Summary
Novos fatores hospedeiro envolvidos na infecção viral podem ser identificados através de células baseado em perda de todo o genoma da função de triagem RNAi. A
Abstract
Patógenos virais representam uma ameaça de saúde pública, não só pode causar epidemias vírus natural da doença humana, mas o seu uso potencial em bioterrorismo também é uma preocupação. Uma melhor compreensão dos fatores celulares que a infecção impacto seria facilitar o desenvolvimento de muito necessária terapêutica. Os recentes avanços na tecnologia de interferência de RNA (RNAi) juntamente com o seqüenciamento do genoma completo de vários organismos levou para a otimização do genome-wide, baseada em células de perda de função-telas. Células Drosophila são particularmente passíveis de genoma escala de telas por causa da facilidade e eficiência de RNAi neste sistema 1. Importante, uma grande variedade de vírus podem infectar as células Drosophila, incluindo um número de vírus de mamíferos de importância médica e agrícola 2,3,4. Telas anteriores RNAi em Drosophila identificou factores do hospedeiro que são necessários para as várias etapas na infecção pelo vírus, incluindo entrada, tradução e replicação de RNA 5. Além disso, muitos dos fatores celulares necessárias para a replicação viral em cultura de células Drosophila também são limitantes nas células humanas infectadas com estes vírus 4,6,7,8, 9. Portanto, a identificação de fatores do hospedeiro cooptados durante a infecção viral apresenta novos alvos para a terapêutica antiviral. Aqui apresentamos um protocolo generalizada para uma tela de RNAi de alto rendimento para identificar os fatores celulares envolvidos na infecção viral, usando vírus vaccinia como um exemplo.
Protocol
Parte 1: RNAi em 384 placas de Bem
- Padronização dos reagentes utilizados para o rastreio é essencial. Testamos lotes individuais de mídia de Schneider, soro fetal bovino, e reagentes de coloração. Então nós alíquotas e usar o mesmo lote para a tela inteira.
- Para qualquer ensaio, é melhor testar várias linhas de células diferentes para determinar qual é mais receptivo à sua biológico de leitura. Normalmente usamos a linha S2-NUPAD.
- Cultivar células Drosophila a 25 ° C nos meios de comunicação Schneider completo.
- Media Schneider
- 10% de calor FBS inativada
- 1X L-glutamina
- 1X Pen / strep antibióticos
- Células Drosophila são semi-aderente e são várias passagens sem tripsinização a cada quatro dias por pipetagem as células fora os balões e diluir as células 1:10 em um frasco fresco. As células devem estar em fase de registro para experimentos.
- Placa-to-plate e dia-a-dia variabilidade são minimizados através do uso de manipulação de líquidos automatizado para todas as adições líquidas de multi-lamelas. Nós usamos um WellMate (Matrix).
- Prepare tubulação WellMate.
- Spray de capuz e WellMate com etanol 70%.
- Remover tubos de embalagem e de pulverização com etanol 70%.
- Inserir cassete tubulação na dispensação posição no WellMate.
- Tubulação privilegiada, com 25 mL de etanol 70%.
- Esterilizar tubulação em etanol por 15 minutos, então primeiro com outro de 25 mL de etanol.
- Enxágüe tubulação por priming com 50 mL de PBS estéril.
- Desalojar células do frasco e contagem. Células pelota para que você tenha 25% a mais do que o necessário (300xg, 5 min). O número de células inoculadas por poço deve ser otimizado de acordo com a duração do ensaio. No âmbito da análise automática de imagem, uma monocamada único sem aglomeração celular é ideal para segmentação de imagem.
- Ressuspender as células peletizada no soro livre de Schneider de mídia em 1.7x10 6 células / mL.
- Realizamos a tela em 384 placas bem pré-aliquotado com uma biblioteca disponível comercialmente de dsRNA em uma concentração de 250ng/well. Vários poços de cada placa são deixados vazios para controles, que são adicionados manualmente. Usamos a luciferase dsRNA como controle negativo. Usamos dsRNA contra Thread (DIAP) como um controle para robusto RNAi. Derrubar resultados deste anti-apoptóticos fator na morte da célula dramática e é uma maneira rápida e visual para avaliar a qualidade do knock down. Por fim, usamos um dsRNA contra o repórter viral, neste caso galacosidase beta, como um controle positivo para validar que pode inibir a infecção viral com o nosso ensaio de leitura. Se detectar dsRNA em placa no momento da semeadura de células, dsRNA alíquota 1 ml para o canto do bem, para facilitar a visualização, em seguida, centrifugar dsRNA em fundo de poço (300xg, 1 min) antes de adicionar células.
- Use WellMate para adicionar 10 mL de células preparadas acima para cada poço.
- Spin-células em placas por centrifugação 300xg, 1 min.
- Incubar 25 ° C em incubadora por 45 minutos.
- Adicionar 20 mL completa Schneider de mídia e centrifugar 300xg, 1 min.
