Summary
Análise única célula é realizada por espectrometria de massa de células vegetais e animais à pressão atmosférica usando uma fibra óptica afiada para provar as células para o laser de ionização electrospray ablação (LAESI) espectrometria de massa.
Abstract
Análise de produtos bioquímicos em células individuais é importante para a compreensão do metabolismo celular, ciclo celular, adaptação, estados de doença, etc Mesmo os tipos de células apresentam mesma composição bioquímica heterogêneos dependendo de suas condições fisiológicas e interações com o ambiente. Métodos convencionais de espectrometria de massa (MS) utilizados para a análise de biomoléculas em células individuais dependem de preparação da amostra extensa. Removendo as células do seu ambiente natural e processamento da amostra extensa pode levar a mudanças na composição celular. Métodos de ionização do ambiente permitem a análise de amostras em seu ambiente nativo e sem a preparação da amostra extensa. 1 As técnicas com base no infravermelho médio ablação a laser (meados de IR) de materiais biológicos em comprimento de onda 2,94 mM utilizar a excitação repentina de água que resulta em fase de explosão. duas técnicas de ionização ambiente baseado em meados de IR radiação laser, como laser de ionização electrospray ablação (LAESI) e pressão atmosférica infravermelho matrix-assisted laser de ionização de dessorção (AP-IR MALDI), têm demonstrado com sucesso a capacidade de analisar diretamente a água tecidos ricos e biofluidos à pressão atmosférica. 3-11 LAESI Em meados da década de IR pluma de ablação a laser que consiste principalmente de partículas neutras do aglutina amostra com gotas electrospray altamente carregada de produzir íons. Recentemente, em meados de IR ablação de células isoladas foi realizada através da apresentação da radiação meados de IR através de uma fibra gravado. A pluma gerada a partir deste ablação foi postionized por um electrospray permitindo a análise de metabólitos diversos em uma única célula por LAESI-MS. 12 Este artigo descreve o protocolo para a análise detalhada única célula usando LAESI-MS. O vídeo apresentado demonstra a análise de uma única célula epidérmica da pele de uma lâmpada Allium cepa. O esquema do sistema é mostrado na Figura 1. Um exemplo representativo de ablação única célula e espectrometria de massa LAESI da célula são fornecidos na Figura 2.
Protocol
1. Componentes ópticos
- Ablação a laser para o laser de ionização electrospray ablação (LAESI) espectrometria de massa (MS) é produzido por um laser de 5 ns pulso em comprimento de onda 2,94 mM. Um oscilador paramétrico óptico sintonizável impulsionada por um laser Nd: YAG (Opolette 100, Opotek Inc., Carlsbad, CA) é usado para ablação neste estudo. A taxa de repetição é selecionado entre 5 e 100 Hz. Este é um laser classe IV que após a exposição direta pode causar danos permanentes graves nos olhos ou da pele. A reflexão difusa do feixe de laser também podem ser perigosos para a pele ou olhos. Usar um óculos de laser adequados de protecção.
- A fibra óptica feitos de germânio de vidro baseado no dióxido de infravermelho foi obtido a partir Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD). Se houver Hytrel e poliimida revestimentos em fibra siga as instruções abaixo para removê-los a partir das extremidades. Heat 1-metil-2-pirrolidinona a 130-150 ° C em uma capela. Mergulhe as extremidades da fibra que você quer retirar este líquido em cerca de 1 min ou até que o revestimento começa a amolecer e descolar. Mergulhe o revestimento amolecida em metanol ou isopropanol por um minuto, e limpe qualquer revestimento restantes com um guardanapo que não solte fiapos. Após a remoção do revestimento, cleave ambas as extremidades da fibra com uma lâmina de safira (Kitco Fibra Óptica, Virginia Beach, VA) marcando e delicadamente tirando-los.
- Para alcançar a nitidez desejada, quimicamente uma extremidade do etch ponta da fibra em 1% (v / v) de ácido nítrico (grau de reagente) solução. Verticalmente imergindo a extremidade da fibra selecionados para a solução de ácido a uma profundidade de 300 a 500 mm após o contacto inicial. Após aproximadamente 15 minutos de gravação, a dica vai separar-se espontaneamente a partir da superfície do ácido. Isso resulta em uma ponta da fibra afiada com ~ 15 mM raio de curvatura. Enxágüe com água deionizada para remover qualquer resíduo do ácido.
- Montagem final gravado da fibra em um micromanipulador (MN-151, Narishige, Tóquio, Japão) e trazê-lo à proximidade (~ 20 mm) da superfície da célula para deposição de energia eficiente.
