Summary
Questo manoscritto mostra e discute le tecniche utilizzate per esaminare la suscettibilità di pesticidi e di rilevare la resistenza a contatto e pesticidi sistemici in artropodi infestanti.
Abstract
Resistenza dei parassiti ai pesticidi è un problema crescente, perché i pesticidi sono parte integrante di agricoltura ad alto rendimento di produzione. Quando pochi prodotti sono etichettati per un parassita individuo all'interno di un sistema particolare coltura, opzioni di controllo chimico sono limitati. Pertanto, lo stesso prodotto (s) sono utilizzati più volte e la pressione selezione continua è posta sulla parassiti bersaglio. Ci sono sia i costi finanziari e ambientali connessi con lo sviluppo di popolazioni resistenti. Il costo di resistere ai pesticidi è stata stimata in circa 1,5 miliardi di dollari all'anno negli Stati Uniti. Questo documento descrive i protocolli, attualmente utilizzato per monitorare artropodi (in particolare insetti) popolazioni per lo sviluppo di resistenza. Il test fiala adulti viene utilizzato per misurare la tossicità di insetticidi di contatto e una modifica di questo test è utilizzato per impianti-sistemico insetticidi. In questi test biologici, gli insetti sono esposti alla tecnica insetticida grado e risposte (mortalità) registrati in uno specifico intervallo post-esposizione. I dati di mortalità sono sottoposti ad analisi probit Log Dose per generare stime di una concentrazione letale che fornisce la mortalità al 50% (LC 50) della popolazione bersaglio e una serie di limiti di confidenza (CL) come stime della variabilità dei dati. Quando questi dati sono raccolti per una serie di insetticida sensibili della popolazione, la LC 50 può essere utilizzato come dati di base ai fini del monitoraggio futuro. Dopo le popolazioni sono stati esposti a prodotti, i risultati possono essere paragonato a un precedentemente determinata LC 50 utilizzando la stessa metodologia.
Protocol
1. Introduzione
La produzione alimentare è diventata di primaria importanza con la consapevolezza che entro il 2025 il mondo raggiungerà una popolazione di 8.040.000 mila persone 1. Ci sarà la necessità di fornire una maggiore quantità di colture alimentari rispetto a quello attualmente prodotto. Disponibilità di cibo adeguata non sarà in grado senza l'uso di prodotti fitosanitari come i pesticidi per aumentare la quantità della produzione agricola e mantenere la qualità. Basati sul ricorso storico e attuale sui pesticidi, istanze di resistenza pesticidi continueranno a verificarsi ed essere riportati nella letteratura scientifica.
Resistenza dei parassiti ai pesticidi è problematica perché i prodotti sono una componente integrante dell'agricoltura di qualità ad alto rendimento e ad alta produzione. Tuttavia, un uso eccessivo e / o uso improprio di un pesticida può portare allo sviluppo di resistenza che può essere dannoso alle coltivazioni. Parassiti (ad esempio, gli insetti, erbe infestanti, patogeni, ecc) sviluppare una resistenza da una varietà di meccanismi, ma un fattore trainante per lo sviluppo della resistenza è l'assenza di pesticidi registrati 1 con le modalità di ricorso autonomo disponibili per l'uso. Quando pochi prodotti sono etichettati per un parassita individuo all'interno di un sistema particolare coltura, opzioni di controllo chimico sono limitati. Pertanto, la stessa sostanza chimica (s) è utilizzato più volte la selezione e la pressione continua è posta sulla parassiti. Questo problema è aggravato quando il parassita è più generazioni in un solo anno e ogni generazione è esposto al pesticida.
Ci sono sia i costi finanziari e enrivornmental associata alla resistenza 2. Resistenza dei parassiti porta a tassi più elevati e le applicazioni più frequenti di pesticidi necessari per raggiungere un controllo soddisfacente. Perdite di rendimento possono verificarsi anche dopo l'aumento dell'uso di pesticidi a causa del mancato controllo del parassita bersaglio. Pimentel due stime questi costi di resistenza pesticidi negli Stati Uniti da circa 1,5 miliardi all'anno.
