Summary
Insonation van microbellen is een veelbelovende strategie voor tumor ablatie op kortere gemiddelde akoestische bevoegdheden, alsmede voor de gerichte toediening van geneesmiddelen. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van low duty cycle echografie pulserende strategieën en nanocarriers aan niet-thermische microvasculair ablatie en laadvermogen levering aan subcutane C6 glioma te maximaliseren.
Abstract
We zijn het ontwikkelen van minimaal invasieve contrastmiddel microbellen op basis van therapeutische benaderingen waarin de permeabilisatie en / of ablatie van de microvasculatuur worden gecontroleerd door het variëren van ultrasone pulsen parameters. Concreet zijn we testen of dergelijke benaderingen kunnen worden gebruikt om kwaadaardige hersentumoren te behandelen door middel van drug delivery en microvasculaire ablatie. Voorbereidende studies zijn uitgevoerd om te bepalen of gerichte drug-dragende nanodeeltjes levering kan worden vergemakkelijkt door de ultrasoon gemedieerde destructie van "composieten" levering agenten bestaat uit 100nm poly (lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanodeeltjes die in acht worden genomen albumine gedopt microbellen . We noteren deze agenten als microbellen-nanodeeltje samengestelde middelen (MNCAs). Wanneer gericht op subcutane C6 gliomen met echografie, zagen we een directe 4,6-voudige toename van de nanodeeltjes levering in MNCA behandelde tumoren dan tumoren die behandeld werden met microbellen toegediend met nanodeeltjes en een 8,5-voudige toename ten opzichte van niet-behandelde tumoren. Bovendien is in veel toepassingen kanker, geloven we dat het kan wenselijk zijn om gerichte toediening van medicijnen uit te voeren in combinatie met ablatie van de tumor microcirculatie, wat zal leiden tot tumor hypoxie en apoptose. Daartoe hebben we getest de effectiviteit van niet-theramal cavitatie-geïnduceerde microvasculair ablatie, waaruit blijkt dat deze aanpak tumor perfusie-reductie, apoptose, een aanzienlijke groei inhibitie en necrose ontlokt. Tezamen geven deze resultaten aan dat onze echo-gerichte aanpak van het potentieel om therapeutische efficiëntie te verhogen door het creëren van tumor necrose door middel van microvasculaire ablatie en / of gelijktijdig het verbeteren van de drug payload in gliomen is.
Protocol
1. Microbellen Productie
- Voor te bereiden albumine microbellen (MBS), plaats een 1% oplossing van serum albumine in een fysiologische zoutoplossing in een kolf met een deken van gas (octafluoropropane) boven de waterige fase. Kort met ultrasone trillingen de oplossing (30 sec) met een echografie desintegrator uitgerust met een uitgebreide ½ "titanium probe. Deze formulering is vergelijkbaar met Optison (GE Healthcare), die voorzien is in een concentratie range van 0.5-1,2 x 10 9 MB / ml. Bepaal betekenen MB diameter met een Multisizer Coulter Counter. De albumine betekenen MB diameter die in deze studie was 1.93um ± 1.63um.
- Te fabriceren lipide MB, bereiden een waterige dispersie van 1 mg / ml polyethyleenglycol-40 stearaat (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) en 2 mg / ml distearoyl phosphatidylcholine (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) en sonciate zoals eerder beschreven (1.1) met decafluorobutane gas. Bepaal betekenen MB diameter met een Multisizer Coulter Counter. De gemiddelde lipide MB diameter die in deze studie was 2.01um ± 1.29um.
2. Nanodeeltje Fabrication
- Deze methoden zijn overgenomen van de water-in-olie-in-water emulsie verdamping van het oplosmiddel techniek beschreven door Davda (2002) en Chappell (2008).