- Segure a extremidade não-gravado da fibra óptica por um bare fibra chuck (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Para o alinhamento óptico, o chuck fibra é montado em um tradutor cinco eixos (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). A energia do laser (0,5 a 1 mJ) é acoplado na fibra por foco o feixe por um fluoreto de cálcio plano-convexo ou lente anti-reflexo ZnSe revestido (Infrared Produtos Ópticos, Farmingdale, NY) para o seu fim não-gravadas. Espelhos de ouro protegidas (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) são utilizados para orientar o feixe de laser meados de IR sobre a lente de foco.
2. Setup electrospray
- O sistema de electrospray pode ser construído usando os seguintes componentes: a união do metal com ponteira perfluoroelastômero condutores, conexões, tubos de manga, porta agulha (por exemplo, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, respectivamente IDEX Health & Sciences, Oak Harbor, WA), bem como tubos de sílica fundida (por exemplo, CT360-100-50-5, Nova Objetivo Inc., Woburn, MA). O emissor recomendado é feito de aço inoxidável e tem uma ponta cônica com um ID de 50 mm (por exemplo, MT320-50-5-5, Nova Objetivo Inc., Woburn, MA).
- Prepare a solução de metanol a 50% com 0,1% de ácido acético (v / v) para o electrospray. A solução é bombeada a uma taxa de 200 a 300 nl / min por uma bomba de seringa (Harvard Apparatus, Holliston, MA), utilizando, por exemplo, um. Seringa 500 mL (81.222, empresa Hamilton, Reno, NV)
- Aplicar alta voltagem entre 2.800 e 3.000 V para a união de metal por uma fonte de alimentação regulada (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) para gerar um electrospray estável. Certifique-se de todas as conexões elétricas estão seguras e blindado com a blindagem aterrada. Contato direto com expostos de alta tensão pode resultar em choque elétrico.
3. Manuseamento da amostra
- Obter o tecido vivo ou amostra de células a partir de uma fonte adequada e mantê-los como recomendado antes da análise. As lâmpadas Allium cepa para esta demonstração foram compradas de uma loja local. Cortar uma lâmpada longitudinalmente por um bisturi cirúrgico. Um segmento de poucos centímetros de uma escala foi seccionada em uma tira. Uma monocamada intacta do tecido interior da epiderme é removida.
- A superfície molhada da epiderme é usado para montar o tecido sobre uma lâmina pré-limpeza de vidro de microscópio. Segure a lâmina por um detentor de propósito geral da placa (FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ) montada em um palco tradução de três eixos para o posicionamento. Adquirir os espectros de massa imediatamente após a montagem da amostra para evitar a degradação celular.
4. Sistema de Visualização
- Dois microscópios de longa distância são usados para selecionar as células para análise e para manter a distância entre a ponta afiada de fibra ea superfície da célula. O último é montado sob 15 ° ângulo de -30 medido a partir da superfície. Este sistema consiste em along microscópio de vídeo à distância (7x zoom óptico de precisão, Edmund Optics, Barrington, NJ), com uma infinidade de 5x corrigido lente objetiva (M Apo Plano de 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japão) equipado com uma câmera CCD (Marlin F131, a Allied Vision Technologies , Stadtroda, Alemanha) para monitoramento e captura de imagem.
- O microscópio segundo vídeo é montado em um ângulo reto com a superfície da amostra para visualizar as células a partir do topo. Este sistema fornece feedback visual para alinhar a ponta da fibra ao longo da célula selecionada para ablação e análise. Ele consiste de um zoom óptico de 7x de precisão (Edmund Optics, Barrington, NJ), equipada com uma infinidade 10x corrigido longa lente objetiva do trabalho à distância (M Plano de Apo 10x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japão) e uma câmera CCD.
5. Aquisição de espectros de massa
- Ligue o laser, o electrospray eo espectrômetro de massa, por exemplo, um sistema de tempo de vôo quadrupolo (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Otimizar a geometria da fonte de íons LAESI ajustando a posição do ponto de ablação e emissor electrospray em relação ao outro eo orifício do espectrômetro de massa para atingir intensidades máximas de íons.
- Selecione a célula de interesse para análise usando o sistema de visualização top-view. Após a seleção, mova o estágio de amostra para levar a célula selecionada diretamente abaixo da ponta afiada da fibra óptica. Usando o microscópio de visão lateral reajustar a ponta-a-célula de distância da superfície para ~ 20 mM.
