Summary
Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening. Een
Abstract
Virale pathogenen vormen een belangrijke bedreiging voor de volksgezondheid, niet alleen virussen veroorzaken natuurlijke epidemieën van ziekten bij mensen, maar hun potentieel gebruik in bioterrorisme is ook een punt van zorg. Een beter begrip van de cellulaire factoren die van invloed infectie zou de ontwikkeling van de broodnodige therapeutica te vergemakkelijken. Recente ontwikkelingen in de RNA-interferentie (RNAi) technologie in combinatie met volledige genoom sequentie van verschillende organismen heeft geleid tot het optimaliseren van genoom-brede, cel-gebaseerde verlies-van-functie-schermen. Drosophila-cellen zijn bijzonder ontvankelijk voor genoom-schaal schermen omwille van de het gemak en de efficiëntie van RNAi in dit systeem een. Belangrijker is, kan een breed scala van virussen infecteren Drosophila cellen, waaronder een aantal van zoogdieren virussen van medische en agrarische belang 2,3,4. Vorige RNAi schermen in Drosophila hebben geïdentificeerd gastheer factoren die nodig zijn voor verschillende stappen in een virusinfectie waaronder de entry-, vertaal-en RNA-replicatie 5. Bovendien worden veel van de cellulaire factoren die nodig zijn voor virale replicatie in Drosophila celkweek ook het beperken van in menselijke cellen geïnfecteerd met deze virussen 4,6,7,8, 9. Daarom is de identificatie van de gastheer factoren gecoöpteerde gedurende virus infectie presenteert nieuwe doelen voor antivirale therapeutica. Hier presenteren we een algemeen protocol voor een high-throughput RNAi scherm om cellulaire factoren die betrokken zijn bij virale infecties te identificeren, met behulp van vaccinia-virus als een voorbeeld.
Protocol
Deel 1: RNAi in 384 putjes
- Standaardisatie van de reagentia worden gebruikt voor screening is essentieel. We testen de afzonderlijke partijen van Schneiders media, foetaal runderserum, en kleurstoffen. Dan gaan we aliquot en gebruiken dezelfde partij voor het hele scherm.
- Voor elke test, is het het beste om te testen verschillende cellijnen om te bepalen welke het meest vatbaar is voor je biologische lezen-out. Wij gebruiken meestal de S2-DRSC lijn.
- Grow Drosophila-cellen bij 25 ° C in complete Schneider media.
- Schneider's media
- 10% door warmte geïnactiveerd FBS
- 1X L-glutamine
- 1X Pen / STREP antibiotica
- Drosophila cellen zijn semi-aanhanger en zijn gepasseerd zonder behandeling met trypsine om de vier dagen door pipetteren de cellen uit de kolven en verdunnen van de cellen 1:10 in een verse fles. De cellen moeten worden in te loggen fase voor experimenten.
- Plate-to-plate en dag-tot-dag variabiliteit worden geminimaliseerd door het gebruik van geautomatiseerde liquid handling voor alle vloeibare toevoegingen aan multi-well platen. We maken gebruik van een WellMate (Matrix).
- Bereid WellMate slang.
- Buiskap en WellMate met 70% ethanol.
- Verwijder de slang uit de verpakking en spray met 70% ethanol.
- Plaats de buis cassette in de verstrekking plaats op de WellMate.
- Prime buis met 25 ml 70% ethanol.
- Steriliseer buizen in ethanol gedurende 15 minuten, dan eerste met een andere 25 ml ethanol.
- Spoel leidingen door priming met 50 ml steriele PBS.
- Los cellen van kolf en tellen. Pellet cellen zodat je 25% meer dan nodig (300xg, 5 min). Het aantal cellen gezaaid per goed moet worden geoptimaliseerd volgens de test lengte. Bij de uitvoering van automatische beeldanalyse, een monolaag met geen cel klonteren is ideaal voor het imago van segmentatie.
- Resuspendeer gepelleteerd cellen in serum-vrij Schneider media op 1.7x10 6 cellen / ml.
