에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila 전지

Summary

바이러스 감염에 관련된 소설 호스트 요소는 기능 RNAi 심사의 셀 기반의 게놈 전체의 손실을 통해 확인할 수 있습니다.

Abstract

뿐만 아니라 바이러스는 인간의 질병의 자연적인 유행을 일으킬 수 있지만, bioterrorism 그들의 잠재적인 사용은 또한 관심사입니다, 바이러스성 병원체는 중요한 공중 보건 위협을 나타냅니다. 충격 감염이 많이 - 필요한 치료제의 개발을 용이하게한다고 세포 요인 이해. 여러 생물의 시퀀싱 전체 게놈과 함께 RNA 간섭 (RNAi) 기술의 최근 발전은 게놈 차원, 셀 기반의 손실의 기능 화면의 최적화되었다. Drosophila 세포 때문에의 게놈 규모의 화면에 특히 의무 아르 이 시스템은 ¹ RNAi의 용이성 및 효율성. 중요한 것은 바이러스의 다양한 의료 및 농업 중요성 ^2,3,4의 포유 동물 바이러스의 숫자를 포함 Drosophila 세포를 감염시킬 수 있습니다. Drosophila에서 이전 RNAi 화면 항목 번역과 RNA 복제 ⁵ 포함한 바이러스 감염의 여러 단계에 필요한 호스트 요인을 확인했습니다. 또한, Drosophila의 세포 배양에서 바이러스 복제에 필요한 세포 요인의 대부분은 이러한 바이러스 ^{4,6,7,8, 9} 감염된 인간의 세포에 제한됩니다. 따라서, 바이러스 감염 동안 공동 선택한 호스트 요인의 식별은 항바이러스 치료제에 대한 새로운 목표를 제공합니다. 여기 예로 우두 바이러스를 사용하여 바이러스 감염에 관련된 세포 요소를 식별하는 높은 처리량 RNAi 화면에 대한 일반적인 프로토콜을 제시한다.

Protocol

1 부 : 384 자 플레이트에서 RNAi

1. 검사에 사용되는 시약의 표준화가 필수적입니다. 우리는 슈나이더의 미디어의 개별 많은, 태아 소 혈청 및 얼룩의 시약을 테스트합니다. 그럼 우리가 화면 전체에 대해 동일한 많이 나누어지는하고 사용합니다.
2. 어떤 분석 들어, 읽기 밖으로 생물 학적 가장 의무가 어떤 결정하기 위해 몇 가지 다른 세포 라인을 테스트하는 것이 좋습니다. 우리는 일반적으로 S2 - DRSC 라인을 사용합니다.
3. 25 ° C 전체 슈나이더의 미디어에 Drosophila 세포를 성장.
   1. 슈나이더의 미디어
   2. 10% 열 inactivated FBS
   3. 1X L - 글루타민
   4. 1X 펜 / strep 항생제
4. Drosophila 세포는 반 자기편하며 flasks에서 세포를 pipetting하고 신선한 플라스크에 1시 10분 세포를 diluting하여 모든 사일 trypsinization없이 passaged 있습니다. 세포 실험에 대한 로그 단계에서해야합니다.
5. 판 - 투 - 플레이트와 일상적인 변화는 다중 잘 접시 모든 액체 추가에 대한 자동 액체 처리의 사용을 통해 최소화하고 있습니다. 우리는 WellMate (매트릭스)를 사용합니다.
6. WellMate 튜빙을 준비합니다.
   1. 70 % 에탄올로 스프레이 후드와 WellMate.
   2. 70 % 에탄올로 패키징과 스프레이에서 튜브를 제거합니다.
   3. WellMate에 위치를 분배에 튜브 카세트를 넣습니다.
   4. 70 % 에탄올 25 ML과 프라임 튜빙.
   5. 에탄올의 다른 25 ML과 다음 주요 15 분에 대한 에탄올의 튜빙을 소독.
   6. 멸균 PBS 50 ML과 프라이밍하여 튜빙을 씻어.
7. 술병과 카운트에서 세포를 이동시키다. 펠렛 세포가 그래서 당신은 (300xg, 5 분) 필요보다 25 % 더있다. 잘마다 씨앗을 품고 세포의 숫자는 분석 기간에 따라 최적화되어야합니다. 자동 이미지 분석을 실시하는 경우에는 셀 clumping로 단일 monolayer 이미지 세분화에 이상적입니다.
8. 1.7x10 ⁶ 셀 / ML에서 혈청 무료 슈나이더의 미디어 pelleted 세포를 Resuspend.
9. 우리는 384 잘 접시 250ng/well의 농도에 dsRNA의 상용 라이브러리로 사전 aliquoted에서 화면을 수행합니다. 각 접시의 여러 우물을 수동으로 추가하는, 컨트롤에 빈 남아 있습니다. 우리는 부정적인 제어로 루시페라제하는 dsRNA를 사용합니다. 우리는 강력한 RNAi를 제어하는​​ 등 실 (dIAP)에 대한 dsRNA를 사용합니다. 극적인 세포 죽음이 안티 apoptotic 요소 결과의 허물고 다운 노크의 품질을 평가하는 간단한 시각적 방법입니다. 마지막으로, 우리는 우리의 분석을 읽고 아웃 사용하여 바이러스 감염을 억제 수 확인하는 긍정적인 제어로,이 경우 베타 galacosidase에서 바이러스 기자에 대한 dsRNA를 사용합니다. 세포 심는 쉽게 시각화 수 있도록 잘의 모퉁이에 나누어지는 1 μl dsRNA시 판으로 dsRNA을 찾을 경우, 전지를 추가하기 전에 우물의 바닥 (300xg, 1 분)에 dsRNA를 원심 분리기.
10. 각 물론 위의 준비를 10 μL 세포를 추가할 수 WellMate 사용합니다.
11. 300xg, 1 분 centrifuging하여 접시에 세포를 스핀.
12. 45 분 동안 25 ° C 배양기에서 알을 품다.
13. 20 μL 전체 슈나이더의 미디어를 추가하고 300xg 1 분 원심 분리기.
14. humidified 유리 섬유 복합 용기에 넣어 접시 물에 젖었을 종이 타월로 늘어서. 384의 볼륨이 잘 작습니다, 따라서 증발이 차례로 가장자리 우물의 읽기 아웃에 artifactual 변화로 이어질 수있는 생물에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이것을 극복하기 위해, 접시는 높은 습도에 따라 유지되어야합니다.
15. 강력한 최저 수 있도록 사흘 동안 품어. 미디어를 변경하거나이 시간 동안 humidified 용기를 열 필요가 없습니다.