- Pulsos de laser de fogo na célula selecionada através da ponta de fibra gravado. Este resultado na perfuração da parede celular e da ejeção do citoplasma na forma de partículas. Depois postionization pela electrospray, os íons produzidos são coletados pelo espectrômetro de massa e espectros de massa são registradas.
- Após a aquisição de dados, colocar o laser, o electrospray eo espectrômetro de massa no modo de espera ou desligá-los. Manter o A. ablated cepa amostra de tecido para a observação opcional por microscopia de luz.
6. Resultados representante
Ablação bem sucedida de uma única célula resultados na explosão da parede celular e à recolha de um espectro de massa LAESI. Uma experiência mal sucedida geralmente não resulta em ablação e / ou nenhum espectro de massa. Para fins de demonstração, apresentamos os resultados da análise LAESI-MS de uma célula simples incorporada epidérmica de uma A. bulbo cepa. Figura 2a mostra uma imagem de microscopia óptica após a representante de amostragem de uma célula. A parede celular é perfurado ea extensão da perfuração é limitada pelas fronteiras com as células vizinhas. As células adjacentes parecem estar intactos. Figura 2b mostra um espectro de massa representante LAESI produzido a partir da célula. Uma grande variedade de íons são detectados a partir do A. cepa da célula e com base em suas massas precisas, padrões de distribuição de isótopos, e, em alguns casos, tandem espectros de massa, são tentativamente atribuído aos metabólitos endógenos. Os íons detectados a partir de uma única célula foram semelhantes aos observados na análise do mesmo tecido por convencionais LAESI-MS de várias células 13.
Figura 1. Esquemática de análise única célula por LAESI-MS. A meados de IR pulso de laser é acoplado em uma fibra óptica e entregue com a amostra colocada sobre lâmina de vidro. A ponta da fibra afiada focaliza a luz para dentro da célula-alvo e da energia depositada rajadas da célula. A pluma de ablação produzida (pontos vermelhos) é mesclada com uma pluma electrospray (pontos pretos) as gotas coalescem (pontos verdes), resultando em amostra de produção de íons específicos. Esses íons são analisados e detectados pelo espectrômetro de massa (MS). Dois microscópios de longa distância de vídeo, Microscópio Microscópio 1 e 2, são utilizados para monitorar a distância entre a ponta da fibra e da superfície celular e selecionar uma célula para análise, respectivamente.
Figura 2a marca. Ablação em uma única célula epidérmica de uma A. bulbo cepa. As células adjacentes não apresentam danos visíveis e, posteriormente, podem ser analisados separadamente.
Figura 2b Espectro de massa. Correspondentes à ablação de um único A. cepa de células epidérmicas mostra a presença de metabólitos primários e secundários.
Discussion
O conteúdo de água no citoplasma da célula e resistência à tração da parede celular ou membrana são fatores críticos que regem a ablação de células isoladas durante LAESI-MS análise. A influência do laser tem que ser ajustada para atingir os limiares de ablação dos tipos de células diferentes. A influência do laser entregues depende da energia do pulso de laser e na distância entre a ponta da fibra e da superfície da célula. Minimizar a perturbação de células vizinhas durante a análise única célula é crítica. Manter a energia do laser no limiar de ablação limita o efeito de análise sobre as células adjacentes.
Uma das aplicações possíveis é usando células individuais como os pixels naturais volumétrica (voxels) para produtos químicos de imagem por MS. Em comparação com a coleta de dados em uma grade retangular artificial, muitas vezes, química imagem de uma célula do tecido de cada vez é mais provável que mantenham a organização espacial das interações bioquímicas entre as células.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio financeiro das seguintes instituições: a National Science Foundation (Grant 0719232), o Departamento de Energia (Grant DEFG02-01ER15129), o WM Keck Foundation (Grant 041.904), ea George Washington University Fundo Enhancement Research. Os autores são gratos pelas fibras ópticas GeO2 baseado generosamente fornecida por sistemas de fibra de infravermelhos (Silver Spring, MD), bem como para a discussão inicial sobre o protocolo sobre gravação de fibra por Mark E. Reeves e Joan A. Hoffmann da George Washington University. Os autores também gostariam de agradecer a Jessica A. Stolee por sua ajuda durante a filmagem do protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Fluka | 45727 | |
| Methanol | Fluka | 65548 | |
| 1-methyl-2-pyrrolidinon | Sigma-Aldrich | M79603 | |
| Water | Fluka | 39259 |
References
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