Summary
ويمكن تحديد العوامل المضيفة المشاركة في رواية عدوى فيروسية من خلال فقدان الجينوم على نطاق خلية مقرها الفحص رني الدالة. A
Abstract
مسببات الأمراض الفيروسية وتمثل تهديدا كبيرا الصحة العامة ، ليس فقط يمكن أن الفيروسات التي تسبب الأوبئة الطبيعية من الأمراض التي تصيب البشر ، ولكن احتمال استخدامها في الإرهاب البيولوجي هو أيضا مصدر قلق. فهم أفضل للعوامل العدوى الخلوية التي أثر من شأنه أن يسهل تطوير العلاجات التي تشتد الحاجة إليها. وقد أدت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الحمض النووي الريبي (رني) التدخل إلى جانب تسلسل الجينوم الكامل عدة من الكائنات الحية على الاستفادة المثلى من الجينوم على نطاق خلية مقرها الخسارة من وظيفة الشاشات. ذبابة الفاكهة خلايا قابلة خاصة إلى الجينوم النطاق بسبب الشاشات سهولة وكفاءة رني في هذا النظام 1. الأهم من ذلك ، يمكن لمجموعة واسعة من فيروسات تصيب خلايا ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك عدد من الفيروسات الثدييات ذات الأهمية الطبية والزراعية 2،3،4. وقد حددت السابقة شاشات رني في ذبابة الفاكهة العوامل المضيفة التي مطلوبة من أجل الخطوات المختلفة في عدوى الفيروس بما في ذلك الدخول ، والترجمة والنسخ RNA 5. وعلاوة على ذلك ، فإن العديد من العوامل الخلوية اللازمة لتكاثر الفيروس في الخلية ثقافة ذبابة الفاكهة تحد أيضا في الخلايا البشرية المصابة بتلك الفيروسات 4،6،7،8 ، 9. ولذلك ، وتحديد العوامل المضيفة يختارهم خلال عدوى فيروسية يعرض أهدافا جديدة لعلاجات مضادة للفيروسات. هنا نقدم بروتوكول معمم للشاشة رني الإنتاجية العالية لتحديد العوامل الخلوية العاملة في العدوى الفيروسية ، وذلك باستخدام فيروس الوقس كمثال على ذلك.
Protocol
الجزء 1 : [رني في 384 لوحات حسنا
- توحيد الكواشف المستخدمة لفحص ضروري. نحن اختبار الكثير من وسائل الإعلام الفردية شنايدر ، ومصل بقري جنيني ، والكواشف تلطيخ. ثم نحن قسامة واستخدام الكثير عن نفس الشاشة بأكملها.
- عن أي تجربة ، فمن الأفضل لاختبار عدة خطوط مختلفة لتحديد الخلية التي هي الأكثر قابلية لقراءة البيولوجي الخاص التدريجي. نحن عادة استخدام خط S2 - DRSC.
- زراعة خلايا ذبابة الفاكهة في درجة حرارة 25 درجة مئوية في وسائل الإعلام لاستكمال شنايدر.
- شنايدر وسائل الاعلام
- 10 ٪ FBS الحرارة المعطل
- L - 1X الجلوتامين
- 1X القلم / بكتيريا المضادات الحيوية
- خلايا ذبابة الفاكهة شبه ملتصقة وpassaged دون trypsinization كل أربعة أيام من قبل pipetting الخلايا قبالة قوارير وتمييع الخلايا 01:10 في قارورة جديدة. وينبغي أن يكون في مرحلة الخلايا سجل للتجارب.
- يتم تصغير لوحة إلى لوحة وتقلب يوما بعد يوم من خلال استخدام السائل التعامل الآلي لجميع الإضافات السائلة إلى جانب لوحات متعددة. نستخدم WellMate (ماتريكس).
- إعداد أنابيب WellMate.
- رذاذ مع غطاء المحرك وWellMate الايثانول 70 ٪.
- إزالة التغليف وأنابيب من رذاذ مع الايثانول 70 ٪.
