Summary
שיטות להכנת ג'ל מטריצה בזריקות מרקמות decellularized והזרקת אותו לתוך שריר הלב חולדה
Abstract
פרוטוקול זה מספק שיטות להכנת ג'ל בזריקות תאית (ECM) מטריצה עבור יישומי הנדסה רקמת שריר הלב. בקצרה, היא רקמה decellularized lyophilized, הסתובבו, מתעכל enzymatically, והביא אז pH פיזיולוגי. Lyophilization מסיר את כל התוכן מים מן הרקמה, וכתוצאה מכך ECM יבש שניתן האדמה לאבקה דקה עם מפעל קטן. לאחר טחינה, אבקת ECM מתעכל עם פפסין להקים מטריצה להזרקה. לאחר תקנון ל-pH 7.4, חומר נוזלי מטריצה יהיה ניתן להזריק לתוך שריר הלב. תוצאות של מבחני אפיון קודמים הראו כי המטריצה ג'לים המופק רקמות decellularized קרום הלב ואת שריר הלב לשמור רכיבים ECM הילידים, כולל חלבונים, פפטידים מגוונים glycosaminoglycans. לאור השימוש בחומר זה עבור הנדסת רקמות, באפיון vivo שימושית במיוחד; כאן, שיטה לביצוע זריקה עירונית לתוך החדר השמאלי (LV) קיר פנוי מוצג כאמצעי ניתוח התגובה לארח הג'ל מטריקס מודל חיה קטנה. גישה חלל החזה הוא צבר דרך הסרעפת ואת הזריקה נעשית מעט מעל לשיא בקיר LV חינם. פיגום ביולוגי נגזר ניתן דמיינו ידי תיוג-ביוטין לפני הזריקה ולאחר מכן מכתים סעיפים רקמה עם צנון סוס peroxidase-מצומדות neutravidin באופן חזותי באמצעות מכתים (DAB) diaminobenzidine. ניתוח באזור ההזרקה יכולה להיעשות גם עם צביעה היסטולוגית ו immunohistochemical. בדרך זו, הג'לים נבדק בעבר מטריצה קרום הלב ואת שריר הלב הוצגו בצורה סיבי, רשתות נקבוביים לקדם היווצרות כלי בתוך האזור ההזרקה.
Protocol
1. טרום עיבוד רקמות הכנה
- לפני השימוש בפרוטוקול זה, יש כבר decellularized הרקמה של בחירה. בדוגמה זו, חזירי טריים דגימות קרום הלב האנושי decellularized באמצעות שטיפות hypotonic ו hypertonic במים (DI) deionized ו dodecyl נתרן סולפט (SDS).
- באופן ספציפי, תחילה לשטוף את קרום הלב חזירי במים DI במשך 30 דקות, מוסיפים ברציפות SDS 1% פוספט בופר סליין (PBS) למשך 24 שעות, ואחריו מים 5 שעה DI לשטוף. עבור pericardia האדם, תחילה לשטוף במים DI במשך 30 דקות, מוסיפים ברציפות SDS 1% PBS עבור 60-65 שעות, ואחריו DI לילה לשטוף. הסר את כל דגימות מן הפתרון הסופי שלהם שוב לשטוף תחת זרם מים די 1.
- כדי לוודא decellularization, להסיר פיסה קטנה, טרי להקפיא אותו בינוני אוקטובר מקפיא, לקחת רקמה סעיפים 10 מיקרומטר כל 100 מיקרומטר בכל דגימה לבדיקה היסטולוגית באמצעות ניתוח, כפי שדווח בעבר 34-36.
- השתמש hematoxylin ו eosin (H & E) כתמים לבחון את הרקמה על היעדרו של גרעינים. אפשר גם להשתמש Hoescht פלורסנט 33342 כתם (1.0 מיקרוגרם / מ"ל) עבור ה-DNA כדי לאמת את H & תוצאות E; בקצרה, לתקן את הסעיפים, רעננותם ולשטוף במים, כתם במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף היטב ולאחסן בחושך. לחלופין, אפשר להשתמש בערכה כגון דם Qiagen DNeasy וערכת רקמות, אשר נועד לכמת את תוכן ה-DNA הכולל של מדגם.
2. הכנת ECM בזריקות
- Lyophilization
- לאחר הכנה מתאימה, להקפיא את דגימות decellularized עם חנקן נוזלי או על ידי אחסון ב -80 ° C. Lyophilize דגימות עד יבש לחלוטין. בהתאם למערכת שלך ואת התוכן של דגימות המים שלך, זה יכול לקחת 12-72 שעות.