- Wij voeren het scherm in 384 putjes pre-hoeveelheden verdeeld met een commercieel verkrijgbaar bibliotheek van dsRNA bij een concentratie van 250ng/well. Verschillende putten van elke plaat zijn leeg voor de controle, die handmatig worden toegevoegd. We maken gebruik van dsRNA om luciferase als een negatieve controle. We maken gebruik van dsRNA tegen Thread (DIAP) als een controle voor robuuste RNAi. Neerhalen van deze anti-apoptotische factor resulteert in een dramatische celdood en is een snelle visuele manier om de kwaliteit van de knock down te beoordelen. Tot slot maken we gebruik van een dsRNA tegen de virale verslaggever, in dit geval beta-galacosidase, als een positieve controle om te controleren of we kunnen virale infectie met behulp van onze test read-out te remmen. Als het spotten van dsRNA in plaat op het moment van zaaien cel, aliquot 1 ui dsRNA in de hoek van de goed te zorgen voor gemakkelijker visualisatie, centrifugeer dsRNA op bodem van goed (300xg, 1 min) voor het toevoegen van cellen.
- Gebruik WellMate tot 10 pi cellen boven bereid aan elk putje toe te voegen.
- Spin-cellen op platen door centrifugeren 300xg, een min.
- Incubeer in 25 ° C incubator gedurende 45 minuten.
- Voeg 20 pi compleet Schneider media en centrifuge 300xg, een min.
- Plaats platen in bevochtigd Tupperware containers vol met water doordrenkte papieren handdoeken. Het volume van een 384 is goed klein, dus verdamping kan grote gevolgen hebben voor de biologie, die op hun beurt kunnen leiden tot artefactuele veranderingen in de read-outs van de rand putten. Om dit, moeten borden worden gehandhaafd onder hoge luchtvochtigheid.
- Incubeer gedurende drie dagen te laten voor robuuste knockdown. Het is niet nodig om de media te wijzigen of open vochtige containers gedurende deze tijd.
Deel 2: infecteren met vaccinia virus
- Steriliseer multi-channel aspirator in Quatricide gedurende 15 minuten, spoel dan in 70% ethanol.
- Bereid WellMate zoals hierboven beschreven.
- Bereid Schneider media met 2% FBS voor infectie door verdunning complete media 01:05 in serum vrije media.
- Filter ruwe virus bouillon door 0,8 um spuit filter om cellulaire puin te verwijderen of gezuiverd virus te gebruiken.
- Verdunnen vaccinia virus in 2% serum van Schneider media om multipliciteit van infectie (MOI) te verkrijgen van 2.
- Verwijder de PBS uit WellMate slangen, en eerste met verdund virus totdat de slang is vrij van luchtbellen.
- Gebruik gesteriliseerd multi-channel aspirator en vacuüm manifold om voorzichtig materiaal uit de platen van dsRNA-behandelde Drosophila cellen.
- Verdeel 30 ul virus per putje op platen met behulp van de WellMate.
- Centrifuge platen 1 minuut bij 300xg.
- Steriliseren WellMate slang. Prime met 25 ml van 10% bleach, wacht 10 minuten, en eerste met een andere 25 ml 10% bleekwater.
- Prime buis met 50 ml water, gevolgd door 50 ml 70% ethanol. Keer terug slang aan op de verpakking.
- Keer terug platen om bevochtigd Tupperware container. Incubeer bij 25 ° C gedurende 48 uur.
Deel 3: Beitsen Platen
- Fix platen in 15 ui 4% formaldehyde / PBS gedurende 10 minuten. Vloeistof wordt verwijderd met behulp van een multi-channel aspirator en vacuum spruitstuk bij elke stap. Zodra platen zijn opgelost, steriele apparatuur en reagentia zijn niet langer nodig.
- Verwijder de fix en gebruiken WellMate tot 30 pi PBST (PBS + 0,1% Triton-X) toe te voegen. Incubeer 10 minuten en herhaal. Bedien WellMate zoals hierboven beschreven, behalve slangen hoeft niet te worden gesteriliseerd.
- Voor het detecteren van vaccinia infectie we gebruik van een β-galactosidase reporter aangedreven door een vroege / late vaccinia promotor.
- Verwijder de vloeistof en incubeer cellen in blok (PBST met 2% BSA) voor 10 minuten.
