Summary
Viral enfeksiyon katılan Roman konakçı faktörleri fonksiyonu RNAi tarama hücre tabanlı genom zarara tespit edilebilir. A
Abstract
Yalnızca virüs, insan hastalığının doğal salgın hastalıkların neden olabilir, ancak biyoterörizm onların potansiyel kullanımı da bir endişe, viral patojenlerin önemli bir kamu sağlığı tehdidi temsil eder. Hücresel faktörlerin daha iyi anlaşılması, çok ihtiyaç duyulan terapötikler etkisi enfeksiyon gelişimini kolaylaştıracağını söyledi. Çeşitli organizmaların tam genomu sıralama ile birleştiğinde RNA enterferans (RNAi) teknolojisi son gelişmeler genom, hücre tabanlı kayıp fonksiyon-ekranlar optimizasyonu yol açmıştır. Drosophila hücreleri nedeniyle genom ölçekli ekranlar özellikle mükellef bu sistemi 1 RNAi kolaylığı ve verimliliği. Önemlisi, virüslerin Drosophila hücreleri, tıbbi ve tarımsal önemi 2,3,4 memeli virüslerin sayısı da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede bulaşabilir. Drosophila Önceki RNAi ekranları giriş, çeviri ve RNA çoğaltma 5 virüs enfeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli adımlar için gerekli konakçı faktörleri tespit ettik. Ayrıca, Drosophila hücre kültürü viral replikasyon için gerekli olan hücresel faktörlerin birçoğu da bu virüsler 4,6,7,8, 9 ile enfekte insan hücrelerinde sınırlayıcı. Bu nedenle, viral enfeksiyon sırasında eş-tarafından tercih ana faktörlerin belirlenmesi, antiviral tedavi için yeni hedeflere sunar. Burada bir örnek olarak vaccinia virüs kullanarak, viral enfeksiyon yer hücresel faktörleri belirlemek için bir yüksek verim RNAi ekran için genelleştirilmiş bir protokol mevcut.
Protocol
Bölüm 1: 384 Şey Tabaklar RNAi
- Tarama için kullanılan reaktifler Standardizasyon esastır. Biz bireysel birçok Schneider medya, fetal sığır serumu, ve boyama reaktifleri test edin. Sonra biz, tüm ekranı için aynı çok kısım ve kullanın.
- Herhangi bir tahlil için, salt biyolojik en müsait olduğunu belirlemek için birkaç farklı hücre hatları test etmek en iyisidir. Biz genellikle S2 DRSC hat kullanın.
- 25 ° C tam Schneider medya Drosophila hücreleri büyütün.
- Schneider medya
- % 10 ısı inaktive FBS
- 1X L-glutamin
- 1X Kalem / strep antibiyotik
- Drosophila hücreleri yarı yapışık ve her dört günde bir, matara kapalı hücreleri pipetleme ve taze bir balona 01:10 hücreleri seyreltilmesi trypsinization olmadan geçişli. Hücreler deneyler için log fazı olmalıdır.
- Plaka-plaka ve günden güne değişkenlik tüm sıvı eklemeleri için çok iyi plakaları otomatik sıvı taşıma kullanımı ile en aza indirilmiştir. Biz WellMate (Matrix) kullanın.
- WellMate tüp hazırlayın.
- Sprayhood ve% 70 etanol ile WellMate.
- % 70 etanol ile ambalaj ve sprey tüp çıkarın.
- WellMate pozisyon dağıtım boru kaset takın.
- 25 ml% 70 etanol ile Başbakan boru.
- 15 dakika, sonra başbakan başka bir 25 mL etanol etanol içinde tüp sterilize edin.
- 50 ml steril PBS ile astarlanırsa boru durulayın.
- Şişeyi ve sayısı hücreleri yerinden oynatın. Pelet hücreleri (300xg, 5 dk)% 25 daha fazla olduğunu. Ortalama numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı tahlil uzunluğuna göre optimize edilmesi gerekir. Otomatik görüntü analizi yaparken, hiçbir hücre topaklanma ile tek tek tabakalı bir görüntü segmentasyonu için idealdir.