- כרסום
- לאחר להתייבש לחלוטין, מיל מיני ויילי משמש לטחון את ECM יבש לאבקה דקה. בחר את גודל מסננת מתאימה למטרות שלך, כאן, רשת 40 מד משמש. לאחר שרוב המדגם הגיע דרך פילטר, להסיר את הצנצנת אוסף עם אבקת ECM מחורץ. אם יש רק מדגם קטן, שאר המדגם ניתן לחלץ מן הטחנה במגוון של דרכים, פה, Q-טיפ משמש כדי להסיר את ECM תקוע מאחורי להבים נייחים של הטחנה.
- תמיד לוודא כי הטחנה נקי ללא פסולת. כמו כן, חשוב לוודא כי הן טחנת מדגם שלך יבש לחלוטין, כל שנותר לחות תגרום ECM אל המצרפי גוש ביחד, מניעת כרסום מוצלח. ECM רשאי לאסוף לחות מהאוויר וכך צריך ללכת ישירות lyophilizer אל הטחנה.
- עיכול
- כדי ליצור את ECM להזרקה, אבקת מתעכל פפסין. פרוטוקול הבאים שונה מן Freyetes, et al. (2).
- חשוב לשמור על כמוצר סטרילית ככל האפשר, שכן הוא יהיה מוזרק in vivo ו הזיהום עלול לגרום לסיבוכים. לפיכך, השימוש בקבוקונים סטריליים ולשקול כפיות לסנן את כל הפתרונות לפני השימוש. צעד lyophilization לאחר כרסום לפני העיכול גם יעזור לשמור על סטריליות.
- תשקלי את הכמות הרצויה של אבקת ECM לתוך בקבוקון scintillation המתאים. עבור אמצעי אחסון הכולל קטן מ 1 מ"ל, מומלץ לך להשתמש בקבוקון 2 מ"ל ועבור כמויות גדולות יותר, בקבוקון 20 מ"ל. הדבר מבטיח כי יש מספיק נוזל בחלקו התחתון של המכל לעורר ביעילות.
- תשקלי את הכמות הרצויה של פפסין לתוך בקבוקון הנצנץ. הוסף 0.1 M HCl כך עכלן הוא בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. ודא עכלן נמס לגמרי (לא חלקיקים) לפני השימוש הזה יכול להיות מיהר ידי vortexing הפתרון פפסין.
- מוסיפים את פתרון עכלן / HCl כדי בקבוקון הנצנץ עם אבקת ECM כך ECM הוא בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל.
- מערבבים פתרון ברציפות 60-65 שעות, מעת לעת מגרדים את צידי הבקבוקון עם כפית לשקול או מרית.
- התאמת ה-pH
- שלב זה מתבצע כדי להביא את חומר נוזלי מטריקס ל-pH הפיזיולוגי להשבית עכלן, שמירה עליו מפני הדבקות ECM נוספת. שוב, הקפד להשתמש בפתרונות מים מסוננים עשה עם Millipore.
- 1 M NaOH הוא הוסיף להיות 1 / 10 נפח המקורי. מבחן ה-pH בנקודה זו ולהוסיף כמויות קטנות (2-10 μl) של NaOH או HCl כזה pH הרצוי (7.4) הוא הגיע. לעקוב אחרי כל כמויות קטנות מוסף נטרול או הוסרו לצורך בדיקות pH. לאחר פתרון נוטרל, להוסיף PBS 10x להיות 1 / 10 נפח סופי (09/01 נפח הנוכחית). קבע את הריכוז של ECM בזריקות ולאחר מכן להוסיף 1x PBS להגיע שיתוף הסופי הרצויncentration, כאן 6 מ"ג / מ"ל.
- אפיון ECM בזריקות יכול להיעשות באמצעות SDS-PAGE, Assay Blyscan GAG Colorimetric, וספקטרוסקופיה המונית.
- בשלב זה, החומר מטריצה ניתן להזריק in vivo להקים פיגום להנדסת רקמות שריר הלב.
- ביוטין, תיוג
- ECM יכול להיות מתוייגים עם ביוטין לפני הזריקה להדמיה קל של ECM המוזרק.