2 부 : 우두 바이러스에 감염

1. 15 분 Quatricide에 소독 멀티 채널 흡인기, 다음 70 % 에탄올로 헹굼.
2. 위에서 설명한 WellMate를 준비합니다.
3. 혈청 무료 미디어 전체 미디어 1:5 diluting에 의해 감염 2퍼센트 FBS와 슈나이더의 미디어를 준비합니다.
4. 세포 파편을 제거하거나 정화 바이러스를 사용하는 필터 0.8 음 주사기를 통해 필터 원유 바이러스 주식.
5. 2 감염의 다중성을 (뫄)을 구하는 2퍼센트 혈청 슈나이더의 미디어에 우두 바이러스를 희석.
6. WellMate 튜브에서 PBS를 제거하고, 튜브 기포가 무료 때까지 희석 바이러스와 프라임.
7. 부드럽게 dsRNA - 대우 Drosophila 세포의 접시에서 미디어를 제거하는 소독 다중 채널 흡인기 및 진공 매니폴드를 사용하십시오.
8. WellMate를 사용하여 접시에 잘 30 μL 바이러스를 분배.
9. 300xg에서 접시 1 분 원심 분리기.
10. WellMate 튜빙을 소독. 10 % 블리 25 ML과 프라임채널, 10 분 기다려야하고, 또 다른 25 ML 10 % 표백제와 프라임.
11. 50 ML의 물로 프라임 튜브 50 ML 70 % 에탄올로 따라갔다. 자사 포장 튜빙을 반환합니다.
12. humidified 유리 섬유 복합 컨테이너에 번호판을 반환합니다. 48 시간 동안 25 ° C에서 알을 품다.

