Biology

モニタリングの殺虫剤抵抗性のためのバイオアッセイ

Published: December 30, 2010 doi: 10.3791/2129

Audra L.E. Miller¹, Kelly Tindall¹, B. Rogers Leonard²

¹Division of Plant Sciences, University of Missouri, Delta Research Center, ²Department of Entomology, Louisiana State University Agricultural Center

Summary

この原稿は、殺虫剤感受性を調査し、節足動物害虫に連絡することを抵抗し、全身の農薬を検出するために使用される手法を示し、説明します。

Abstract

農薬が高収量生産農業の不可欠な部分であるため、農薬への害虫抵抗性が増加する問題です。いくつかの製品が特定の作物のシステム内の個々の害虫のためにラベル付けされている場合、化学物質管理オプションは限られている。したがって、同じ製品（s）が繰り返し使用され、継続的な選択圧は標的害虫に配置されます。抵抗性個体群の開発に関連した金融と環境コストの両方があります。農薬耐性のコストは、米国では年間約15億ドルと推定されている。本稿では、現在節足動物（特に昆虫）抵抗性の発達のための集団を監視するために使用されるプロトコルを、説明します。大人のバイアル試験は、殺虫剤に連絡して毒性を測定するために使用されており、このテストの修正は、植物の全身殺虫剤に使用されます。これらのバイオアッセイでは、昆虫は、技術等級殺虫剤と特定の曝露後の間隔で記録された応答（死亡率）にさらされている。死亡率のデータは、対象集団の50％まで死亡率（LC _50）とデータのばらつきの推定値として信頼限界のシリーズ（CLの）を提供する致死濃度の推定値を生成するために用量のプロビット分析をログに供される。これらのデータは、殺虫剤感受性集団の範囲のために収集されている場合、LC _50は、将来のモニタリングの目的のためにベースラインデータとして使用することができます。集団が製品にさらされている後は、結果は同じ方法論を用いて、予め決められたLC ₅₀と比較することができます。

Protocol

1。はじめ

食糧生産は、2025年までに世界は8040000000人¹の人口に達することを実感を持つ非常に重要となっています。現在生産されているよりも、食用作物の大規模な量を供給する必要があるでしょう。十分な食料の可用性は、作物収量の量を増加させ、品質を維持するために、殺虫剤などの植物保護製品を使用せずに可能ではないでしょう。農薬に関する過去および現在の依存度に基づいて、殺虫剤抵抗性のインスタンスが発生し続け、科学論文で報告される。

製品は、高収量、高品質製品の生産の農業に不可欠なコンポーネントであるため、農薬への害虫抵抗性には問題がある。しかし、農薬の過剰使用および/または誤用は、作物生産にとって有害になることができる抵抗の開発につながることができます。害虫（すなわち、昆虫、雑草、病原体、等）は、さまざまなメカニズムによって抵抗を開発するが、抵抗の開発のための主要な推進要因は、使用可能なアクションの独立モードで登録農薬¹の欠如です。いくつかの製品が特定の作物のシステム内の個々の害虫のためにラベル付けされている場合、化学物質管理オプションは限られている。そのため、同じ化学物質（s）は繰り返し使用され、継続的な選択圧が害虫に配置されます。害虫は、単年度で複数世代を持ち、各世代が農薬にさらされているときにこの問題はさらに悪化します。

抵抗²に関連付けられている金融とenrivornmentalコストの両方があります。害虫抵抗性は、十分な制御を達成するために必要な高い率と農薬のより頻繁なアプリケーションにつながります。歩留まり損失が原因標的害虫を制御するために、障害の農薬の使用を増やした後でも発生する可能性があります。ピメンテル^2は毎年約15億ドルになる団結米国で農薬抵抗性のこれらのコストを見積ります。

害虫個体群間の農薬に対する感受性の調査では、殺虫剤のパフォーマンスの変化を検出し、化学物質管理戦略を変更する早期警告を提供するために、積極的なアプローチです。全体的なIPM戦略を変更することにより、特定の農薬の可能性は順番に、農業のために世界のために十分な食料と繊維を提供し続けることが重要となる、延長することができる。本論文では、殺虫剤の感受性を監視し、接触の殺虫剤のための大人のバイアル試験^3を使用して殺虫剤抵抗性個体群の開発と植物全身殺虫剤^4のこのテストの変更を検出するために使用できるプロトコルを説明します。

2。の方法

2.1安全に関する声明

殺虫剤を扱うときに、適切な安全上の注意を使用することが重要です。農薬を扱う前に適切な個人用保護具（PPE）の製品安全データシート（MSDS）をご覧下さい。研究室で農薬を扱う上で、特定のラボのトレーニングは、任意のバイオアッセイを試みる前に、担当者が必要とされるべきである。