- הכן פתרון 10mm של ביוטין ולהוסיף ECM בזריקות ביחס של 0.3mg/mg. ECM צריך להיות בריכוז הרצוי להזרקה. אם הזרקת בריכוז של 6 מ"ג / מ"ל, להוסיף 40 ביוטין μL לכל 1 מ"ל של ECM. לפני הזריקה, לשמור על פתרון ביוטין-ECM על קרח למשך שעה לפחות 1.
- צעדים כל עיבוד יכול להתבצע בטמפרטורת החדר. כדי לשמור על מטריצה בזריקות מ gelling, צעד ההתאמה pH ניתן לעשות זאת על הקרח.
3. שריר הלב זריקות
- הזרקת הכנה
- עבור חולדות נקבות (225-250 גרם) משמש כאן, 75 זריקות μL של 7.4 pH ECM בזריקות הוכנו מזרקים 0.1 מ"ל היטה עם 30 מחטים מד. אם חולדות זכרים (375-400 גרם) שימשו, 90 μL יכול להיות מוזרק.
- אספקת כל כירורגית יש לעקר לפני הניתוח, כאן אנו משתמשים חבילת כירורגית autoclaved המכיל את כל הכלים הדרושים.
- ביום הניתוח, עכברוש Sprague-Dawley הארלן הוא מורדם באמצעות isoflurane 5%, מחובר לצינורות באמצעות otoscope, ומתוחזק אז על 2.5% isoflurane לאורך ההליך.
- הוסף משחה דמעה מלאכותית העיניים של החיה כדי להגן מפני יובש השיער. ניהול 3 מ"ל של תמיסת האצבעות Lactated להידרציה במהלך הניתוח. זה צריך להיעשות באמצעות הזרקה תת עורית באיזור הבטן התחתונה.
- מניחים את חיה במצב פרקדן על שולחן הניתוח בעדינות קלטת את הגפיים. השתמש קוצץ כדי להסיר את השיער על הבטן והשיער ואקום חינם לפני קרצוף.
- ביצוע סדרה של זריקות קטן (כ 50 μL כל אחת) של 2% לידוקאין לאורך אלכסוני מתהליך zyphoid בצד הימני התחתון של הבטן. ואז לשפשף שלוש פעמים בבטאדין, החל באמצע נעה החוצה. חזור עם אתנול 70%. מכסים את בעלי החיים באמצעות וילון כירורגי עם חלון מוכנות מעגלי; מאובטח עם מהדק מגבת, במידת הצורך.
- באמצעות 10 מס 'אזמל לעשות חתך 3-4 ס"מ מתהליך xyphoid בצד הימני התחתון של הבטן. אתר תהליך xyphoid ו לנתח בצורה אנכית כלפי מטה דרך השריר ימינה, להיות זהיר, כדי למנוע את כלי גדול בצד ימין. ברגע שיש לך גזור את השריר, להשתמש במספריים לחתוך לרוחב דרך השריר, לחשוף את הסרעפת. להיזהר על הכבד.
- שימוש באורך של 36 סנטימטר תפר 3-0 Vicrile וזוג hemostats, אחד מחט כונן בתהליך zyphoid ומשוך תפר באמצע. קלטת את הקצוות של תפר ביחד לתקן את זה עד לנקודה מעל ומאחורי החיה למעשה הרמת zyphoid מעלה לחשוף את הסרעפת. עם אורך של 36 סנטימטר אחר תפר 3-0 Vicrile, כונן המחט דרך שריר הקרוב ביותר בתהליך xyphoid, ושוב, למשוך דרך לתקן את הקצוות לנקודה אחרת בצד ימין של שולחן הניתוחים, לחשוף באופן מלא את חלל כירורגית.
- בשלב זה, אתה אמור להיות מסוגל לראות את הלב דרך הסרעפת. באמצעות זוג קטן של microforceps שן חולדה, לתפוס את מרכז הסרעפת, למשוך אותו החוצה לכיוון לך לעשות חתך קטן מאוד במספריים קהים. חשוב מאוד להשתמש במספריים בוטה מאוד על מנת למנוע דוקר את הריאות. לאחר החור הזה נעשה, הריאות יהיה לסגת, המאפשר לך לבצע חתך 2-3 ס"מ אנכית דרך הסרעפת לדמיין את הלב.
- הוסף 3 אינץ' Q-קצה בצד שמאל של חלל לדחוף את הריאות מן הדרך. השתמש מהדק מגבת כדי לאבטח את Q-טיפ במקום. שימוש נוסף Q-טיפ להעביר את הריאה הימנית מן הדרך על מנת לאתר את שק קרום הלב. שימוש בזוג microforceps וזוג מלקחיים גדולים משונן, דמעה דרך שק קרום הלב, לחשוף את שיאו של הלב. אם החיה עברה בעבר הליך אוטם, קרום הלב כבר יהיה נעדר.