- Placas lugar em recipientes Tupperware umidificado forrado com toalhas de papel embebido em água. O volume de 384 poços é pequena, assim, a evaporação pode ter grandes efeitos sobre a biologia, que por sua vez pode levar a mudanças na artifactual outs leitura dos poços borda. Para superar isso, as placas devem ser mantidos sob alta umidade.
- Incubar durante três dias para permitir a knockdown robusto. Não há necessidade de alterar a mídia ou abrir recipientes umidificado durante este tempo.
Parte 2: Infectando com Vaccinia Virus
- Esterilizar canal multi-aspirador em Quatricide por 15 minutos, em seguida, lavar em etanol 70%.
- Prepare WellMate como descrito acima.
- Prepare media Schneider, com 2% de SFB para a infecção por diluindo completa media 1:05 em soro de mídia livre.
- Estoque de vírus filtro de crude através de seringa 0,8 hum filtro para remover os restos celulares ou uso de vírus purificado.
- Diluir vírus vaccinia em 2% de soro Schneider de mídia para obter multiplicidade de infecção (MOI) de 2.
- Remover PBS a partir de tubos WellMate e privilegiada, com vírus diluído até a tubulação está livre de bolhas de ar.
- Use esterilizados multi-canal de aspiração e coletor de pó para remover suavemente media das placas de células dsRNA tratados com Drosophila.
- Dispense 30 mL por poço de vírus em placas usando o WellMate.
- Centrífuga placas de 1 minuto a 300xg.
- Esterilizar tubulação WellMate. Prime com 25 mL de blea 10%ch, aguarde 10 minutos, e privilegiada, com outra água sanitária de 25 mL de 10%.
- Tubulação Prime com 50 mL de água seguida de 50 mL de etanol a 70%. Retorno tubulação para sua embalagem.
- Retorno placas para recipiente Tupperware umidificado. Incubar a 25 ° C por 48 horas.
Parte 3: Placas de coloração
- Fixar placas em 15 mL de formaldeído 4% / PBS por 10 minutos. Líquido é removido usando um aspirador multi-canal e distribuidor de vácuo em cada etapa. Uma vez que as placas foram fixadas, equipamentos esterilizados e os reagentes não são mais necessárias.
- Remover corrigir e use WellMate para adicionar 30 mL PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Incubar 10 minutos e repita. WellMate operar como descrito acima, exceto tubos não precisam ser esterilizados.
- Para detectar a infecção vaccinia usamos um repórter β-galactosidase dirigido por um promotor vaccinia cedo / tarde.
- Remover as células líquido e incubar em bloco (PBST com BSA 2%) por 10 minutos.
- Diluir o anticorpo primário em bloco, remover o líquido e adicionar 15 mL de anticorpos para cada um pipetador de repetição bem usando uma multi-canal (Matrix).
- Spin down placas (300xg, 1 min), cubra com um adesivo claro, e incubar a 4 ° C durante a noite.
- Remover o anticorpo primário, e usar o WellMate para lavar poços em PBST 3 vezes, 10 minutos cada.
- Diluir fluorescente etiquetado anticorpo secundário (FITC) e nuclear mancha em bloco, e adicionar 15 mL de poços usando um multi-canal de pipetador de repetição.
- Incubar as placas de uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz.
- Lavar os poços no PBST 3 vezes, 10 minutos cada um usando o WellMate.
- Seal placa com adesivo transparente, capa, e armazenar a 4 ° C até três semanas.
Parte 4: Imagem e Análise de Imagem
- Use um microscópio automatizado com ampliação de 20x para placas de imagem.
- Capturar imagens de núcleos total (DAPI) e as células infectadas (FITC). Otimizar o tempo de exposição para cada canal, individualmente, a fim de maximizar o alcance dinâmico.
- Ajustar a função de foco automático, tendo uma pilha de imagens Z, 1um espaçadas, que abrangem os aviões acima e abaixo do plano previsto de foco. Assim que o avião ideal focal está localizado, ajustar as configurações de focagem automática em conformidade.
- Imagem da placa inteira, captura de pelo menos três imagens por bem, tanto no canal de Hoechst (DAPI) e do canal de vírus (FITC). Escolha sites de várias regiões diferentes dentro de um poço, a fim de capturar imagens que representam o bem como um todo.
- Use MetaXpress software para escrever um diário para o segmento de imagem e usar módulos Núcleos Contar para calcular o número total de células positivas para a coloração nuclear (células total) e infecção (FITC) para cada prato.
- Calcular a infecção por cento (100 células * FITC positivo / total) e log transformar.
- Para identificar os candidatos que usamos uma pontuação Z robusto baseado na mediana e intervalo interquartil de cada prato. Este método é insensível a outliers e dados não simétrica, proporcionando assim maior poder na identificação ainda bate fraca ou moderada 10. Para cada placa, a mediana é subtraído os dados log-transformados. Em seguida, os valores resultantes são divididos por 0,74 vezes o intervalo interquartil (diferença entre os valores do percentil 75 eo percentil 25). O fator 0,74 é utilizado para aproximar uma distribuição normal padrão.