- إدراج الكاسيت أنابيب في الاستغناء عن موقف بشأن WellMate.
- رئيس الأنابيب مع 25 مل من الايثانول 70 ٪.
- تعقيم أنابيب في الايثانول لمدة 15 دقائق ، ثم مع رئيس الوزراء آخر 25 مل من الايثانول.
- شطف الأنابيب بواسطة فتيلة مع 50 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- إزاحة الخلايا من القارورة والعد. بيليه الخلايا بحيث يكون لديك 25 ٪ أكثر من اللازم (300xg ، 5 دقائق). يجب أن يكون الأمثل لعدد من الخلايا في المصنف وفقا لطول جيدا مقايسة. عند إجراء التحليل الآلي صورة ، وأحادي الطبقة واحدة مع أي تكتل خلية مثالية للتجزئة الصورة.
- Resuspend مكعبات الخلايا في وسائل الإعلام شنايدر المصل الحرة في الخلايا 1.7x10 6 / مليلتر.
- نقوم الشاشة في 384 لوحات جيدا قبل aliquoted مع مكتبة المتاحة تجاريا من الرنا المزدوج الجديلة في تركيز 250ng/well. وغادر العديد من الآبار في كل لوحة فارغة للضوابط التي تمت إضافتها يدويا. نستخدمها لالرنا المزدوج الجديلة luciferase كعنصر تحكم سلبية. نحن ضد استخدام الرنا المزدوج الجديلة الموضوع (dIAP) كعنصر تحكم عن رني قوية. نهدم هذه النتائج المضادة للعامل في موت الخلايا أفكارك الدرامية والبصرية وسيلة سريعة لتقييم جودة نهدم. أخيرا ، ونحن ضد استخدام الرنا المزدوج الجديلة مراسل الفيروسية ، في هذه الحالة بيتا galacosidase ، كعنصر تحكم إيجابية للتحقق من أننا يمكن أن يمنع العدوى الفيروسية باستخدام مقايسة لدينا قراءة شاملة. إذا الرنا المزدوج الجديلة في اكتشاف لوحة في وقت البذر الخلية ، قسامة 1 ميكرولتر الرنا المزدوج الجديلة في الزاوية من البئر للسماح لسهولة التصور ، ثم الطرد المركزي الرنا المزدوج الجديلة على الجزء السفلي من بئر (300xg ، 1 دقيقة) قبل ان يضيف الخلايا.
- WellMate استخدام الخلايا لإضافة 10 ميكرولتر أعلاه لإعداد كل بئر.
- تدور على لوحات الخلايا بواسطة الطرد المركزي 300xg ، 1 دقيقة.
- احتضان حاضنة في 25 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- إضافة 20 ميكرولتر كاملة شنايدر وسائل الإعلام وأجهزة الطرد المركزي 300xg ، 1 دقيقة.
- واصطف لوحات مكان في حاويات تثبرور ترطيب مع مناشف ورقية مبللة بالماء. حجم من 384 على ما يرام الصغيرة ، وبالتالي ، يمكن أن يكون لها آثار التبخر كبير على علم الأحياء ، والتي بدورها يمكن أن تؤدي إلى تغييرات مصطنعة في الرافضة للقراءة من الآبار الحافة. للتغلب على هذا ، ينبغي الحفاظ على لوحات تحت رطوبة عالية.
- احتضان لمدة ثلاثة أيام للسماح للضربة قاضية قوية. ليست هناك حاجة لتغيير وسائل الإعلام أو فتح الحاويات ترطيب خلال هذا الوقت.
الجزء 2 : اصابة بفيروس الوقس
- تعقيم متعدد القنوات الشافطة في Quatricide لمدة 15 دقيقة ، ثم يشطف في الايثانول 70 ٪.
- إعداد WellMate كما هو موضح أعلاه.
- إعداد وسائل الاعلام مع شنايدر FBS 2 ٪ للعدوى عن طريق تمييع 01:05 الإعلامية الكاملة في وسائل الإعلام الحرة المصل.