- Bereid een 2% poly (vinyl alcohol) PVA-oplossing door het oplossen van 20 g van PVA in 1000 ml gedeïoniseerd (DI) water. Laat de oplossing volledig 's nachts op te lossen op een roer plaat. Centrifugeer oplossing bij 1000 rpm gedurende 10 minuten en filter met een 0.22μm steriel filter om eventuele resterende onopgeloste PVA te verwijderen.
- Te fabriceren bovine serum albumine (BSA) geladen poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLAGA) nanodeeltjes (NP), los van de niet-afgetopte 180mg 85:15 PLAGA in 6 ml methyleenchloride (MC) in een glazen scintillatieflesje. Vortex de MC / PLAGA oplossing voor 2 minuten.
- Los de gewenste laadvermogen (15 mg van de BSA) in 1,5 ml PBS. Voeg de PBS / BSA-oplossing in twee delen op de PLAGA / MC-oplossing met intermitterende vortexen. Plaats oplossing op ijs gedurende 5 minuten en ultrasone trillingen op 45W voor 120 seconden.
- Voeg de MC / PLAGA / nuttig / PBS oplossing voor 24ml 2% PVA, in twee porties met tussentijdse vortexen.
- Het plaatsen van de oplossing op ijs gedurende 5 minuten en ultrasone trillingen op 45W voor 120.
- Roer de NP emulsie gedurende 12 uur op een roer plaat in een zuurkast om verdamping van de MC en NP kan stabiliseren.
- Centrifugeer de schorsing voor 25 minuten bij 20.000 rpm bij 4 ° C tweemaal NPs te isoleren en te verwijderen resterende PVA. Resuspendeer de pellet in 8 ml van DI water en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1000 rmp bij 4 ° C om de 100nm bevolking van NP's te isoleren.
- Isoleer het supernatant en flash vriezen bij -80 ° C. De bevroren monster Lyophilize gedurende 48 uur. Bewaar de gevriesdroogde deeltjes in een exsiccator bij -80 ° C tot gebruik.
3. Composiet Delivery Vehicle Fabrication (Protocol Overgenomen van VisEn Chemie Notes)
- Conversie van VivoTag680 aan carboxy oppervlakte functionaliteit
- Combineer een flacon van VivoTag680 met 50 ul van 1,0 M HEPES, pH 7 en barnsteenzuuranhydride (2,5 mg, 25 umol) in 25 pi DMSO. Voeg 50 ul van 1,0 M NaOH aan deze oplossing, grondig gemengd, zodat oplossing gedurende 2 uur reageren bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Zuiver deeltjes met behulp van Bio-Rad Biogel (P100, medium) elueren met 0,1 M MES buffer, pH 6,0. Verzamel de groene band.
- Activering van carboxy-gemodificeerde VivoTag680
- Combineer carboxy-gemodificeerde VivoTag680 verkregen in 0,1 M MES buffer, pH 6, met 1 mg van een-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) en 2,2 mg N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS). Laat om te reageren gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Zuiver geactiveerde deeltjes uit dan het activeren van agent (EDC) door gel filtratie met behulp van Bio-Rad Biogel (P100, medium) elueren met 0,1 M MES buffer, pH 6,0 en verzamel de groene band. Onmiddellijk conjugaat de geactiveerde deeltjes naar amine-bevattende moleculen (bijvoorbeeld BSA-geladen Nanodeeltje). Laat de oplossing om te reageren gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Amine geconjugeerde NP's werden gezuiverd van overtollige EDC door centrifugeren bij 20.000 rpm voor 60min bij 4 ° C, het gieten uit de bovendrijvende na centrifugeren en resuspenderen in 0,1 MES buffer.
- Stop hier om VivoTag680 gelabeld NP voor drug delivery studies fabriceren.