- A pontuação Z robusta é uma medida de distância em desvios-padrão da mediana da placa. Por exemplo, um robusto Z-score de 2 indica a infecção% do poço é de aproximadamente 2 desvios-padrão da mediana placa ou p <0,05.
- Analisar o número de células para identificar candidatos citotóxicos. Calcular o escore Z robusta de contagens nuclear. Candidatos com um robusto Z <-2 em telas duplicadas são considerados citotóxicos.
- Poços que têm uma pontuação Z robusta para a infecção por cento dos> 2 ou <-2 em telas duplicados (p <0,0025), sem citotoxicidade são considerados candidatos potenciais a partir do ecrã principal.
- Candidatos positivos são validados usando reagentes independentes. dsRNAs são gerados contra os genes de interesse de outra região do mRNA e testado como descrito acima.
- Os genes para os quais duas dsRNAs independentes têm o mesmo fenótipo podem ser considerados para um estudo mais aprofundado.
Parte 5: Imagens Representante e Interpretação das taxas de infecção
Figura 1. Poços não infectadas não apresentam qualquer coloração para proteínas do vírus vaccinia, enquanto um representante infectados poço contém células coloração positiva para vaccinia-expressa a proteína beta-galactosidase (βgal), medido por microscopia de imunofluorescência.Virus = verde, núcleos = blue.
Figura 2. Software de análise automatizada de imagem quantifica infecção em cada imagem usando parâmetros definidos pelo usuário. Em uma imagem representativa, o número total de núcleos celulares eo número de células que expressam o antígeno viral são contados com base no tamanho e da intensidade da coloração acima da coloração de fundo local.
Figura 3. Knockdown de thread (DIAP) serve como um controle positivo para o esgotamento RNAi robusto de genes-alvo. Knockdown deste fator anti-apoptótico leva à morte celular dramático. Núcleos = blue.
Figura 4. Knockdown da luciferase serve como um controle negativo para o efeito de double-stranded RNA tratamento sobre a infecção. Esgotamento de luciferase não tem nenhum efeito sobre a infecção em relação às células não tratadas. Virus = verde, núcleos = blue.
Figura 5. Knockdown de proteína βgal serve como um controle positivo para a redução da infecção, já que o ensaio utiliza níveis de proteína βgal como uma leitura de infecção. Esgotamento dos resultados βgal em uma diminuição na porcentagem de células infectadas. Virus = verde, núcleos = blue.
Figura 6. Knockdown de celulares fator Rab5 resulta em uma diminuição da percentagem de células infectadas. Desde Rab5 é conhecido por participar de endocitose, este fator provavelmente contribui para a entrada do vírus vaccinia. Isto representa um outlier exemplo da tela. Virus = verde, núcleos = blue.
Discussion
Genoma de despistagem RNAi em Drosophila fornece um método robusto e eficiente para a análise da componente celular da infecção viral. Um número de vírus infectam as células de mamíferos Drosophila, que pode ser usado para identificar os componentes da máquina de resposta intrínseca imunológico e fatores do hospedeiro proteínas necessárias para a replicação viral que pode representar novos alvos terapêuticos. Antes de executar uma tela, o ensaio deve ser cuidadosamente otimizado para o tipo de célula, número de células, e nível de infecção, e deve ser bem controlada, incluindo tanto positivas como negativas viral e alvos celulares 11. É importante garantir a separação suficiente entre os controles positivos e negativos antes de triagem para maximizar a gama dinâmica do ensaio. Uma vez que a tela foi realizada, os candidatos podem ser divididos em categorias funcionais para determinar quais os mecanismos de acolhimento contribuem para a infecção. Em busca de vírus vaccinia mamíferos, tais como, a contribuição dos homólogos mamíferos por RNAi deve ser determinada como parte da análise secundária. Juntos, esses métodos de triagem robusta nos permitirá ganhar a introspecção em mecanismos complexos pelos quais os vírus interagem com as células do hospedeiro.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado por concessões do NIAID (R01AI074951, U54AI057168) eo Penn Genome Institute Fronteiras para SC, a partir de NIH T32HG000046 a TSM, a partir de NIH T32GM07229 e T32AI007324 de LRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Schneider’s media | GIBCO, by Life Technologies | 11720 | |
| GlutaMAX 100X | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| Screening | |||
| Genome-wide dsRNA library | Ambion | ||
| 384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | |
| Aluminum seals | Corning | 6569 | |
| Clear seals | Denville Scientific | B1212-4 | |
| Well Mate | Matlab | 201-10001 | |
| 24 pin manifold | Drummond Scientific | 3-000-101 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | ||
| ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | ||
| MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |
References
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