Le indagini della suscettibilità pesticidi tra le popolazioni dei parassiti è un approccio proattivo per rilevare qualsiasi cambiamento nelle prestazioni insetticida e fornire un allarme tempestivo di modificare le strategie di controllo chimico. Modificando le strategie di IPM in generale, la vitalità di un pesticida, può essere estesa, che a sua volta, è importante per l'agricoltura di continuare a fornire abbastanza cibo e fibre per il mondo. Questo documento descrive un protocollo che può essere utilizzato per monitorare la suscettibilità insetticida e rilevare lo sviluppo di insetticida resistenti popolazioni utilizzando il test adulti flaconcino da 3 per insetticidi di contatto e una modifica di questo test per impianto di insetticidi sistemici 4.
2. Metodi
2,1 Dichiarazione di sicurezza
Usando le precauzioni di sicurezza corretto è importante quando si tratta di insetticidi. Consultare la scheda di sicurezza (MSDS) per l'equipaggiamento di protezione individuale (DPI) prima di maneggiare i pesticidi. Laboratorio di formazione specifica sulla gestione dei pesticidi nei laboratori dovrebbero essere tenuti da personale prima di tentare qualsiasi biotest.
2.2 Rendere Soluzione stock
Sviluppare una soluzione madre di una concentrazione nota da una fonte di principio attivo insetticida (AI). Tutte le concentrazioni desiderato incluso come trattamenti nel biologico sarà effettuata dalla soluzione madre originale. Per l'interesse di questo lavoro, 100 ml di una mcg / 100 ml soluzione sarà sviluppato come una soluzione di riserva, tuttavia, qualsiasi concentrazione può essere diluito da questa concentrazione iniziale. Regolare la quantità di intelligenza artificiale grado tecnico da pesare in base alla purezza per cento.
Importo da pesare = (volume di fare) X ([# mg / ml soluzione] / [% purity/100])
Per esempio, sarebbe necessario 10152.284 mg di IA tecnica per fare 100 ml di una mcg / 100 ml soluzione di un insetticida grado tecnico del 98,5% di purezza:
(100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10.152,284 mcg
2.2.1 Vial di prova per adulti insetticidi di contatto
Riempire parzialmente un pallone tarato con acetone e pesare il valore rettificato del IA insetticida. Risciacquare la barca peso con acetone nel pallone per rimuovere tutte le insetticida dal peso barca. Riempire il matraccio alla linea di laurea con acetone. La maggior parte delle soluzioni tenuto in condizioni di refrigerazione manterrà l'attività senza perdita apprezzabile di efficacia per circa un mese.
2.2.2 Modifica di test fiala adulti di insetticidi sistemici
L'intossicazione degli insetti con insetticidi sistemici è nettamente diversa da quella dei prodotti di contatto. Prodotti sistemici di solito deve essere ingerito da l'insetto diventi attivo al posto del insetti having esposizione diretta al prodotto con insetticidi di contatto. Pertanto, il test fiala adulti è stato modificato al fine di insetticidi sistemici da testare. Il peso del IA necessari per la soluzione di riserva è calcolato simile a quello indicato nella sezione 2.2. La metodologia è simile, tranne che l'IA è dissolto in un 10% di miele peso: soluzione acquosa. Questa soluzione deve essere effettuato entro 24 ore di apertura del biologico. Se il materiale di qualità tecnica non è solubile in acqua, ad alta concentrazione di soluzione insetticida può essere fatta con acetone in modo che solo una piccola quantità di insetticida: miscela acetone viene aggiunto il miele: soluzione di acqua 4.
2,3 concentrazioni Determinare un intervallo di concentrazioni e di sviluppo
Determinare le concentrazioni adeguate necessarie per stabilire la gamma di risposte per il test biologico può essere difficile. Repliche diverse può essere necessario per definire l'intervallo di concentrazione e questo è fatto per tentativi ed errori. Inoltre, la gamma possono cambiare nel tempo se la popolazione cambia livelli di suscettibilità. Numerosi altri fattori devono essere considerati nello stabilire concentrazioni finali e includono: la famiglia di insetti, classe di insetticidi, le dimensioni di insetti, ecc In precedenza ha pubblicato i risultati di test fiala adulto può aiutare con la selezione iniziale delle concentrazioni di insetticida. Saggi biologici sono stati pubblicati per: Emitteri: Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 e 11-14 Miridae; Thysanaptera: Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, Coccinellidae Cybocephalidae 18-19 e 19; Diptera: Culicidi 20; Lepidotteri: Tortricidae 21 e Noctuidae 3, 22-26; Imenotteri: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7 e Aphelinidae 18.