2.2メイキングストック溶液

殺虫剤の有効成分（AI）のソースからの既知濃度のストック溶液を開発する。バイオアッセイでの治療として含まれているすべての所望の濃度は、元の原液から行われます。本論文では、100μg/ mlの溶液を100mlsを原液として開発されるの利益のために、しかし、任意の濃度は、この初期濃度から希釈することができる。パーセントの純度に基づいて計量する技術的等級のAIの量を調整します。

量を秤量する=（ように体積）X（[＃μg/ mlの溶液を] / [％purity/100]）

例えば、それは技術的なAIの10152.284μgのは、98.5％純度のテクニカルグレードの殺虫剤の100μg/ mlの溶液100 MLSを作るために必要になります。

（100ml）をX（[100μg/ml] / 0.985）= 10152.284μgの

お問い合わせの殺虫剤のための2.2.1アダルトバイアル試験

部分的にアセトンでメスフラスコを記入し、殺虫剤のAIの調整量を量る。計量ボートからすべての殺虫剤を除去するためにフラスコにアセトンと重量のボートを洗浄します。アセトンで目盛線にメスフラスコを埋める。冷蔵条件下で開催されたほとんどのソリューションは、約一ヶ月のための有効性のないかなりの損失との活動を維持します。

全身殺虫剤のための大人のバイアル試験の2.2.2変更

全身殺虫剤と昆虫の中毒は、接触の製品のそれとは明確に異なっている。全身の製品は、通常、代わりに直接exposurを持つ昆虫がアクティブになるために昆虫に摂取する必要があります。接触殺虫剤と同様の製品に電子。したがって、成人バイアルテストは、テストする全身殺虫剤のために変更されました。原液のために必要なAIの重量は、2.2節で述べたものと同様に計算されます。水溶液：方法論は、AIが重量の蜂蜜を10％に溶解されることを除いて、同様です。このソリューションは、バイオアッセイの開始の24時間以内になされるべきである。技術的なグレードの材料が水溶性でない場合は、殺虫剤溶液の高濃度は、そのような殺虫剤の唯一の小さな体積そのアセトンで行うことができます：アセトンの混合物は蜂蜜に追加されます：水溶液^4。

2.3濃度の範囲を決定し、開発する濃度

バイオアッセイのための応答の範囲を確立するために必要な適切な濃度を決定することは困難になる可能性があります。いくつかの複製は、濃度の範囲を定義するために必要な場合があります、これは試行錯誤によって行われます。人口は感受性のレベルを変更した場合また、範囲は時間の経過とともに変更される可能性があります。他の様々な要因は、最終濃度を確立する上で考慮して含める必要があります。成人のバイアル試験の昆虫の家族、殺虫剤のクラス、昆虫の大きさ、などこれまでに公表された結果は、殺虫剤の濃度の初期選択を支援することができます。バイオアッセイ用にパブリッシュされています：半翅目：Aleyrodiidae ^5-6、アブラムシ^7、カメムシ^80から10とカメ^11月14日、Thysanaptera：アザミウマ科^15;甲虫目：ミツギリゾウムシ科^16、ゾウムシ^17、テントウムシ^18から19とCybocephalidae ^19;双翅目：カ科^20;鱗翅目：ハマキガ科²¹およびヤガ科^{3、22から26、}膜翅目：コマユバチ科^7,18、ヒメバチ科^26-27日 Aphidiidae ¹⁸トビコバチ科^7、およびツヤコバチ科^18。

濃度は、"X"μg/ mlの解決策に基づいて作られています。しかし、バイアルを成人バイアルのテスト用に準備されているときに、唯一の0.5ミリリットルを各バイアルに追加されますので、バイアルの濃度の半分の濃度が作ったです。一度濃度が選択され、次式が所望の濃度を作るために追加した溶液の量を決定する上で役立ちます。

（C1）（V1）=（C2）（V2）
ここで、C1は、原液の濃度であり、C2は、準備される濃度であり、V1は新しい濃度を作るために必要な株式のボリュームであり、V2は、新たな濃度のボリュームです。例えば、100μg/ml原液の5mlsは、5μg/mlの100mlsを作るために必要です。この5μg/mlソリューションは2.5μg/vialの濃度でコーティングされたバイアルことになります。