- תפוס את שיאו של הלב עם microforceps שן חולדה להזריק את החומר מטריצה נוזל בשליש הדרך למעלה מן השיא. הכנס את המחט מקבילה לפני השטח epicardial ולהזריק עם הקצה המשופע של המחט שמאלה. הקפידו להימנע וריד לב רבה. חכו כמה שניות לפני הוצאת המחט. אתה אמור לראות הלבנה של הרקמה באתר ההזרקה.
- לנקות את הדם בחלל ולהסיר את מהדק מגבת Q-טיפ כי החזיק את הריאה הימנית. השתמש microhemostats המעוגל ואת עכברוששן microforceps כדי לסגור את הסרעפת. הפוך את הקשר הראשוני ולאחר מכן להשתמש במלקחיים משוננים microhemostats כדי לסגור את הסרעפת עם תפר רציף מחט מחודדות. לפני סגירת לגמרי, הכנס PE160 צינורות יניקה ולהשתמש מזרק 10 מ"ל לפנות את החזה כמו תפר היא הידקה.
- כאשר פונו כראוי סגור, הסרעפת צריכה להיות קעורה. הסרעפת קמורה עולה כי עדיין יש אוויר בחלל.
- בשלב זה isoflurane ניתן מורד 1%.
- קח את שניהם 3-0 תפרים Vicrile מחזיק חלל פתוח. השתמש מים סטריליים כדי מימה השריר, מנגב עודף משם עם Q-טיפ או גזה סטרילי. השתמש באורך החדש של תפר 3-0 כדי לסגור את שכבת השרירים עם התפרים לסירוגין.
- בשלב זה, isoflurane יכול להיות כבוי.
- אזור נקי עם מים סטריליים סיכות להשתמש כדי לסגור העור. אם סיכות יפריע המחקר, 5-0 תפר פרולין יכול לשמש גם. במקרה זה, להשתמש במחט הפוכה (RC) חיתוך כדי לסגור את העור עם התפרים לסירוגין. בשני המקרים, במקום דבק כירורגי על החתך נסגר.
- השתמש Q-טיפ למשוח את האתר עם חתך משולש משחה אנטיביוטית.
- אפשר החיה להתאושש תחת 100% חמצן.
- כאשר בעלי החיים מתחיל לנשום סביב ההנשמה, להסיר את צינורית לקנה הנשימה.
- לאחר החיות הם sternal, להזריק תת עורית של 0.05 מ"ג / ק"ג של hydrochloride עצירות ולהחזיר אותם בכלוב בביתם על מגבת סטרילית.
- בעלי חיים צריכים לקבל שלאחר הניתוח תצפית אכפת.
- בנקודות זמן של עניין, בעלי החיים מורדמים ולבבות הסיר לניתוח. קצר לחצות קטעים ציר נלקחים וניתן מוכתם hematoxylin ו eosin (H & E) עבור ניתוח רקמות ברוטו. בנקודות זמן קצר, את האזור המוזרק יופיע ברשת, ורוד סיבי שהתפשט interstitially. בנקודות זמן מה לאחר מכן, אחד יהיה לראות זרם של תאים הפירוק הסופי של מטריקס מוזרק לאחר 2 עד 3 שבועות. אם ECM סומן עם ביוטין לפני הזרקה, זה יכול להיות יותר דמיינו ישירות על ידי מכתימה את ביוטין עם streptavidin HRP-מצומדות. מכתים immunohistochemical יכול לשמש כדי לזהות תאים מסוימים או מבנים באזור ההזרקה, כאן השקופיות היה שותף מוכתם isolectin FITC-מצומדות אשר נקשר לתאי אנדותל וירוק מאיר ו אנטי אקטין נוגדן שריר חלק עם משניות Alexafluor נוגדן הדיווחים SMCs באדום.