Le concentrazioni sono fatte sulla base di mcg "X" / ml di soluzione. Tuttavia, quando fiale sono preparati per il test fiala adulti, solo 0,5 ml verrà aggiunto ad ogni flacone, quindi, la concentrazione del flaconcino è la metà della concentrazione fatta. Una volta che le concentrazioni sono scelto, la seguente equazione può aiutare a determinare la quantità di soluzione aggiunto per rendere la concentrazione desiderata.
(C1) (V1) = (C2) (V2)
Dove C1 è la concentrazione della soluzione madre; V1 è il volume di azioni necessario per rendere la concentrazione nuova C2 è la concentrazione in fase di preparazione, e V2 è il volume della nuova concentrazione. Per esempio, 5mls di una soluzione madre 100μg/ml è necessario per fare un 100 ml di una 5μg/ml. Questa soluzione comporterebbe 5μg/ml in fiale rivestito ad una concentrazione di 2.5μg/vial.
5mls = [(5μg/ml) (100 ml)] / (100μg/ml)
2.3.1 Vial di prova per adulti insetticidi di contatto
Riempire parzialmente flaks volumetrico, e l'importo calcolato aliquota di soluzione madre necessari per rendere la concentrazione desiderata. Riempire il matraccio con acetone alla linea di laurea e passare alla sezione 2.4 o tenuta con Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) per la conservazione in frigorifero per un uso successivo. Maggior parte delle soluzioni sono buone per 1 mese.
2.3.2 Modifica di test fiala adulti di insetticidi sistemici
Questo processo è lo stesso già citato al punto 2.3.1, tranne un 10% di miele peso: soluzione acquosa viene sostituito per l'acetone. Mix abbastanza miele: soluzione di acqua per fare tutte le concentrazioni desiderate. Queste soluzioni devono essere utilizzati entro 24 ore dalla preparazione.
2.4 Preparazione di fiale
2.4.1 Vial di prova per adulti insetticidi di contatto
Se le concentrazioni sono stati conservati in frigorifero, permettono di riscaldare a temperatura ambiente. Il volume di acetone cambia in base alla temperatura che possono influenzare la concentrazione di insetticida. Codice colore 20 flaconcini di vetro ml (predisposta per tappi a vite) per le concentrazioni di usare vernici o pennarelli.
Regolare un pipettatore ripetendo per fornire 0.5ml/concentration. Avviare i lavori con controllo acetone, seguendo con la concentrazione più bassa e continuando con concentrazioni crescenti fino a quando tutte le concentrazioni sono stati utilizzati. Versare circa la metà del volume di soluzione, come il numero effettivo di fiale da trattare (ad esempio, 20mls per 40 fiale) in un bicchiere piccolo. Quando la soluzione non è in uso, copertura di ridurre al minimo l'evaporazione che può causare variazioni di concentrazione. Disegna la soluzione insetticida in pipettatore ripetizione ed erogare 0,5 ml soluzione in fiale di vetro individuali.
Immediatamente dopo il trattamento, le fiale di vetro sono disposti su un rullo commerciale hot dog. Come la volta rulli, fiale di vetro e ruotare la acetone evapora, lasciando l'interno del flacone rivestito con la tecnicaAl insetticida grado. Il calore può degradare insetticida, quindi, è importante per il calore da fuori. Questo può essere fatto sia scollegando l'elemento riscaldante su un modello che riscalda e panini allo stesso tempo ed è controllato dallo switch stesso o utilizzando un modello di rullo hot dog che ha in modo indipendente il funzionamento interruttori per le resistenze ed i rulli. Evitare di trattare più fiale che detiene il rullo, l'acetone può evaporare prima che le fiale di vetro vengono ruotate e non possono ricevere uno strato uniforme sulle pareti flaconcino.