- Vervoeging van carboxy-gemodificeerd PLGA-BSA-VivoTag680 Nanodeeltjes (NP680) aan albumine Microbelletjes
- Combineer NP680 verkregen in 0,1 M MES buffer, pH 6 met 1 mg van een-Ethyl-3-(3 dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) en 2,2 mg N-hydroxy-sulfosuccinimide (sulfo-NHS). Laat de oplossing om te reageren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Zuiver geactiveerd nanodeeltjes uit dan EDC door centrifugeren bij 20.000 rpm voor 60min bij 4 ° C, het gieten uit de bovendrijvende na het centrifugeren. Resuspendeer nanodeeltjes in 0,1 MES buffer.
- Was albumine MB drie keer in PBS ontgast om overtollig BSA te verwijderen uit de oplossing.
- Onmiddellijk conjugaat de geactiveerde deeltjes naar amine-bevattende moleculen (zoals albumine Microbelletjes). Laat NP680 oplossing voor 2 uur reageren bij kamertemperatuur. Zuiver NP680 geconjugeerde microbellen (MNCA) van ongebonden NP680s door driemaal wassen met PBS ontgast.
- Bepaal de concentratie van MNCAs met behulp van een Coulter Counter.
4. Tumor Model
Alle dierproeven in overeenstemming waren met een dier protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Virginia Dierverzorging en gebruik Comite.
- C6 Giloma rat tumor-cellijn werd verzorgd door dr. Jason Sheehan van de UVA (Charlottesville, VA).
- Cellen lijn werd getest om ervoor te zorgen cellen werden mycoplasma vrij.
- Handhaaf de cellijn in F-12K voedingsstoffen Mengsel aangevuld met 16% paard serum, 3% foetaal bovine serum (FBS) en 1% Pen-Strep, (Gibco, USA) bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Inoculeren C57BLJ6/Rag1 muizen (Jackson) met 3 x 10 6 C6 Giloma tumorcellen gesuspendeerd in 300 ul PBS subcutaan in de linker achterbeen. Laat tumor te groeien gedurende 12 dagen tot een maximale diameter van 8-10mm te bereiken.
5. In vivo Ultrasound Application
- Verdoven muizen met een intraperitoneale (IP) combinatie injectie van ketamine hydrochloride (60 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht) voor de behandeling.
- Bereid een onderhoud anestheticum van ketamine hydrochloride (20 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (0,3 mg / kg lichaamsgewicht). Toedienen als dat nodig is.
- Canule de staartader van elk dier voor de intraveneuze (IV) toediening van een MB, MB / NP of MNCA oplossing.
- Tumor perfusie metingen
- IV infuus een lipide MB-oplossing (1x10 8 MB / g lichaamsgewicht in 0,3 ml van 0,9% zoutoplossing) met een snelheid van 15μl/min met een continue infusie pomp (Harvard Apparatus PHD 2000; Harvard Apparatuur, Holliston, MA).
- Een Acuson Sequoia 512 echografie systeem (Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA), uitgerust met een 8 13 MHz lineair 15L8 probe werd gebruikt in deze studie om het contrast versterkt tumor perfusie te kwantificeren. Koppel de 15L8 sonde naar de tumor met een op water gebaseerde ultrasone gel (Parker Laboratories Aquasonic 100; Parker Laboratories, Inc, Fairfield, NJ). Scan de tumor in B-modus om de beste imaging toestel te verkrijgen.
- In tegenstelling pulssequentie (CPS) mode, het verwerven van een continue video vastleggen microbellen intensiteit van het signaal vijf seconden voorafgaand, en 20 na, de high-amplitude "burst" puls op een frame rate van 13Hz. Herhaal de metingen in vier beeldvorming vliegtuigen.
- Wacht tien minuten aan albumine MB bezielen en therapeutische lage frequentie behandeling te starten om lipide MB's aan uit de circulatie.