4. נציג תוצאות
אפיון הקודם של חומרים מטריצה מוכן בדרך זו הוכיחה את השמירה על מגוון רחב של מקרומולקולות. באופן ספציפי, חלבונים סיביים מספר גליקופרוטאינים זוהו באמצעות ספקטרומטריית מסה (טבלה 1). אם החומרים מטריצה מעובד על פי פרוטוקול זה נמצא כבר לא מכילים מערך מורכב של מקרומולקולות, זה יכול להיות כי פרוטוקול decellularization מועסק היא קשה מדי. לאחר lyophilized במלואה, מיובשים קרום הלב ECM נראה כמו נייר, קשה מאוד מקומט. סוגי רקמות אחרות ידמה אריזה בוטנים. אם וטוחנים היטב, ECM צריך ליפול דרך המסננת ואת ייאספו בצנצנת בתחתית. אם יש שמאל לחות במדגם, ECM יהיה גוש יחד להיתקע בחדר כרסום. לאחר העיכול, פתרון ECM צריך להיות בצבע חלבי נקייה לחלוטין חלקיקים לעין. זה יהיה גם קצת צמיגה יותר לבד HCl. אם ECM אינו טוב לעיכול, עדיין יהיו חלקיקים גדולים הבקבוקון; לחילופין, ECM עלולה לקרוס מתוך פתרון. לאחר תקנון pH, אין שינוי גלוי הפתרון, ECM עדיין נוזל עכור, הומוגני. אם הוא מתחיל ג'ל, הצמיגות יגדל וזה יהיה קשה או בלתי אפשרי לצייר את החומר לתוך מזרק. אם זה יקרה, לבצע את התאמת ה-pH לדרוך על קרח, עם טרום צונן פתרונות. לאחר זריקות הוכנו, לשמור אותם על הקרח עד לשימוש. אם הזריקה היא מוצלחת, האזור סביב קצה המחט מלבין ו בולוס קטן גלוי. אם זה לא הוא ציין, הזרקת ייתכן נכנס לתא במקום בקיר. כאשר תפירת את החיה לאחר ההזרקה, סגירת זהיר של הסרעפת היא הצעד החשוב ביותר. אם נעשה בצורה נכונה, הסרעפת תהיה צמודה הריאות יופיע קעור. אם יש אוויר שמאל בתוך הריאות, הסרעפת יישאר קמור, או אם יש תחום שבו היא בלונים. כאשר בוחנים את היסטולוגיה באזור ההזרקה בשלב מוקדם הזמן (30 דקות עד 4 שעות לאחר הזרקה), יש לראות את אזור ורוד, סיבי כי הוא נטול תאים זהו חומר מטריקס מחדש לאחר הזרקה (איור 2) . הרשת לעתים קרובות מתפשט interstitially ועלול להיות נוכחים לאורך קטעים רבים. Possהסבר ible עבור לראות רק באזור קטן מאוד של מטריקס ג'ל הוא חלק הזריקה החמיץ את יעד עירונית, או שהוזרק לתוך תא LV או דלפו של מיקום ההזרקה. בנוסף, תלוי בזמן gelation, התפשטות ביניים עשוי להשתנות.
באיור 1. ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד) תוצאות. (א) תקן משקל מולקולרי. (ב) זנב עכברוש קולגן Type I (2.5 מ"ג / מ"ל), לעומת האדם solubilized (C) חזירי (ד) קרום הלב ECM (7 מ"ג / מ"ל). הערה נוכחות של קולגן, כמו גם חלבונים אחרים כמה פפטידים בדגימות מטריצה קרום הלב.
טבלה 1. הרכיבים ECM המזוהה עם ספקטרוסקופית מסה.
איור 2 זריקות שריר הלב:. Gelation ב vivo. H & E כתם של האדם (א) ו חזירי (ב) זריקות מטריצה קרום הלב, כי יש בג'ל in vivo אחרי 45 דקות. חצים לציין מיקום מטריקס, מוכתמות בוורוד בהיר יותר שריר הלב. בר סולם הוא 500 מיקרומטר.
איור 3. חדירת תא דם. כתמים פלורסנט עבור כלי באדם מוזרק (AC) ו - חזירי (DF) ג'לים מטריצה ב שבועיים. לתאי אנדותל מסומנים בירוק (A, D), ואילו לתאי שריר חלק מסומנים באדום (B, E). תמונות ממוזגים מוצגים C ו בר פ סולם הוא 100 מיקרומטר. קווים מקווקווים מציינים לבן את אזור ההזרקה מטריקס, כפי שנקבע על ידי H & E ניתוח סעיף סמוך.