- Verdunnen primair antilichaam in blok, vloeibare en voeg 15 ul antilichaam aan elk putje met behulp van een multi-channel herhalen pipet (Matrix).
- Spin down platen (300xg, 1 min), bedekken met een duidelijke sticker, en incuberen bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Verwijderen primair antilichaam, en gebruik de WellMate om putten te wassen in PBST 3 keer, 10 minuten elk.
- Verdunnen fluorescent gelabelde secundaire antilichaam (FITC) en nucleaire vlek in blok, en voeg 15 ul naar putten met behulp van een multi-channel te herhalen pipet.
- Incubeer de platen 1 uur bij omgevingstemperatuur, beschermd tegen licht.
- Was de putjes in PBST 3 maal, op 10 minuten met behulp van de WellMate.
- Seal plaat met duidelijke sticker, te dekken, en bewaar bij 4 ° C tot drie weken.
Deel 4: Imaging en beeldanalyse
- Gebruik een geautomatiseerde microscoop bij een vergroting van 20x om de afbeelding te platen.
- Maak foto's van het totaal kernen (DAPI) en geïnfecteerde cellen (FITC). Optimaliseer belichtingstijd voor elk kanaal afzonderlijk in om dynamisch bereik te maximaliseren.
- Fine-tunen van de automatische scherpstelling functie door het nemen van een Z-stack van beelden, uit elkaar 1um uit elkaar, dat de vliegtuigen overspanning boven en onder het verwachte niveau van focus. Zodra de optimale focal plane is gevestigd, dienovereenkomstig aan te passen autofocus-instellingen.
- Het imago van de hele plaat, het vastleggen van ten minste drie beelden per goed in zowel de Hoechst kanaal (DAPI) en het virus kanaal (FITC). Kies sites uit verschillende regio's binnen een goed om te beelden die de goed vertegenwoordigen in zijn geheel vast te leggen.
- Gebruik MetaXpress software om een dagboek te schrijven segment het imago en de graaf Kernen modules te gebruiken om het totaal aantal cellen positief voor nucleaire kleuring (totaal cellen) en infectie (FITC) voor elke plaat te berekenen.
- Bereken procent infectie (100 * FITC positief / totaal cellen) en log te transformeren.
- Het identificeren van de kandidaten wij gebruik van een robuuste Z-score op basis van de mediaan en de interkwartielafstand van elke plaat. Deze methode is ongevoelig voor uitschieters en nonsymmetric data, en dus biedt meer kracht bij het identificeren van zelfs zwakke of matige hits 10. Voor elke plaat, is de mediaan afgetrokken van de log-getransformeerde data. Dan is de resulterende waarden worden gedeeld door 0.74 maal de interkwartielafstand (het verschil tussen de waarden van de 75 ste percentiel en het 25 e percentiel). De 0,74-factor wordt gebruikt om bij benadering een standaard normale verdeling.
- De robuuste Z-score is een maat voor de afstand in standaard afwijkingen van de mediaan van de plaat. Bijvoorbeeld, een robuuste Z-score van 2% geeft aan dat de infectie van de put is ~ 2 standaarddeviaties van de plaat mediaan of p <0,05.
- Analyseer aantal cellen voor cytotoxische kandidaten te identificeren. Bereken de robuuste Z-score van de nucleaire telt. Kandidaten met een robuuste Z <-2 in tweevoud schermen worden beschouwd als cytotoxisch.
- Wells dat een robuuste Z-score voor percentage infectie van> 2 of <-2 in tweevoud schermen (p <0,0025) hebben zonder cytotoxiciteit worden beschouwd als potentiële kandidaten uit het primaire scherm.
- Positieve kandidaten zijn gevalideerd met behulp van onafhankelijke reagentia. dsRNA's worden gegenereerd tegen de genen van belang uit een andere regio van het mRNA en getest zoals hierboven.
- Die genen die op een onafhankelijke dsRNA's hebben hetzelfde fenotype kan worden beschouwd voor verdere studie.
Deel 5: Representatieve beelden en interpretatie van infecties
Figuur 1. Geïnfecteerde putten vertonen geen kleuring voor vaccinia virus eiwitten, terwijl een vertegenwoordiger van zowel geïnfecteerde cellen bevat kleuren positief voor vaccinia-uitgedrukt beta-galactosidase (βgal) eiwit, zoals gemeten door immunofluorescentie microscopie.Virus = groen, kernen = blauw.