- Therapeutische ultrasound behandeling
- Tien minuten na tumor perfusie metingen (5.3) paar een 0,75''diameter van 1 MHz ongericht transducer (A314S, Panametrics, Waltham, MA) op de huid boven de flank tumor. IV infuus een albumine MB (1 x 10 5 MB / g lichaamsgewicht in 0,3 ml van 0,9% zoutoplossing), MB / NP (1 x10 5 MB / g en 0,2 ug NP / g lichaamsgewicht in 0,3 ml van 0,9% zoutoplossing) of MNCA-oplossing (1 x10 5 MNCAs / g lichaamsgewicht in 0,3 ml van 0,9% zoutoplossing).
- Drug Delivery behandeling
- Insonate voor zestig minuten met de "een-Burst" pulssequentie (5.4.2.2) tijdens een continue infusie van NP, een co-injectie van MB's en NP's, of MNCAs (5.4.1).
- De "1-Burst" pulserende sequentie bestaat uit 100 opeenvolgende 1 MHz sinusoïden (duty cycle = 0,00002) elk van 1V piek tot-piek amplitude van een golfvorm generator (AFG-310, Tektronix, Inc, Beaverton, OR). Versterken van de golfvorm signaal door een 55 dB RF met een eindversterker (ENI 3100LA; Electronic Navigation Industries, Richardson, TX).
- Ablatieve behandeling
- Identiek aan 5.4.2.1, maar insonate met de "5-Burst-Medium" of "5-Burst - Extended" pulserende sequence
- De "5-Burst-Medium" pulserende sequentie bestaat uit een 5000 MHz sinusoïden (duty cycle = 0,005) elk van 1V piek tot-piek amplitude. De "5-Burst-Exteneded" pulserende sequentie bestaat uit 10.000 1 MHz sinusoïden (duty cycle = 0,01) elk van 1V piek tot-piek amplitude.
- Gedurende de tijd loop van het experiment te controleren tumor temperatuur door het invoegen van een naald thermokoppel (Omega T-type, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2cm in de tumor. De gegevens van temperatuur metingen om de vijf minuten.
- Herhaal de tumor perfusie metingen, zoals beschreven in 5.3 tien minuten na therapeutische behandeling.
6. Tumor Perfusie Kwantificering
- Met behulp van het CPS programma op de Sequoia, voer ACQ-modus. Selecteren ee regio van belang omvat de complete tumor volume. Perfusie herstel curves zullen worden gegenereerd van de vorm y = A (1 - e-βt) + C (Sadlowski 2002; Chromas 2001; Yeh 2004) die geschikt zijn om de CPS-data. Evalueer β, een relatieve maatstaf van de rode bloedcellen snelheid, pre-behandeling en na de behandeling.
- Export CPS-bestanden voor off-line analyse. Omzetten van gegevens in avi-bestanden. Break avi-bestanden in het frame-by-frame image sequenties. Met behulp van Compaq Visual Fortan, of een soortgelijke software pakket, het genereren van een tijd gemiddeld beeld van alle frames van de destructieve puls tot 8 seconden na de vernietigende pols.
- Om te bepalen doorbloed tumor gebied, met behulp van ImageJ software, breng dan een drempel van 247 op de 8-beet tijd gemiddeld CPS beeld en kwantificeren van het percentage verbeterde pixels binnen de tumor volume. Overlay de bijbehorende B-mode beeld met de tijd gemiddelde thresholded afbeelding om nauwkeurig te definiëren tumor gebied.
- Gemiddeld het percentage doorbloede gebied voor een minimum van vier CPS clips om een definitieve doorbloede gebied te krijgen op een bepaald tijdstip voor een bepaalde tumor.
- Neem het product van het percentage geperfuseerde gebied (6,4) en β (0,1) om de relatieve tumor bloedstroom te bepalen.
7. Nanodeeltjes Biodistributie in Tumor
- Twaalf dagen voorafgaand aan de behandeling met fluorescent gelabelde NP's plaats muizen op een laag alfasprot dieet (Harlan, Indianapolis IN) om autofluorescentie veroorzaakt door de normale muis chow bij beeldvorming te verminderen.