Lasciare le fiale di ruotare fino a quando tutti acetone è evaporato. C'è forse un sottile strato di acetone-condensa sulle pareti fiala, quindi, fiale devono essere esaminata individualmente. Tempo necessario per rotolare fiale varia in base alle condizioni di laboratorio. Una volta che le fiale sono asciutti, cappuccio e memorizzarli sia in condizioni refrigerate o scuro. Gli insetti sono stati osservati poggiante su coperchi con liner o conica liners foglio strappato che si trovano sotto il labbro del flaconcino (cioè, evitando superfici trattate), pertanto, è importante utilizzare non-allineati coperchi.
I residui di soluzione non utilizzate per preparare i flaconcini devono essere smaltiti in modo corretto. La soluzione che resta nel pallone volumetrico può essere sigillato con Parafilm e conservati in frigorifero. Date le fiale quando sono pronti, perché gli insetticidi differenti hanno differenti vite scaffale. Per esempio, piretroide rivestite fiale vanno bene per circa un mese e che fiale rivestiti con un insetticida più instabile, come un organofosfati, hanno una vita utile di due settimane o meno.
2.4.2 modificato Vial di prova per adulti insetticidi sistemici
Schiuma floreale è necessario per servire come substrato per la fornitura della soluzione insetticida per insetti 4. Tagliare schiuma floreale (x 12mm 12mm) pezzi usando un piralide del sughero. Mettete un pezzo di schiuma floreale in fiale di vetro precedentemente descritto. Riempire il pipettatore ripetendo regolato per fornire una soluzione 0,5 ml ed erogare sulla schiuma floreale. Questo volume di liquido deve saturare il pezzo di schiuma floreale, ma non dovrebbe superare il livello della schiuma nel flacone. Ancora una volta il lavoro in sequenza dal controllo (10% da miele peso: soluzione solo acqua) e più bassa alla più alta concentrazione.
2.5. Fiale Memorizzazione
2.5.1 Vial di prova per adulti insetticidi di contatto
Quando si conserva fiale insetticida rivestito, conoscere le proprietà del insetticida. Insetticidi differenti hanno differenti esigenze di storage come ad esempio: piretroidi sono sensibili alla luce e può essere conservato a temperatura ambiente, ma al buio, tuttavia, gli insetticidi organofosfati sono sensibili alla temperatura e devono essere conservati in un congelatore. Se insetticidi devono essere conservati nel congelatore, devono essere portata a temperatura ambiente prima di esporre gli insetti.2,6 Bioassay
Raccogliere gli insetti da analizzare. Questo processo può essere fatto utilizzando feromoni-esca trappole, reti spazzare, o qualsiasi altro mezzo di cattura di massa. Gli insetti devono essere detenuti per 8-24h per consentire la mortalità naturale che si verifichi per quelli feriti durante il processo di raccolta, offre loro cibo e una fonte di umidità durante questo periodo. Test di 10-25 insetti per concentrazione (10 minimo), maggiore è il numero di insetti testate, il più robusto set di dati sarà. Quando si selezionano gli insetti per il biologico, scegliere sano, persone attive e scartare gli individui letargico o anormali. Insetti posto nei flaconcini in modo che siano esposti a l'intera gamma delle concentrazioni e non solo una concentrazione alla volta. Questa procedura impedirà ponendo gli individui più sani e attivi in uno o più concentrazioni di pochi. Inoltre, se non è possibile condurre l'esperimento con un minimo di 10 insetti per concentrazione, esporre il maggior numero possibile di ogni concentrazione. Poi raccogliere più insetti dall'area stesso campione in breve tempo (2-3 settimane) e ripetere l'esperimento. Alcuni insetti possono perdere la suscettibilità (build resistenza) con il procedere della campagna agricola, quindi, la risposta degli individui raccolti all'inizio della primavera possono essere diversi da quelli raccolti in autunno 28.