- تصفية مخزون الخام الفيروس عن طريق حقنة 0.8 ميكرون فلتر لإزالة الحطام الخلوي أو استخدام فيروس المنقى.
- الوقس فيروس مخفف في وسائل الاعلام المصل شنايدر 2 ٪ للحصول على تعدد العدوى (وزارة الداخلية) 2.
- إزالة برنامج تلفزيوني من أنابيب WellMate ، ورئيس الوزراء مع الفيروس المخفف حتى الأنابيب خالية من فقاعات الهواء.
- استخدام معقم متعدد القنوات المتعددة الشافطة والفراغ لإزالة بلطف وسائل الاعلام من لوحات خلايا ذبابة الفاكهة الرنا المزدوج الجديلة المعاملة.
- الاستغناء عن 30 ميكرولتر الفيروس لكل بئر على لوحات باستخدام WellMate.
- ألواح الطرد المركزي في 300xg 1 دقيقة.
- تعقيم أنابيب WellMate. رئيس الوزراء مع 25 مل من 10 ٪ bleaالفصل ، وانتظر 10 دقائق ، ورئيس آخر التبييض مع 25 مل من 10 ٪.
- يتبع مع رئيس الوزراء أنابيب المياه التي كتبها مل 50 مل ايثانول 50 70 ٪. عودة إلى أنابيب عبوتها.
- عودة إلى حاوية لوحات تثبرور مرطب. في احتضان 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
الجزء 3 : لوحات يلطخ
- الإصلاح في لوحات الفورمالديهايد ميكرولتر 15 4 ٪ / برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. تتم إزالة السائل باستخدام الشافطة متعدد القنوات ومتعدد الجوانب فراغ في كل خطوة. مرة واحدة وقد تم إصلاح لوحات ، والمعدات والكواشف عقيمة لم تعد ضرورية.
- إزالة الإصلاح واستخدام WellMate لإضافة 30 PBST ميكرولتر (PBS + 0.1 ٪ تريتون - X). احتضان 10 دقائق ، وتكرار. WellMate تعمل على النحو الموصوف أعلاه ، باستثناء الأنابيب لا تحتاج إلى أن تكون معقمة.
- للكشف عن عدوى الوقس نستخدم مراسل β - غالاكتوزيداز يقودها المروج الوقس المبكر / في وقت متأخر.
- إزالة خلايا السائل واحتضان في كتلة (BSA PBST مع 2 ٪) لمدة 10 دقيقة.
- تمييع الضد الأولية في كتلة ، وإزالة السائل واضافة 15 الضد لكل ميكرولتر pipettor تكرار جيدا باستخدام قناة المتعددة (مصفوفة).
- تدور باستمرار لوحات (300xg ، 1 دقيقة) ، مع تغطية لاصق واضحة ، واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية ، واستخدام WellMate لغسل الآبار في 3 مرات PBST ، 10 دقيقة لكل منهما.
- تمييع الضد الثانوية fluorescently المسمى (FITC) والنووية وصمة عار في كتلة ، وإضافة 15 ميكرولتر من الآبار باستخدام تكرار متعددة القنوات pipettor.
- لوحات احتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ومحمية من الضوء.
- غسل الآبار في 3 مرات PBST و 10 دقيقة باستخدام كل WellMate.
- ختم اللوحة مع ملصقا واضحا ، والغطاء ، وتخزينها في 4 تصل إلى ثلاثة أسابيع درجة مئوية.
الجزء 4 : التصوير وتحليل الصور
- استخدام المجهر الآلي في 20X التكبير لوحات الصور.
- التقاط الصور من نوى مجموع (دابي) والخلايا المصابة (FITC). تحسين زمن التعرض لكل قناة على حدة من أجل تعظيم المدى الديناميكي.