- 1.7x10 6 hücre / ml serum serbest Schneider medya pelet hücreleri tekrar
- Biz 384 kuyucuğu 250ng/well bir konsantrasyonda dsRNA piyasada mevcut kütüphanesi ile önceden aliquoted ekran gerçekleştirmek. Her plaka birkaç kuyu elle eklenir, kontroller için boş bırakılır. Biz bir negatif kontrol olarak lusiferaz dsRNA kullanın. Biz güçlü bir RNAi kontrol olarak karşı dsRNA Konu (dIAP) kullanın. Dramatik hücre ölümü bu anti-apoptotik faktör sonuçlarının yıkmak ve aşağı knock kalitesini değerlendirmek için hızlı bir görsel yoludur. Son olarak, biz, bizim tahlil okuma kullanarak viral enfeksiyon inhibe doğrulamak için bir pozitif kontrol olarak, bu durumda beta-galacosidase viral muhabiri karşı dsRNA kullanabilirsiniz. Hücre tohumlama, kısım 1 ul dsRNA kolay görünüm için izin vermek için iyi köşeye zamanda plaka dsRNA lekelenme, daha sonra hücrelerin eklemeden önce kuyunun altındaki (300xg, 1 dak.) Üzerine çift iplikçikli santrifüj.
- Her bir kuyu için yukarıda hazırlanan 10 mcL hücre eklemek için WellMate kullanın.
- 300xg, 1 dakika santrifüj plakalar üzerine hücreleri Spin.
- 45 dakika boyunca 25 ° C inkübatörde inkübe edin.
- 20 mcL tam Schneider medya ekleyin ve 300xg, 1 dakika santrifüj.
- Nemlendirilmiş Tupperware kapları koyun tabak, suda ıslatılmış kağıt havlu ile kaplı. 384 hacmi küçük, böylece, buharlaşma da kenarına kuyuların okumaları artefakt değişikliklere yol açabilir biyoloji, büyük etkileri olabilir. Bunu aşmak için, tabak, yüksek nem altında tutulmalıdır.
- Sağlam demonte izin vermek için üç gün boyunca inkübe edin. Ortamı değiştirmek veya bu süre içinde nemlendirilmiş kapları açmak için gerek yoktur.
Bölüm 2: Vaccinia Virüs ile Enfekte
- 15 dakika boyunca Quatricide sterilize edilen çok-kanallı aspiratör, daha sonra% 70 etanol içinde durulayın.
- Yukarıda açıklandığı gibi WellMate hazırlayın.
- Serum serbest medya tam bir medya 01:05 seyreltilmesi ile enfeksiyon için 2% FBS ile Schneider medya hazırlayın.
- 0,8 um şırınga aracılığıyla hücresel enkaz kaldırmak veya saflaştırılmış virüs kullanmak için filtre Filtre ham virüs stokunun.
- 2 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) elde etmek için% 2 serum Schneider medya vaccinia virüs sulandırınız.
- WellMate boru PBS çıkarın ve tüp hava kabarcıkları serbest kadar seyreltilmiş virüs başbakan.
- DsRNA ile tedavi edilen Drosophila hücreleri plakaları medya hafifçe kaldırmak için sterilize çok kanallı aspiratör ve vakum manifoldunun kullanın.
- WellMate kullanarak plakaları üzerine de başına 30 mcL virüs koyun.
- 300xg plakaları 1 dakika santrifüjleyin.
- WellMate boru sterilize edin. 25 mL% 10 blea ile Başbakanch, 10 dakika bekleyin ve bir 25 ml% 10'luk çamaşır suyu ile başbakan.
- Başbakan tüp 50 ml su ile 50 ml% 70 etanol ile izledi. Ambalajın boru dönün.
- Nemlendirilmiş Tupperware konteyner plakaları geri dön. 48 saat boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
Bölüm 3: Boyama Tabaklar
- 10 dakika için 15 mcL% 4 formaldehit / PBS plakaları sabitleyin. Sıvı bir multi-kanal aspiratör ve vakum manifoldunun her adımı kullanarak kaldırılır. Plakalar, steril ekipman giderildi var ve reaktifler artık gerekli değildir.
- Kaldır düzeltmek ve 30 mcL PBST (PBS +% 0,1 Triton-X) eklemek için kullanabilirsiniz WellMate. Ve tekrar 10 dakika inkübe edin. Tüp sterilize edilmelidir gerekmez hariç İşlet, yukarıda açıklandığı gibi WellMate.
- Vaccinia enfeksiyonu saptamak için erken / geç vaccinia organizatörü tarafından yönlendirilen bir β-galaktosidaz muhabiri kullanın.
