقية سوف يمنع الطحن. أيضا ، لتجنب استنشاق مسحوق ECM ، دائما ارتداء قناع الوجه عند الطحن. أخيرا ، من المهم أن نلاحظ أنه عندما يقصد جل مصفوفة لفي الدراسة المجراة ، ينبغي أن يقوم في إعداد وبطريقة عقيمة ممكن من أجل تقليل مخاطر التلوث التي يمكن أن تؤدي إلى عدوى. إذا كان تعديل هذا البروتوكول لنوع الأنسجة المختلفة ، وسوف تحتاج إلى بعض المعلمات يكون الأمثل. على سبيل المثال ، يمكن للمرء تغيير تركيز ECM بعض الأنسجة تحتاج إلى تركيز أعلى على شكل مادة هلامية وبعض الجل قد بتركيزات أقل. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الضروري تركيز الوقت وهضم الببسين تختلف إذا كانت قوة البيبسين المستخدمة هي مختلفة إلى حد كبير.
ويمكن الاستفادة من جراحة الحيوانات الصغيرة النموذج المبين في هذا البروتوكول لحقن أي مواد في التبلور الموقع في الجدار الحر LV. لدراسة الخلية المستندة إلى علاجات هندسة الأنسجة في القلب ، وهذا يمكن أن بروتوكول يستخدم لحقن مجموعة من الخلايا وهذه المواد الهلامية المستمدة من الناحية البيولوجية. وبالتالي ، فإن هذه الأساليب يوفر إطارا مرنا لإعداد وتوصيف المواد الهلامية المستمدة من الجسم الحي بيولوجيا للهندسة الأنسجة عضلة القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
استخدم الحيوان : تم تنفيذ جميع التجارب في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية التي نشرتها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو والرابطة الأمريكية لاعتماد المختبرات رعاية الحيوان.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث في جزء من المعاهد الوطنية للصحة المدير الجديد المبتكر برنامج الجائزة ، وهو جزء من المعاهد الوطنية للصحة خارطة الطريق للبحوث الطبية ، من خلال عدد المنح - 1 - DP2 OD004309 - 01. SBS - N. أود أن أتوجه بالشكر إلى جبهة الخلاص الوطني للبحوث زمالة دراسات عليا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized |
| Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21217 | |
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | |
| Equipment: | |||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | |
| Labconco Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670520 | |
| Surgical supplies: | |||
| Betadine | Purdue Products L.P. | 67618-154-16 | |
| Lactated Ringers Solution | MWI Veterinary Supply | 003966 | |
| KY Jelly | MWI Veterinary Supply | 28658 | |
| Lidocaine, 2% | MWI Veterinary Supply | 17767 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Artificial tear ointment | Fisher Scientific | NC9860843 | |
| Triple antibiotic ointment | Fisher Scientific | 19082795 | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 60307-120-25 | |
| Otoscope | MWI Veterinary Supply | 008699 | |
| Stop cock | MWI Veterinary Supply | 006245 | |
| 3-0 Vicrile suture | MWI Veterinary Supply | J327H | |
| 5-0 Proline suture | MWI Veterinary Supply | s-1173 | |
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon Inc. | 8684G | |
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | |
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | |
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| PE160 suction tubing | BD Biosciences | 427430 | |
| Clippers | MWI Veterinary Supply | 21608 | |
| Skin staples/stapler | Ethicon Inc. | PRR35 | |
| General supplies: | |||
| Stir plates | |||
| 0.1 M HCl | |||
| 1 M NaOH | |||
| 10x PBS | |||
| 1x PBS | |||
| 70% Ethanol | |||
| 0.1 mL syringes | |||
| 10 mL syringe | |||
| Q-tips | |||
| Surgical glue | |||
| Surgical drape | |||
| Towel clamps | |||
| Small hand-held vacuum |
References
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F.
- Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).
- Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).
- Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).
- Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction. Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