- ضبط وظيفة التركيز الآلي من خلال اتخاذ Z كومة من الصور ، 1um متباعدة عن بعضها ، التي تمتد على الطائرات فوق وتحت الطائرة المتوقعة من التركيز. مرة واحدة تقع الطائرة الأمثل التنسيق ، ضبط إعدادات ضبط تلقائي تبعا لذلك.
- صورة طبق بالكامل ، واستولت على ما لا يقل عن ثلاث صور لكل بئر في كل قناة من هويشت (دابي) وقناة (فيروس FITC). اختيار مواقع عدة من مناطق مختلفة داخل بئر واحدة من أجل التقاط الصور التي تمثل أيضا ككل.
- استخدام البرمجيات MetaXpress لكتابة الجزء المجلة إلى الصورة واستخدام وحدات النواة الاحصاء لحساب عدد الخلايا إيجابية لتلطيخ النووية (خلايا الكلية) والعدوى (FITC) لكل لوحة.
- حساب العدوى في المئة (100 * خلايا FITC الايجابية / الاجمالية) وسجل التحويل.
- لتحديد المرشحين نستخدم علامة Z قوية تستند إلى مجموعة من الشرائح الربعية وسيطة كل لوحة. هذا الأسلوب غير حساس لnonsymmetric القيم المتطرفة والبيانات ، ويوفر بالتالي قدرة أكبر في تحديد يضرب حتى ضعيفة أو متوسطة 10. لكل لوحة ، وطرح الوسيط من بيانات السجل - المتحول. ثم تنقسم القيم الناتجة بمقدار 0.74 مرات من مجموعة الشرائح الربعية (الفرق بين قيم المئين ال 75 والمئين ال 25). يتم استخدام عامل للتوزيع 0.74 القياسية التقريبية طبيعية.
- النتيجة Z القوي هو قياس المسافة في الانحرافات المعيارية من وسيطة من لوحة. على سبيل المثال ، قوية Z - 2 درجة يشير الى اصابة ٪ من البئر ~ 2 من الانحرافات المعيارية وسيطة لوحة أو p <0.05.
- تحليل عدد الخلايا لتحديد المرشحين السامة للخلايا. حساب النتيجة Z قوية من التهم النووية. ويعتبر مرشحا قويا مع -2 <Z في شاشات مكررة السامة للخلايا.
- تعتبر الآبار التي تحتوي على درجة Z قوية لعدوى في المئة من> 2 أو <-2 في شاشات مكررة (P <0.0025) من دون السمسة المرشحين المحتملين من الشاشة الرئيسية.
- يتم التحقق من صحة المرشحين ايجابية باستخدام الكواشف مستقلة. تتولد dsRNAs ضد الجينات من الاهتمام من منطقة أخرى من مرنا واختبارها على النحو الوارد أعلاه.
- ويمكن اعتبار تلك الجينات التي اثنين من لdsRNAs مستقلة لها نفس النمط الظاهري لمزيد من الدراسة.
الجزء 5 : صور الممثل وتفسير معدلات الإصابة
الشكل 1. الآبار غير مصاب لا تظهر أي تلطيخ للبروتينات الفيروس الوقس ، في حين أن ممثل جيد يحتوي على خلايا مصابة إيجابية لتلطيخ الوقس - أعرب البروتين (βgal) بيتا غالاكتوزيداز ، مقاسا المجهري المناعي.فيروس = الأخضر ، الأزرق = نوى.
الشكل 2. الآلي برامج التحليل الكمي صورة العدوى في كل صورة باستخدام المعايير المحددة من قبل المستخدم. في صورة تمثيلية ، يتم حساب إجمالي عدد نواة الخلية وعدد الخلايا معربا عن مستضد الفيروسية استنادا إلى حجم وكثافة تلوين فوق تلوين الخلفية المحلية.
الشكل 3. ضربة قاضية من الصفحات (dIAP) بمثابة سيطرة إيجابية للنضوب رني قوية من الجينات المستهدفة. ضربة قاضية لهذا العامل المضادة للمبرمج يؤدي الى موت الخلايا دراماتيكية. النوى = زرقاء.