- 10 dakika boyunca sıvı ve inkübe blok hücreleri (2% BSA ile PBST) çıkarın.
- Blok primer antikor sulandırınız, sıvı kaldırmak ve her biri de çok kanallı kullanarak tekrar pipet (Matrix) 15 mcL antikor ekleyin.
- Levhalar (300xg, 1 dak) Spin, net bir etiket ile kaplayın ve 4 ° C gecede inkübe.
- Primer antikor çıkarın ve PBST 3 kez, her biri 10 dakika kuyuların yıkamak için WellMate kullanın.
- Floresan ile işaretlenmiş sekonder antikor (FITC) ve blok içinde leke nükleer seyreltin ve multi-kanal tekrar pipet kullanarak kuyulara 15 mcL ekleyin.
- Inkübe plakalar 1 saat oda sıcaklığında, ışıktan korunmalıdır.
- Kuyu PBST 3 kez, WellMate kullanarak her biri 10 dakika yıkayın.
- 4 net etiket, kapak ve mağaza ile plaka Seal ° C üç hafta kadar.
Bölüm 4: Görüntüleme ve Görüntü Analiz
- 20X büyütmede otomatik bir mikroskop görüntü tabak kullanın.
- Toplam çekirdekleri (DAPI) ve enfekte olmuş hücreleri (FITC) görüntüleri yakalayın. Dinamik aralık maksimize etmek için, her kanal için ayrı ayrı pozlama süresi optimize edin.
- Beklenen odak düzlemi altındaki ve üstündeki uçakları yayılan görüntüleri, arayla 1um, Z yığını alarak otomatik odaklama fonksiyonu ince ayar yapın. Optimal odak düzlemli bulunmaktadır, buna göre otomatik odaklama ayarlarını.
- Resim tüm plaka, Hoechst kanal (DAPI) ve virüs kanal (FITC) başına en az üç fotoğraf çekmek. Bir bütün olarak iyi temsil eden görüntüler yakalamak için iyi bir içinde birkaç farklı bölgelerden gelen siteleri seçin.
- Segment resmi bir dergide yazmak ve her plaka için nükleer boyanma (toplam hücreleri) ve enfeksiyon (FITC) pozitif hücrelerin toplam sayısını hesaplamak için Kont Çekirdekler modülleri kullanmak için yazılım MetaXpress kullanın.
- Yüzde enfeksiyon (100 * FITC pozitif / toplam hücre) hesaplayın ve dönüşümü giriş.
- Adayları belirlemek için, her plaka medyan ve çeyrekler açıklığı dayalı sağlam bir Z skoru kullanın. Bu yöntem aykırı ve nonsymmetric veri duyarsız ve böylece, hatta zayıf veya orta derecede hit 10 tanımlanması daha fazla güç sağlar. Her plaka için, medyan log-dönüştürülmüş verileri çıkarılır. Daha sonra elde edilen değerler 0.74 kez çeyrekler açıklığı (75 persentil ve 25. yüzdelik değerleri arasındaki fark) tarafından ayrılır. 0,74 faktörü yaklaşık bir standart normal dağılım için kullanılır.
- Sağlam Z skoru plaka medyan standart sapma mesafe bir ölçüsüdür. Örneğin, 2 sağlam bir Z-skoru iyi% enfeksiyonu plaka medyan veya p <0.05 ~ 2 standart sapma gösterir.
- Hücre sayısı, sitotoksik adayları belirlemek için analiz edin. Nükleer sayar sağlam Z skoru hesaplayın. Adaylar ile sağlam bir yinelenen ekranlarında Z <-2 sitotoksik olarak kabul edilir.
- Sitotoksisite olmadan> yinelenen ekranlarında 2 veya <-2 (p <0.0025) yüzde enfeksiyon için sağlam bir Z skoru Wells birincil ekran potansiyel aday olarak kabul edilir.
- Olumlu adayların bağımsız reaktifler kullanılarak doğrulanır. dsRNAs mRNA başka bir bölgeye ilgi genlerin karşı oluşturulan ve yukarıdaki gibi test edilmektedir.
- Iki bağımsız dsRNAs aynı fenotipe sahip olduğunuz bu genlerin daha fazla çalışma için kabul edilebilir.