Sviluppare criteri per valutare la mortalità. I criteri più comunemente usati per classificare gli insetti come moribondi o morti sono la mancanza di movimento coordinato. Queste osservazioni possono includere l'impossibilità di raddrizzarsi se collocato sulla sua superficie dorsale, incapace di sostenere il volo coordinato di 1m o la mancanza di movimento coordinato, quando dolcemente pungolati con un corpo contundente. Se l'individuo può giusto in sé, ma cade a terra, non esiste un movimento coordinato, l'insetto deve essere considerato morto. L'insetto può avere difficoltà raddrizzamento stesso su una superficie liscia, quindi, potrebbe essere necessario fornire l'insetto una superficie in modo che sia in grado di ottenere la trazione necessaria per raddrizzarsi. Recordil numero dei sopravvissuti e degli individui morti per calcolare la sopravvivenza per ciascuna concentrazione.
2.6.1 Vial di prova per adulti insetticidi di contatto
Posizionare l'insetto (s) nel flaconcino e fissare il tappo liberamente. Il coperchio deve evitare che l'insetto di fuggire, ma essere sciolto abbastanza per permettere il flusso d'aria. Per la maggior parte biotest insetti, un solo insetto si trova in ogni fiala, tuttavia, piccoli insetti, mosche bianche ad esempio, o tripidi, possono essere esposti ad una velocità di ben 30 individui per flaconcino 6, 15. Posizionare le fiale in posizione verticale a temperatura ambiente fino a quando gli insetti sono valutati per la mortalità a punto finale della prova biologica. Tempi di esposizione può variare con le specie e, eventualmente, l'insetticida 3,5-27. Nel processo di determinazione dei livelli di tossicità iniziale con una nuova specie di insetto o chimica, monitorare i soggetti a più punti di tempo previsto dopo l'esposizione. Esami può essere terminato quando la mortalità a più alta concentrazione al 100%, pur mantenendo alta sopravvivenza (mortalità <10%) nel settore non-insetticida di controllo trattati. Se il 100% di mortalità non avvenga a più alta concentrazione di sopravvivenza ad alta nel controllo, la prova biologica deve essere ripetuto utilizzando una serie di concentrazioni più elevate. Idealmente, i livelli di mortalità dovrebbe aumentare con l'aumentare della concentrazione l'insetticida.
Alcuni insetti, quando sono esposti per 24 ore, richiedono una fonte di umidità (cioè un piccolo pezzo di materiale vegetale) 12. Quando si lavora con un insetto delicato, è utile per determinare per quanto tempo l'insetto può sopravvivere nel flacone senza una fonte di umidità prima dell'esposizione insetticida nel test fiala adulti. Questa informazione può essere determinata inserendo l'insetto in un flaconcino con e senza una fonte di umidità e monitoraggio della sua sopravvivenza nel tempo, prima di condurre le indagini insetticida reale.
2.6.2 modificato Vial di prova per adulti insetticidi sistemici
Prima dell'inizio del biotest, determinare se l'insetto può nutrire e sopravvivere con schiuma floreale saturata con il miele: soluzione di acqua, in assenza di insetticida. Insetti posto in flaconcini contenenti schiuma floreale saturo di miele: solo acqua (o miele: acqua con il maggior volume di acetone utilizzati nella preparazione di operazioni di concentrazione non solubili in acqua insetticida grado tecnico) e monitorare sopravvivenza per diversi giorni. Questa modifica del test fiala adulto è solo stata esaminata con un Miridae 4 e un Pentatomidae 29, quindi, determinare la durata del test richiede più sperimentazione che per il biotest insetticida da contatto. Per esempio, lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) è stata valutata la mortalità a 24 ore dopo l'esposizione al tiametoxam, ma 72 ore per imidacloprid 4. Mortalità di Oebalus pugax F. è stata valutata a 96 ore se esposti a dinotefuran 29. Pertanto, sopravvivenza degli insetti in fiale di controllo deve essere elevata e costante per diversi giorni prima di una valutazione accurata della mortalità da intossicazione da insetticida può essere fatto.
Posizionare l'insetto (s) nel flaconcino scintillazione con la schiuma saturi floreale. Invece di sigillare le fiale con coperchio, sigillare fiale con un batuffolo di cotone. Posizionare le fiale in posizione verticale a temperatura ambiente fino a quando gli insetti sono valutati per la mortalità. Come accennato in precedenza, il tasso di mortalità a intervalli regolari. L'esame può essere terminato quando si è al 100% di mortalità a più alta concentrazione con alta sopravvivenza (mortalità <10%) nel controllo. Potrebbe essere necessario per testare le concentrazioni aggiuntivi.