الشكل 4. ضربة قاضية للluciferase بمثابة السيطرة السلبية لتأثير العلاج RNA المزدوج تقطعت بهم السبل على العدوى. نضوب luciferase له أي تأثير على العدوى إلى الخلايا النسبية ترك دون علاج. فيروس = الأخضر ، الأزرق = نوى.
الشكل 5. ضربة قاضية للبروتين βgal بمثابة مراقبة إيجابية لخفض العدوى ، ويستخدم منذ مقايسة مستويات البروتين βgal باعتبارها تلا العدوى. نضوب βgal النتائج إلى انخفاض في نسبة الخلايا المصابة. فيروس = الأخضر ، الأزرق = نوى.
الشكل 6. ضربة قاضية للالخلوية النتائج Rab5 عاملا في حدوث انخفاض في نسبة الخلايا المصابة. ومن المعروف منذ Rab5 للمشاركة في الإلتقام ، وهذا عامل من المرجح أن يساهم دخول الفيروس الوقس. هذا يمثل قيمة عزلاء المثال من الشاشة. فيروس = الأخضر ، الأزرق = نوى.
Discussion
الجينوم على نطاق رني الفرز في ذبابة الفاكهة يوفر طريقة قوية وفعالة للنظر في المكون الخلوية من عدوى فيروسية. وهناك عدد من فيروسات تصيب خلايا الثدييات ذبابة الفاكهة ، والتي يمكن استخدامها لتحديد مكونات استجابة المضيف المناعية الذاتية ، والعوامل اللازمة لاستضافة البروتين تكاثر الفيروس التي قد تمثل أهداف علاجية جديدة. قبل تنفيذ الشاشة ، يجب أن يكون الفحص الأمثل بعناية لنوع من الخلايا ، وعدد الخلايا ، ومستوى الإصابة ، ويجب أن تسيطر عليها بشكل جيد ، بما في ذلك سواء كانت إيجابية أو سلبية الفيروسية والأهداف الخلوية 11. فمن المهم لضمان ما يكفي من الفصل بين الضوابط الإيجابية والسلبية قبل الفرز لزيادة النطاق الديناميكي للمقايسة. مرة واحدة وقد تم تنفيذ الشاشة ، ويمكن تقسيمها إلى فئات وظيفية المرشحين لتحديد الآليات التي تسهم في إصابة المضيف. للبحث عن الفيروسات مثل الثدييات الوقس ، ينبغي تحديد مساهمة homologs الثدييات التي كتبها رني كجزء من التحليل الثانوية. أخذت معا ، وهذه طرق الفحص قوية تسمح لنا لاكتساب نظرة ثاقبة الآليات المعقدة التي تتفاعل مع خلايا الفيروسات التي تستضيفهم.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من NIAID (R01AI074951 ، U54AI057168) والجينوم بن حدود معهد لSC ؛ من المعاهد الوطنية للصحة لT32HG000046 TSM ؛ من المعاهد الوطنية للصحة وT32GM07229 T32AI007324 لLRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Schneider’s media | GIBCO, by Life Technologies | 11720 | |
| GlutaMAX 100X | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| Screening | |||
| Genome-wide dsRNA library | Ambion | ||
| 384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | |
| Aluminum seals | Corning | 6569 | |
| Clear seals | Denville Scientific | B1212-4 | |
| Well Mate | Matlab | 201-10001 | |
| 24 pin manifold | Drummond Scientific | 3-000-101 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | ||
| ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | ||
| MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |
References
- Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells. Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).
- Chotkowski, H. L. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication. J Virol. 62, 277-284 (1988).
- Sessions, O. M. Discovery of insect and human dengue virus host factors. Nature. 458, 1047-1050 (2009).
- Cherry, S. Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions? Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).
- Hao, L. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Cherry, S. COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication. PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).
- Cherry, S. Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition. Genes Dev. 19, 445-452 (2005).
- Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics. PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).