파트 3 : 스테 이닝 플레이트

1. 10 분 15 μL 4 % 포름 알데히드 / PBS에 번호판을 수정. 액체는 다중 채널 흡인기 각 단계에서 진공 매니폴드를 사용하여 제거됩니다. 일단 접시는 멸균 장비가 해결되었습니다 및 시약이 더 이상 필요하지 않습니다.
2. 삭제 수정 30 μL PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X)를 추가하는 WellMate를 사용합니다. 10 분 반복 품어. 튜빙은 소독 할 필요가 없다를 제외하고 운영, 위에서 설명한 WellMate.
3. 우두 감염을 감지하기 위해 우리는 늦은 / 이른 우두업자에 의한 β - galactosidase의 기자를 사용합니다.
4. 10 분 블록에서 액체와 부화 세포를 (2 % BSA와 PBST)를 제거합니다.
5. 블록의 기본 항체를 희석, 액체를 제거하고 각 잘 멀티 채널을 사용하여 반복 pipettor (매트릭스) 15 μL 항체를 추가합니다.
6. 접시 (300xg, 1 분) 스핀 다운, 맑은 스티커로 커버 4 ° C 하룻밤에 품어.
7. 기본 항체를 제거하고, PBST 3 회 10 분 각 우물을 씻어 WellMate을 사용합니다.
8. 찬란 표시된 보조 항체 (FITC)와 블록에 얼룩이 핵을 희석하고, 다중 채널 반복 pipettor를 사용하여 우물 15 μL를 추가합니다.
9. 부화 플레이트 실온에서 1 시간, 빛으로부터 보호.
10. PBST 3 회, WellMate를 사용하여 십분 각 우물 씻으십시오.
11. 4 명확한 스티커, 커버, 그리고 저장과 번호판을 봉쇄 ° C를 3 주.

4 부 : 이미징 및 이미지 분석

1. 이미지 판에 20X 배율에서 자동 현미경을 사용합니다.
2. 총 핵 (DAPI)와 감염된 세포 (FITC)의 이미지를 캡처합니다. 동적 범위를 극대화하기 위해서는 개별적으로 각 채널에 대한 노출 시간을 최적화합니다.
3. 초점의 예상 비행기 위에서 아래 비행기에 걸쳐 이미지, 간격 간격 1um의 Z 스택을 복용하여 자동 초점 기능을 조정. 최적의 초점 비행기가있는되면, 그에 따라 자동 초점 설정을 조정합니다.
4. 이미지 전체 접시, Hoechst 채널 (DAPI)와 바이러스 채널 (FITC) 모두에 잘마다 적어도 세 이미지를 캡처. 전체적으로 잘 나타내는 이미지를 캡처하기 위해서는 잘 하나에 여러 지역에서 사이트를 선택합니다.
5. 세그먼트에 이미지를 일기를 작성하고 각 플레이트에 대한 핵 얼룩 (총 셀) 및 감염 (FITC)에 대한 긍정적인 세포의 총 수를 계산 카운트 핵 모듈을 사용하는 소프트웨어를 MetaXpress 사용합니다.
6. %의 감염 (100 * FITC 긍정 / 총 세포)을 계산하고 변환 로그인하십시오.
7. 지원자를 확인하려면 우리는 각각의 접시의 평균과 interquartile 범위를 기반으로 강력한 Z 점수를 사용합니다. 이 방법은 outliers 및 nonsymmetric 데이터를 구분하지 않습니다, 그래서 심지어는 약하거나 중간 조회수 10 식별 큰 전력을 제공합니다. 각 접시, 중간은 로그 변환된 데이터로부터 빼서 수 있습니다. 그러면 결과 값은 0.74 배 interquartile 범위 (75 ^번째 백분 위수의 가치와 25 ^번째 백분 위수 사이의 차이)로 나누어집니다. 0.74 요인은 대략적인 표준 정규 분포하는 데 사용됩니다.
8. 강력한 Z 점수는 접시의 평균으로부터 표준 편차의 거리의 측정입니다. 예를 들어, 2의 강력한 Z - 점수는 우물의 %를 감염 플레이트 평균 또는 P <0.05부터 ~ 2 표준 편차 나타냅니다.
9. 세포 독성 후보자를 식별하는 휴대폰 번호를 분석합니다. 핵 카운트의 강력한 Z 점수를 계산합니다. 중복 화면에서 강력한 Z <-2과 지원자는 세포 독성 간주됩니다.
10. 세포 독성없이 중복 화면에서> 2 또는 <-2 (P는 <0.0025)의 %의 감염에 대한 강력한 Z 점수를 웰스는 기본 화면에서 잠재적인 후보로 간주됩니다.
11. 긍정적인 후보자는 독립적인 시약을 사용하여 확인됩니다. dsRNAs는 mRNA의 다른 지역에서 관심의 유전자에 대한 생성하고 위와 같이 테스트합니다.
12. 두 개의 독립적인 dsRNAs 같은 표현형을 가지고있는 이들 유전자들은 진학 간주될 수 있습니다.