5mls = [（5μg/ml）（100mls）] /（100μg/ml）

お問い合わせの殺虫剤2.3.1アダルトバイアル試験

部分的に所望の濃度を作るために必要な原液の計算量を体積flaksを入力し、分注し。目盛線までアセトンでメスフラスコを記入し、後で使用するため冷蔵庫で保管するためのセクション2.4またはパラフィルムM（アルキャン社、ニーナ、ウィスコンシン州）とシールに進んでください。ほとんどのソリューションは、1ヶ月に適しています。

全身殺虫剤のための大人のバイアル試験の2.3.2変更

水液をアセトンに置換されている：以前に重量の蜂蜜10重量％を除き、2.3.1で述べたように、このプロセスは同じです。すべての所望の濃度を作るために水のソリューション：十分な蜂蜜を混ぜる。これらのソリューションは、調製後24時間以内に使用する必要があります。

バイアル2.4準備

お問い合わせの殺虫剤のための2.4.1アダルトバイアル試験

濃度が冷蔵庫に格納されている場合は、周囲温度に温めたことができます。殺虫剤の濃度に影響を与えることができる温度に基づいて、アセトン変化の量。塗料やマーカーを使って濃度のカラーコード20 mlのガラスバイアル（スクリューキャップ用装備）。

0.5ml/concentrationを提供するために繰り返しピペッターを調整します。アセトンコントロールを使用開始する、全ての濃度が使用されるまで増加する濃度と最低濃度と継続的に続く。小さなビーカーに扱われるようにバイアルの実際の数（すなわち、40バイアル用20mls）としてソリューションの約半分の体積を注ぐ。ソリューションを使用しないときは、濃度の変化を引き起こす可能性が蒸発を最小限に抑えるために、それをカバーしています。繰り返しピペッターに殺虫剤のソリューションを描画し、個々のガラスバイアルに0.5ミリリットルのソリューションを分注する。

処理直後、ガラスバイアルは商用ホットドッグのローラー上に配置されています。ローラーの回転、ガラスバイアルが回転し、アセトンが蒸発すると、技術的なグレードの殺虫剤でコーティングされたバイアルの内側を残して。熱はdできます殺虫剤をegradeので、オフにする熱のために重要です。 Thisは、加熱すると同時に、ロールバックし、同じスイッチまたは独立して発熱体とローラーのスイッチに機能hasホットドッグのローラーのモデルを用いて制御されるモデルに発熱体を切断することで行うことができます。ローラーが保持しているよりも多くのバイアルの治療は避け、ガラスバイアルを回転させ、彼らがバイアルの壁にさらにコーティングを受信できなくなる前にアセトンが蒸発する可能性があります。

すべてのアセトンが蒸発するまでバイアルを回転することができます。多分バイアルの壁にアセトン縮合の細かい層があるので、バイアルは、個別に検討する必要があります。バイアルをロールバックするために必要な時間は、実験室の条件に基づいて異なります。一度バイアルは、乾燥、キャップであり、チルドまたは暗い条件のいずれかに格納します。昆虫は（すなわち、処理された表面を避ける）バイアルの唇の下にハング円錐形のライナーや破損フォイルライナー付き蓋で休んで観察されているので、国連が並ぶ蓋を使用することが重要です。

バイアルを準備するために使用されない残りの溶液は適切に廃棄する必要があります。メスフラスコに残っているソリューションは、パラフィルムで密閉し、冷蔵庫で保存することができます。別の殺虫剤が異なる貯蔵寿命を持っているので、彼らが準備されているバイアルを日付。例えば、ピレスロイドコーティングされたバイアルは、約1ヶ月に適しています。バイアルは、より不安定な殺虫剤でコーティングされたのに対し、有機リン酸化合物と同様に、2週間以内の貯蔵寿命を持っている。

全身殺虫剤用2.4.2修正アダルトバイアル試験

フローラルフォームは昆虫⁴に殺虫剤のソリューションを提供するための基質として機能するために必要です。コルクボーラーを使ってフローラルフォーム（12mm x 12mmの）部分をカット。前述のガラスバイアルに花の泡の一枚を置きます。 0.5ミリリットルソリューションを提供し、花の泡の上に分配するように調整を繰り返しピペッターを埋める。液体のこの量は、花の泡の部分を飽和させる必要がありますが、バイアル内の泡のレベルを超えてはならない。と最高濃度の最も低い：再び制御（水溶液のみ重量蜂蜜10重量％）から順番に働く。

2.5。保管バイアル

お問い合わせの殺虫剤2.5.1アダルトバイアル試験

殺虫剤コーティングされたバイアルを保管するときは、殺虫剤の性質を知っている。別の殺虫剤のようなさまざまなストレージ要件があります：ピレスロイドは光に敏感であり、室温で暗で保存することができますが、有機リン系殺虫剤は、温度に敏感であり、冷凍庫に保存する必要があります。殺虫剤を冷凍庫に保存する必要がある場合は、それらは昆虫を公開する前に室温まで加温している必要があります。