איור 4. בתאי גזע בתוך אזור ההזרקה מטריקס. Hoescht כתם של גרעינים (כחול) ו-c-kit (ירוק) מזהה בתאי גזע (B) אזורים האדם (א) ו חזירי מטריצה ההזרקה. בר סולם הוא 50 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מאפשרת לדור של פיגומים נגזר ביולוגי הניתן להזרקה לצורך הנדסת רקמות שריר הלב. אמנם בשיטות אלו פותחו בתחילה עבור ייצור ו בבדיקת vivo של ג'ל מטריצה שריר הלב המוצג כאן עם ג'ל מטריצה קרום הלב, בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם רקמה, בתנאי הרקמה ניתן decellularized כראוי. Decellularization יש לבצע ומאומת לפני השימוש בשיטות אלה, כמו נוכחות של דנ"א בג'ל המטריצה עלול לגרום תגובה חיסונית לא רצויות. יש מגוון דרכים decellularize החומר, ביקורות טובות כמה נכתב על הנושא 3, 4.
בעת הכנת ג'ל מטריקס, חיוני כי המדגם הוא lyophilized מלא, כמו כל שאר הלחות ימנע כרסום. כמו כן, כדי למנוע שאיפה של אבקת ECM, תמיד ללבוש מסיכה כאשר כרסום. לבסוף, חשוב לציין כי כאשר ג'ל מטריצה מיועד במחקר vivo, ההכנה צריכה להתבצע באופן סטרילי ככל האפשר על מנת להקטין את הסיכון של זיהום שעלול להוביל לזיהום. אם שינוי זה פרוטוקול עבור סוג רקמה שונים, פרמטרים מסוימים צריך להיות מותאם. לדוגמה, אפשר לשנות את הריכוז של ECM רקמות מסוימים דורשים ריכוז גבוה כדי ליצור ג'ל וכמה ג'ל עשוי בריכוזים נמוכים יותר. בנוסף, את הריכוז הדרוש בזמן עכלן העיכול עשויים להשתנות אם כוחה של עכלן השתמשו שונה באופן משמעותי.
בעלי חיים קטנים ניתוח מודל המתואר פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל על זריקה של כל חומר gelling באתרו לתוך החופשי LV הקיר. כדי לבחון מבוססי תאים הנדסת רקמות טיפולים בלב, פרוטוקול זה יכול נהג להזריק שילוב של תאים אלה ג'לים נגזר ביולוגית. לכן, שיטות אלה מספקים מסגרת גמישה להכנת וב אפיון vivo של ג'לים נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
שימוש בבעלי חיים: כל הניסויים במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיות שפורסמו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש באוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו ואת האגודה האמריקנית לטיפול בבעלי חיים ההסמכה של המעבדה.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי ניו תוכנית המנהל של NIH ממציא פרס, במסגרת מפת הדרכים NIH למחקר רפואי, באמצעות מספר מענק 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. רוצה להודות ה-NSF עבור מלגת מחקר לתארים מתקדמים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized |
| Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21217 | |
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | |
| Equipment: | |||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | |
| Labconco Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670520 | |
| Surgical supplies: | |||
| Betadine | Purdue Products L.P. | 67618-154-16 | |
| Lactated Ringers Solution | MWI Veterinary Supply | 003966 | |
| KY Jelly | MWI Veterinary Supply | 28658 | |
| Lidocaine, 2% | MWI Veterinary Supply | 17767 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Artificial tear ointment | Fisher Scientific | NC9860843 | |
| Triple antibiotic ointment | Fisher Scientific | 19082795 | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 60307-120-25 | |
| Otoscope | MWI Veterinary Supply | 008699 | |
| Stop cock | MWI Veterinary Supply | 006245 | |
| 3-0 Vicrile suture | MWI Veterinary Supply | J327H | |
| 5-0 Proline suture | MWI Veterinary Supply | s-1173 | |
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon Inc. | 8684G | |
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | |
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | |
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| PE160 suction tubing | BD Biosciences | 427430 | |
| Clippers | MWI Veterinary Supply | 21608 | |
| Skin staples/stapler | Ethicon Inc. | PRR35 | |
| General supplies: | |||
| Stir plates | |||
| 0.1 M HCl | |||
| 1 M NaOH | |||
| 10x PBS | |||
| 1x PBS | |||
| 70% Ethanol | |||
| 0.1 mL syringes | |||
| 10 mL syringe | |||
| Q-tips | |||
| Surgical glue | |||
| Surgical drape | |||
| Towel clamps | |||
| Small hand-held vacuum |
References
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F.
- Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).
- Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).
- Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).
- Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction. Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