제 5 부 : 대표 이미지와 감염률의 해석

잘 감염 대리인으로 immunofluorescence 현미경으로 측정 우두 - 표현 베타 galactosidase (βgal) 단백질에 대한 긍정적인 얼룩 세포를 포함하는 동안 그림 1. 감염되지 않은 우물은 우두 바이러스 단백질에 대한 얼룩을 표시하지 않습니다.바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색.

그림 2. 자동 이미지 분석 소프트웨어는 사용자가 설정한 매개 변수를 사용하여 각 이미지에 감염을 단정. 대표 이미지, 세포 핵 및 바이러스 항원을 표현하는 세포의 수를의 총 숫자는 크기와 지역 배경 위에 얼룩 얼룩의 강도에 따라 계산됩니다.

그림 3. 스레드 (dIAP)의 분해는 대상 유전자의 강력한 RNAi 고갈에 대한 긍정적인 제어 역할을합니다. 이 안티 apoptotic 요소의 최저는 극적인 세포 사망에 이르게한다. 핵 = 파란색.

루시페라제 그림 4. 최저 감염을 두 번 좌초 RNA 치료의 효과에 대해 부정적인 제어 역할을합니다. 루시페라제의 고갈은 치료 왼쪽 세포에 상대적인 감염에 아무런 영향을 미치지 않습니다. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색.

가 감염 밖 읽은 상태로 분석이 βgal 단백질 수준을 사용하고 있기 때문에 그림 5. βgal 단백질의 분해는, 감염의 감소에 대한 긍정적인 제어 역할을합니다. 감염된 세포의 비율에있는 감소 βgal 결과의 고갈. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색.

그림 6. 감염된 세포의 비율에있는 감소에 휴대 요소 Rab5 결과 최저. Rab5가 endocytosis에 참여하는 것으로 알려져 있기 때문에,이 요소는 가능성이 우두 바이러스 항목에 기여하고 있습니다. 이 화면에서 예제 국외자를 나타냅니다. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색.

Discussion

Drosophila의 게놈 - 광범위한 RNAi 검사는 바이러스 감염의 세포 구성 요소를 검토를위한 강력하고 효율적인 방법을 제공합니다. 포유 동물 바이러스의 숫자는 호스트 본질적인 면역 반응의 구성 요소, 그리고 새로운 치료 목표를 나타내는 수 있습니다 바이러스 복제에 필요한 호스트 단백질 요소를 식별하는 데 사용할 수있는 Drosophila 세포를 감염. 화면을 수행하기 전에 분석은 신중하게 셀 타입, 휴대폰 번호, 그리고 감염 수준에 최적화된해야하며, 잘 ¹¹ 긍정적이고 부정적인 바이러스와 세포의 목표를 ​​모두 포함 제어해야합니다. 분석의 동적 범위를 극대화하기 전에 검사하는 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이에 충분한 간격을 확보하는 것이 중요합니다. 화면이 수행되면 후보자는 호스트 메커니즘이 감염에 기여하는 결정하기 위해 기능적 범주로 나눌 수 있습니다. 같은 우두와 같은 포유 동물의 바이러스 예방 프로그램으로, RNAi의 포유 동물 homologs의 기여는 이차 분석의 일부로 결정되어야합니다. 함께 촬영이 강력한 심사 방법은 우리가 바이러스가 자신의 호스트 세포와 상호 작용하는 복잡한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
Schneider’s media	GIBCO, by Life Technologies	11720
GlutaMAX 100X	GIBCO, by Life Technologies	35050
Penicillin/streptomycin (pen/strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F6178
Screening
Genome-wide dsRNA library	Ambion
384 well plates, black with clear bottom	Corning	3712
Aluminum seals	Corning	6569
Clear seals	Denville Scientific	B1212-4
Well Mate	Matlab	201-10001
24 pin manifold	Drummond Scientific	3-000-101
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Fluorescently-labeled secondary antibodies	Invitrogen
ImageXpressMicro automated microscope	Molecular Devices
MetaXpress image analysis software	Molecular Devices