2.6バイオアッセイ

テスト対象の昆虫を集める。このプロセスは、フェロモン誘引トラップ、掃引ネット、または大量のキャプチャの他の手段を使用して行うことができます。この期間中に食べ物や水分の源とそれらを提供し、昆虫は、収集プロセス中に負傷者のために発生する自然死亡率を可能にするために、8 24時間保持されるべきである。濃度ごとのテスト10月25日昆虫（10最小）、テストされた昆虫の数が多いほど、より堅牢なデータセットがされます。バイオアッセイのための昆虫を選択する際には、健康な、アクティブな個人を選択し、無気力や異常な個人を捨てる。それらが一度に濃度だけでなく、1つの濃度の全範囲に露出するようバイアルの場所の昆虫。この手順は、1つまたは少数の濃度で最も健康的で活動的な人を配置することができなくなります。さらに、それは濃度あたり10昆虫の最小値と実験を行うことが可能でない場合は、各濃度になるように、できるだけ多くを公開。その後、短い時間内に同一のサンプル領域からより多くの昆虫を集める（二三週間）と実験を繰り返す。収穫期が進むにつれて、いくつかの昆虫は、（抵抗を構築）感受性を失うことができるので、春先に収集された個人の応答は、秋に²⁸に収集されたものと異なる場合があります。

死亡率を評価する基準を開発する。瀕死または死のような昆虫の分類に使用される最も一般的に使用される基準は、協調運動の欠如です。これらの観察は、1m以上優しく鈍器で採用を働きかけ、協調運動の欠如の調整飛行を維持することができない、その背面に置かれた場合自体を右にできないことを、含めることができます。個人ができる権利自体が倒れた場合、何協調運動はありません。昆虫は死んで考慮されるべきである。昆虫は、滑らかな表面上で自分自身を正すに問題が発生することがあります、それ自体が右に必要なトラクションを得ることができるように、虫の表面を供給するので、それは多分必要。の番号を記録生存者とそれぞれの濃度に対して生存率を計算するために死んだ人。

お問い合わせの殺虫剤のための2.6.1アダルトバイアル試験

バイアルに昆虫（s）を配置し、緩くキャップを固定します。蓋は、エスケープから虫を防ぐが、空気の流れを可能にするのに十分ゆるんでいる必要があります。ほとんどの昆虫バイオアッセイのために、唯一の昆虫は、それぞれのバイアルに配置されていますが、小さな昆虫、などのコナジラミやアザミウマは、バイアル^6、15％などの多くの30人の割合でさらされる可能性があります。昆虫は、バイオアッセイのエンドポイントでの死亡率のために評価が行われてまで、室温で直立バイアルを置きます。露光時間は、種および場合によっては殺虫剤^3,5-27と異なることがあります。新しい昆虫や化学物質を初期毒性レベルを確立するプロセスでは、曝露後の複数のスケジュールされた時間の点で被写体を監視します。試験はまだ非殺虫剤処理対照に高い生存率を（<10％の死亡率）を維持しながら、最高濃度で死亡率が100％であるときに終了することができます。 100％の死亡率は、コントロール内で高い生存率が最も高い濃度で達成されていない場合、バイオアッセイは、高濃度の範囲を使用して繰り返される必要があります。理想的には、死亡率のレベルは殺虫剤の濃度が増加するにつれて増加する必要があります。

いくつかの昆虫は、24時間さらされた場合、水分のソース（すなわち、植物材料の小片^）12を必要とする。繊細な昆虫を操作するとき、それは虫が大人のバイアル試験における殺虫剤の曝露前に水分のソースがなくて瓶の中で生き残ることができる期間を決定するために有益です。この情報は、水分のソースがある場合とない場合のバイアルで昆虫を配置し、実際の殺虫剤の調査を実施する前に時間が経過すると、その生存を監視することによって決定することができます。