- Scheer de beeldvorming site (flank aan de lever) om alle haren te verwijderen.
- Verwijder de resterende haar met een chemische ontharing middel, zoals Nair.
- Spoel van alle resten van het chemische haar remover of een chemische verbranding kan optreden.
- Afbeelding muizen op de FMT-systeem (VisEn Medical) voorafgaand aan de behandeling en 0, 1, 4, en 24 uur na de behandeling, zoals beschreven in 5.4.2.
- Voorafgaand aan de beeldvorming verdoven muizen met een IP combinatie injectie van ketamine hydrochloride (60 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht). Plaats muis op de imaging cartridge. Acquire reflectie beelden in wit licht en fluorescerende modes. Het uitvoeren van TL-tomografische beeldvorming in de VT680-kanaal.
- Gebruik van de FMT software om 3D-reconstructies van de beeldgegevens met behulp van een genormaliseerd Born vergelijking te genereren. Naar aanleiding van de reconstructie, selecteer volumes van belang (VOI's) door het tekenen van een region of interest (ROI's) in alle 3 de beeldvorming vliegtuigen (X, Y, Z). Een gemiddelde TL-waarde en het totale volume en de VOI fluorochroom concentratie, als gevolg van fluorescent gelabelde BSA NP, zullen worden gegenereerd voor VOI's omvattende de voeten en de lever.
8. Tumor Growth Rate
- Evalueer tumorvolume door het nemen van dagelijkse metingen met behulp van digitale kalibers. Bereken de tumor volumes met behulp van een ellipsoïde benadering; V = 1 / 6 π abc. Waar a, b, en c de maximale diameter van de tumor gemeten in drie orthogonale vlakken.
9. Tumor Processing and Analysis
- Zeven dagen na de behandeling euthanaseren dieren. Canule van de linker ventrikel en exsanguinate bloed met 10 ml van 2% heparine Tris CaCl 2 Buffer (0,68 mM) perfusie, gevolgd door 10 ml Tris CaCl 2 Buffer (0,68 mM), elk gedurende 10 minuten bij 100 mmHg.
- Perfusie-fix weefsel met een infuus van 4% paraformaldehyde in PBS (4 ° C) voor 10 minuten op 100 mmHg. Laat monster oplossing voor 60 minuten.
- Accijnzen exemplaren, insluiten in paraffine en snijd ze in 5-micron delen.
- Uitvoeren van standaard hematoxyline-eosine kleuring om histologische veranderingen die zijn opgetreden als gevolg van de ultrasone blootstellingen te evalueren.
- Voor het detecteren van apoptotische cellen, gebruik van een terminal deoxynucleotidyl transferase gemedieerde deoxyuridine trifosfaat nick end labeling (TUNEL) assay (ApoptTag kit, Intergen Co, Norcross, GA, USA).
10. Representatieve resultaten
1. Nanodeeltjes Fabrication (2.0)
- Als dit protocol is goed voorgevormd NP zullen bolvormig, zoals bepaald door scanning electron microkopie (SEM), en hebben een Gaussische verdeling rond 100nm, zoals bepaald door de lichtverstrooiing technieken. Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 1.
2. Gerichte Drug Delivery (5.4.1)
- Op basis van gepubliceerde studies die zijn uitgevoerd in ons laboratorium (Song 2002, Chappell 2008) en niet-gepubliceerde resultaten in figuur 2, ultrasone microbellen vernieling leidt een betere levering van intravasculaire nanodeeltjes om tumorweefsel. We hebben ook aangetoond dat onze MNCA levering techniek resulteert in een verhoogde nanodeeltjes levering onmiddellijk na de behandeling.