2.6.3 Analisi dei dati
Corretta per la mortalità nel trattamento di controllo utilizzando una formula secondo Abbott 30.
Mortalità corretti (%) = ((sopravvivenza controllo% -% di sopravvivenza trattati) / controllo sopravvivenza%) x 100
Analizzare i dati utilizzando dose probit Log per determinare la concentrazione letale necessario per uccidere il 50% di una popolazione (LC 50) e di stabilire gli intervalli di confidenza al 95% (CL). Programmi di software sono disponibili più di determinare la LC 50 (SAS: PROC PROBIT 31, Polo-Plus 32).
3. Note
- Lavora con acetone e insetticidi sotto un negativo-cappa a flusso d'aria.
- Durante il riempimento tarati, è meglio avere due bottiglie di lavaggio di acetone. Una bottiglia di lavaggio che è stata adattata per la consegna rapida di liquidi e uno per la consegna lento. Rimuovere parte del braccio di consegna per creare una maggiore apertura e questa bottiglia può essere utilizzato per la consegna di un grande volume in fretta. Una volta che l'acetone si avvicina alla linea di laurea, bottiglie di cambiare e utilizzare la bottiglia di lavaggio con lenti di consegna in modo da avere un maggiore controllo sulla quantità che viene erogato. Se un pallone viene riempito di sopra della linea di laurea, lasciare il coperchio e permettono acetone evaporare alla linea di laurea. </ Li>
- Nota la quantità necessaria della soluzione di riserva, necessarie per preparare una concentrazione, cioè se si compila il pallone ¾ la strada, ma bisogna aggiungere 30mls, si può andare oltre la linea di laurea.
Discussion
Il LC 50 valore può essere utilizzato per stabilire la suscettibilità di base di una popolazione target (s). Il valore di questi dati possono essere in indagini di monitoraggio futuri o per l'obiettivo immediato di confronto dei risultati attuali a quella di una precedentemente determinato LC 50 a determinare la suscettibilità della popolazione target si è spostato. LC 50 valori reali possono essere confrontati tra le popolazioni esaminando gli intervalli di confidenza al 95%, se i limiti superiori ed inferiori non si sovrappongono, allora è probabile che la popolazione ha subito un cambiamento significativo nella suscettibilità e in alcune situazioni è indice di resistenza 33. L'LC 50 s può essere utilizzato anche per esaminare i cambiamenti stagionali insetticida esusceptibilitye 28, o confrontare le risposte tra le specie o insetticidi AI s. Un lavoro considerevole è anche possibile utilizzare questi dati per confrontare le risposte tra maschi e femmine 10 o tra adulti e stadi immaturi, 10,34. A volte sono ampi intervalli di confidenza o non in grado di essere calcolato. Per ottenere intervalli di confidenza stretti condurre il biotest con più insetti e / o più concentrazioni.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Cotton Incorporated Support Program Stato # 08-317MO, USDA / CSREES SR-IPM di Grant 2009-34103-20018 e Landis internazionale per il finanziamento della ricerca relativi a questa pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-100 ml glass beaker | |||
| Volumetric flask with stoppers (can use the amber colored flasks for light sensitive pesticides such as pyrethroids) | |||
| 20ml glass scintillation vials with un-lined lids | |||
| A method for color coating vials (paint or markers) | |||
| Acetone | |||
| Commercial hotdog roller (heat element disconnected) | |||
| 2 wash bottles (one modified such that the opening is large for fast delivery of the liquid and one so that the spout opening is small for slow delivery of the liquids) | |||
| Small weigh boat (make sure all plastic materials acetone safe) | |||
| Access to a balance with 0.001g readability or a higher precision. | |||
| Parafilm M | |||
| Repeater pipettor | |||
| Appropriate tips | |||
| Glass pipettes that fit in the volumetric flask. | |||
| Hood (used to remove the acetone smell) | |||
| A place to store insecticide solutions and vials [refrigerator (solutions), dark room or freezer depending on the chemical (vials)] |
References
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