全身殺虫剤用2.6.2修正アダルトバイアル試験

水溶液殺虫剤の存在下で：昆虫が蜜で飽和した花材の上に餌と生き残ることができればバイオアッセイの開始に先立ち、決定する。蜂蜜で飽和吸水性スポンジ付きバイアルの場所の昆虫：のみ水（または蜂蜜：非水溶性の技術的等級の殺虫剤との濃度を調製するのに使用されるアセトンの最大体積と水）と数日間生存を監視する。大人のバイアル試験のこの変更は、メクラカメムシ科⁴とカメムシ科²⁹で検討されているので、テストの期間を決定する接触殺虫剤のバイオアッセイのためのより多くの実験が必要です。例えば、Lygus lineolaris（Palisotドゥヴォーヴォは）チアメトキサムへの曝露後24時間で死亡率のために評価されたが、イミダクロプリド⁴の72時間。 Oebalus pugax F.の死亡率ジノテフラン²⁹にさらされると96時間で評価した。殺虫剤中毒からの正確な死亡率の評価を行うことができる前に、したがって、コントロールのバイアルの昆虫生存率は、数日間一貫して高い必要があります。

飽和吸水性スポンジを持つシンチレーションバイアルに昆虫（s）を置きます。代わりにふたでバイアルを密封する、コットンボールでバイアルを密封する。昆虫が死亡率のために評価されるまで、室温で直立バイアルを置きます。定期的に前述したように、速度の死亡率。コントロールの高生存率（<10％の死亡率）との最高濃度で100％の死亡率があるときに検査を終了することができます。それは追加の濃度をテストする必要があるかもしれません。

2.6.3データ解析

アボット³⁰に記載の一般式を使用してコントロール治療で死亡率を補正。

訂正死亡率（％）=（（％の生存率の制御 - ％の生存率治療）/％生存率の制御）× 100

人口の50％（LC _50）を殺すと95％信頼区間（CL）を確立するために必要な致死濃度を決定するためにログの線量プロビットを使用してデータを分析する。複数のソフトウェアプログラムは、LC _50（：PROCのPROBIT ^31、ポロプラス³² SAS）を決定するために用意されています。

3。ノート

負の流れ、空気のボンネットの下、アセトンと殺虫剤で動作。
メスフラスコに充填する際、それはアセトンの2つの洗浄ボトルを持っているのが最善です。液体と遅い配達のための一つの高速配信に適応されている一つ洗浄瓶。大きな開口部を作成するために配信アームの部分を削除し、このボトルはすぐに大量の配信に使用することができます。アセトンは、目盛線に近づくと一度、変更のボトルとあなたが分配される量をより詳細に制御を持つように、遅い配達で洗浄瓶を使用してください。フラスコは、目盛線の上に入力されている場合は、トップをオフのままにして、アセトンが目盛線に蒸発させることができます。
量旧姓に注意してください濃度を準備するために必要な、原液のDED、すなわち、あなたがフラスコ¾方法を埋めるだけ30mls追加する必要がある場合には、目盛線を介して行くことができる。

Discussion

LC ₅₀値は、ターゲット人口のベースラインの感受性（S）として確立するために使用することができます。このデータの値は、将来のモニタリング調査や対象集団の感受性を決定する以前に決定されたLC ₅₀のように現在の結果を比較するの当面の目的がシフトしたためにすることができます。実際のLC ₅₀値が95％信頼区間を調べることによって、集団間で比較することができます。上限と下限が重なっていない場合、それは人口が感受性のといくつかの状況に大きな変化を経験している可能性があります抵抗の指標である^33。 LC ₅₀秒も殺虫剤esusceptibilitye ²⁸の季節変化を調べ、または種または殺虫剤AI秒間応答を比較するために使用することができます。かなりの仕事はまた^、10または大人と未熟な段階の間に雄と雌^、10,34の間の応答を比較するためにこれらのデータを使用しています。時には、信頼区間が広くまたは計算することができません。厳密な信頼区間を得るためには、より多くの昆虫及び/またはそれ以上の濃度でアッセイを実施する。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

我々は、コットンIncorporatedの国家支援プログラム＃08 - 317MO、このパブリケーションに関連する資金調達の研究のためのUSDA / CSREES SR - IPMグラント2009-34103-20018とランディスインターナショナルに感謝します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50-100 ml glass beaker
Volumetric flask with stoppers (can use the amber colored flasks for light sensitive pesticides such as pyrethroids)
20ml glass scintillation vials with un-lined lids
A method for color coating vials (paint or markers)
Acetone
Commercial hotdog roller (heat element disconnected)
2 wash bottles (one modified such that the opening is large for fast delivery of the liquid and one so that the spout opening is small for slow delivery of the liquids)
Small weigh boat (make sure all plastic materials acetone safe)
Access to a balance with 0.001g readability or a higher precision.
Parafilm M
Repeater pipettor
Appropriate tips
Glass pipettes that fit in the volumetric flask.
Hood (used to remove the acetone smell)
A place to store insecticide solutions and vials [refrigerator (solutions), dark room or freezer depending on the chemical (vials)]