Bölüm 5: Temsilci Görüntüler ve Enfeksiyon Oranları yorumlanması
Şekil 1 bulaşmamış kuyu iyi bulaşmış bir temsilcisi immünofloresan mikroskobu ile ölçülen vaccinia ifade beta-galaktosidaz (βgal) protein, pozitif boyanma hücreleri içeren, vaccinia virüs proteinler için herhangi bir boyama görünmüyor.Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi.
Şekil 2 Otomatik görüntü analiz yazılımı, kullanıcı tarafından belirlenen parametreler kullanılarak her görüntü enfeksiyon rakamlarla . Bir temsili görüntü, hücre çekirdekleri ve viral antijen eksprese eden hücrelerin sayısı toplam sayısı, büyüklüğü ve yerel arka plan boyanma üzerinde boyanma yoğunluğu dayanan sayılır.
Şekil 3 iplik (dIAP) demonte hedef genlerin sağlam RNAi tükenmesi için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Bu anti-apoptotik faktör demonte dramatik hücre ölümüne yol açar. Çekirdekler = mavi.
Şekil 4 lusiferaz demonte enfeksiyon çift iplikli RNA tedavi etkisi için bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Lusiferaz tükenmesi, tedavi edilmezse hücrelere göre enfeksiyon üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi.
Şekil 5 βgal protein demonte enfeksiyon okundu olarak tahlil βgal protein düzeyleri kullandığından beri, bir enfeksiyon azaltılması için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Enfekte hücrelerin yüzdesinde bir azalma βgal sonuçlar tükenmesi. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi.
Şekil 6, enfekte hücrelerin yüzdesinde bir azalma hücresel faktör Rab5 sonuç demonte . Rab5 endositoz katılmak için bilindiğinden, bu faktör, büyük olasılıkla vaccinia virüs giriş katkıda bulunmaktadır. Bu ekran bir örnek uç temsil eder. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi.
Discussion
Drosophila genom RNAi tarama viral enfeksiyon hücresel bileşeni incelenmesi için sağlam ve etkili bir yöntem sağlar. Ev sahibi içsel immün yanıt bileşenleri ve terapötik hedefleri temsil edebilir viral replikasyon için gerekli ana protein faktörleri tanımlamak için kullanılır. Drosophila hücreleri, bir çok memeli virüs bulaştırmak. Bir ekran, tahlil yapmadan önce dikkatli bir hücre tipi, hücre sayısı ve enfeksiyon seviyesi için optimize edilmiş olmalı ve 11 pozitif ve negatif viral ve hücresel hedefleri de dahil olmak üzere kontrol edilmelidir. Önce tarama testinin dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için pozitif ve negatif kontroller arasında yeterli ayırma sağlamak için önemlidir. Ekran yapıldıktan sonra, adaylar, ev sahibi mekanizmaları enfeksiyona katkıda bulunan belirlemek için işlevsel kategoriler halinde bölünmüş olabilir. Vaccinia gibi memeli virüsler için, RNAi memeli homologları katkısı ikincil analizi bir parçası olarak tespit edilmelidir. Birlikte ele alındığında, bu güçlü tarama yöntemlerinin bize virüsler, konak hücreleri ile etkileşimde bulunduğu karmaşık mekanizmaları anlamak için izin verir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIAID (R01AI074951 U54AI057168) ve SC Penn Genom Frontiers Enstitüsü hibeleri ile desteklenen; NIH T32HG000046 TSM; NIH T32GM07229 ve T32AI007324 LRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Schneider’s media | GIBCO, by Life Technologies | 11720 | |
| GlutaMAX 100X | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| Screening | |||
| Genome-wide dsRNA library | Ambion | ||
| 384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | |
| Aluminum seals | Corning | 6569 | |
| Clear seals | Denville Scientific | B1212-4 | |
| Well Mate | Matlab | 201-10001 | |
| 24 pin manifold | Drummond Scientific | 3-000-101 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | ||
| ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | ||
| MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |
References
- Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells. Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).
- Chotkowski, H. L. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication. J Virol. 62, 277-284 (1988).
- Sessions, O. M. Discovery of insect and human dengue virus host factors. Nature. 458, 1047-1050 (2009).
- Cherry, S. Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions? Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).
- Hao, L. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Cherry, S. COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication. PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).
- Cherry, S. Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition. Genes Dev. 19, 445-452 (2005).
- Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics. PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).