Figuur 2. Geautomatiseerde beeldanalyse-software kwantificeert infectie in elk beeld met behulp van parameters die door de gebruiker. In een representatief beeld, wordt het totale aantal van de celkernen en het aantal cellen die virale antigenen geteld op basis van grootte en de intensiteit van vlekken boven de lokale achtergrondkleuring.
Figuur 3. Knockdown van de draad (DIAP) dient als een positieve controle voor robuuste RNAi uitputting van target genen. Knockdown van deze anti-apoptotische factor leidt tot een dramatische celdood. Kernen = blauw.
Figuur 4. Knockdown van luciferase fungeert als een negatieve controle voor het effect van de double-stranded RNA-behandeling op infectie. Uitputting van luciferase heeft geen effect op infecties in verhouding tot cellen onbehandeld. Virus = groen, kernen = blauw.
Figuur 5. Knockdown van βgal eiwit dient als een positieve controle voor een vermindering van de infectie, omdat de test maakt gebruik van βgal eiwit niveau als een uitlezing van infectie. Uitputting van βgal leidt tot een afname van het percentage van geïnfecteerde cellen. Virus = groen, kernen = blauw.
Figuur 6. Knockdown van cellulaire factor Rab5 leidt tot een afname van het percentage van geïnfecteerde cellen. Omdat Rab5 is bekend om deel te nemen in endocytose, deze factor draagt waarschijnlijk vaccinia virus toegang. Dit vertegenwoordigt een voorbeeld uitschieter van het scherm. Virus = groen, kernen = blauw.
Discussion
Genoomwijde RNAi screening in Drosophila biedt een robuuste en efficiënte methode voor het onderzoeken van de cellulaire component van de virale infectie. Een aantal zoogdieren infecteren Drosophila cellen, die kan worden gebruikt om onderdelen van de gastheer intrinsieke immuunrespons, en gastheer eiwit factoren die nodig zijn voor virale replicatie, dat kan vertegenwoordigen nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren. Voor het uitvoeren van een scherm, moet de test zorgvuldig worden geoptimaliseerd voor celtype, mobiele nummer, en infectie-niveau, en moet goed worden gecontroleerd, met inbegrip van zowel positieve als negatieve virale en cellulaire doelwitten 11. Het is belangrijk om voldoende scheiding tussen positieve en negatieve controles voorafgaand aan de screening om het dynamisch bereik van de test te maximaliseren. Zodra het scherm is uitgevoerd, kunnen kandidaten worden onderverdeeld in functionele categorieën om te bepalen welke host mechanismen bijdragen tot infectie. Voor zoogdieren virussen zoals vaccinia, moet de bijdrage van de zoogdieren homologen van RNAi worden bepaald als onderdeel van de secundaire analyse. Tezamen zullen deze robuuste screeningsmethoden stellen ons in staat om inzicht te krijgen in complexe mechanismen waarmee virussen omgaan met hun gastheercellen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van NIAID (R01AI074951, U54AI057168) en de Penn Genome Institute grenzen aan SC, van NIH T32HG000046 tot TSM, van NIH T32GM07229 en T32AI007324 naar LRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Schneider’s media | GIBCO, by Life Technologies | 11720 | |
| GlutaMAX 100X | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| Screening | |||
| Genome-wide dsRNA library | Ambion | ||
| 384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | |
| Aluminum seals | Corning | 6569 | |
| Clear seals | Denville Scientific | B1212-4 | |
| Well Mate | Matlab | 201-10001 | |
| 24 pin manifold | Drummond Scientific | 3-000-101 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | ||
| ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | ||
| MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |
References
- Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells. Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).
- Chotkowski, H. L. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication. J Virol. 62, 277-284 (1988).
- Sessions, O. M. Discovery of insect and human dengue virus host factors. Nature. 458, 1047-1050 (2009).
- Cherry, S. Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions? Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).
- Hao, L. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Cherry, S. COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication. PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).
- Cherry, S. Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition. Genes Dev. 19, 445-452 (2005).
- Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics. PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).