3. Tumor Ablation (5.4.3)
- We hebben aangetoond dat langdurige ultrasone microbelletjes vernietiging, bij een relatief lage duty cycles (0,005 tot 0,01), resulteert in een mechanische ablatie van detumor microvasculatuur en regressie van de tumor groei. Als dit protocol is correct wordt uitgevoerd moet men verwachten veranderingen in (i) percentage van de groei van tumoren (figuur 3), (ii) tumor hemodynamiek (figuur 4), (iii) necrotische gebied, en (iv) apoptose.
Figuur 1. Karakterisering van PLAGA nanodeeltjes met BSA. (A) SEM beeld van goed verzonnen nanodeeltjes. (B) SEM-opname van onjuist verzonnen nanodeeltjes.
Figuur 2. (A) Fluorescentie-gemedieerde tomografie (FMT) beelden van ultrageluid behandeld (boven) en met controle behandelde (onder) subcutaan gliomen onmiddellijk na de behandeling met een MNCAs, waar de nanodeeltjes (NP) zijn met 680 fluorescentie-signalen gesuperponeerd op grijsschaal planaire excitatielicht beeld.
Figuur 3. Vertegenwoordiger voudige verandering in de groei van tumoren na microbellen insonation met de vijf-burst uitgebreid pulserende protocol.
Figuur 4. B-Mode (A, C) en het contrast-enhanced echografie (B, D) beelden van een onderhuidse C6 glioma tumor in een muis. In de eerste voorbehandeling beeld (A) de grens van veelal hypoechoic tumor is opgespoord in het blauw. Gemiddelde tijd enhancement na intraveneuze injectie van een contrastmiddel wordt getoond in (B) voorbehandeling. Na de behandeling, voor het contrast injectie, tumor is opnieuw voornamelijk hypoechoic (D). Na het contrast injectie, is er beduidend minder verbetering in de tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen
Canulatie van de muis staartader:
Intraveneuze injectie in de muis staartader kan een uitdagende procedure. Kan echter een staartader katheter sterk verbeteren van de kans op een succesvolle injectie. Om de katheter, herhaaldelijk buigen en weer een 25 gauge naald tot het breekt uit de naaf. Steek het stompe uiteinde in het uiteinde van PE 20 buizen en sluit de verbinding met siliconen lijm. Ter voorbereiding van de katheter voor cannulatie, bevestig een spuit vol met 1% gehepariniseerde zoutoplossing aan de Cather en trekken vloeistof in de dode ruimte van de katheter. Plaats een verdoofde muis op zijn kant, zodat de laterale staartader is in zicht. Verwijden de staart met warm water (105 ° - 110 ° F). Steek de naald in de ader. Als het succesvol is bloed zal meestal gaan de katheter. Controleer of de naald in de ader door het opruimen van de ader met een kleine hoeveelheid zoutoplossing. Maak de katheter op zijn plaats met tape voordat u de spuit met de infusiepomp.
Nanodeeltje resuspensie:
Nanodeeltjes kunnen aggregaat na vriesdrogen. Resuspendeer deeltjes in PBS, herhaaldelijk vortex en met ultrasone trillingen kort (10 sec) in een sonische waterbad. Het is van cruciaal belang om goed te resuspendeer de gevriesdroogde monster. Karakteriseren de suspensie met SEM microscopie en lichtverstrooiing technieken na vriesdrogen en resuspensie.
Eventuele wijzigingen:
In termen van het aanpassen van de nanodeeltjes fabricage-protocol, BSA fungeert als een surrogaat medicijn en kan worden verwisseld voor een veelheid van therapeutische middelen. Afhankelijk van de oplosbaarheid van het therapeutisch middel, kunnen nanodeeltjes worden vervaardigd als een olie-in-water emulsie of als een olie-in-water-in-olie emulsie. Het laden efficiency en vrijgave van het therapeutische middel van PLAGA NP's, kan ook aanzienlijk worden aangepast indien gewenst. Ter verhoging van de laad-efficiëntie, verhoging van de wt / wt het laden van de stof in polymeer dragers via de optimalisatie van de NP fabricage parameters. Voor het aanpassen van de afgiftesnelheid van de therapeutisch middel, variëren de hydrolyse snelheidsconstante via veranderingen in molecuulgewicht en de melkzuur / glycolzuur verhouding van PLAGA. Door talioring zowel de laad-efficiëntie en de snelheid van afgifte van therapeutisch middel, in en uit PLAGA NPs, kan de gewenste lokale concentratie worden geleverd aan weefsel. In termen van het aanpassen van de levering protocol, de meest belangrijke factoren zijn de mate van ultrasone MNCA vernietiging en microvasculaire permeabilisatie. Het is gemeld dat de albumine gepelde microbellen een halfwaardetijd van 1,3 ± 0,69 minuten (gemiddelde ± SD) (Optison 2008) te hebben. Onze hypothese is dat continue infusie-agent en een verlengde echografie applicatie zal de mate van microvessel permeabilisatie te verhogen. Door het vergroten van de behandeling de tijd willen we tijdelijk verhogen permeabilisatie van de microvasculatuur.
De niet-thermische mechanische ablatie-protocol kan worden aangepast door het veranderen van MB concentratie of de echografie piek druk. De verwachting is dat het verhogen van MB concentratie en / of echografie piekdruk zal de mate van beschadiging te verhogen tot het tumorvasculatuur.
Toepassingen:
We zijn het ontwikkelen van technieken om de akoestische vermogen dat nodig is door de transcraniële high-intensity focused ultrasound (HIFU) om het gewenste therapeutische effect te bereiken lager.
Voor een deel als gevolg van complicaties in verband met de behandeling door de schedel en het belang van de omgevende weefsels, thermische tumorweefsel ablatie met een High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) is nog niet bereikt wijdverbreide gebruik ervan als een therapeutische optie voor hersenkanker. Voorlopige conclusies uit de eerste drie patiënten van een klinische trein hebben aangegeven deep brain HIFU behandeling sub-ablatieve focale temperaturen resulteert in craniale verwarming (McDannold 2009). De sleutel tot succes van HIFU als een klinische behandeling voor transcraniële behandeling van hersentumoren is het vermogen om te lokaliseren de levering van akoestische energie om een goed afgebakend gebied. De mogelijkheid om akoestische energie te leveren wordt gecompliceerd door het bot of de lucht-interfaces, zoals de schedel en de vorige chirurgische resecties, in welke fase en macht afwijkingen te genereren als de ultrasone energie wordt verzwakt langs de voortplanting pad (Tanter 1998). Deze afwijkingen vaak bijdragen aan de pre-focale verwarming (McDonnald 2009) en cavitatie in gezonde weefsels.
In de afgelopen jaren heeft het gebruik van microbellen aan het akoestisch vermogen lager voor gerichte, omkeerbare BBB verstoring en tumor ablatie trok veel onderzoek rente (Hynynen 2001, Sheikov 2004, McDannold 2006a, 2006b, Meairs 2005). McDannold et al.. (2006a) hebben aangetoond dat de intravasculaire injectie van microbellen ten tijde van de HIFU behandeling resulteerde in een 91% reductie in detijdgemiddelde akoestisch vermogen drempel voor mechanische schade in vergelijking met controles waarin geen microbellen aanwezig waren, waarin de mogelijke voor het genereren van laesies met een beperkte temperatuurverhoging. Vermindering van de thermische drempel voor laesie vorming op zijn beurt verlaagt de kans op hitte accumulatie in off doelweefsel of bot. Verder is aangetoond dat de intraveneuze toediening van microbellen op het moment van ultrasound behandeling leidt tot voorbijgaande aard, gelokaliseerde, BBB opening met bevoegdheden ongeveer twee orden van grootte lager dan die nodig zijn voor laesie vorming.
Het is het doel van dit werk te echo-microbellen technieken te ontwikkelen om zowel lager het akoestisch vermogen dat nodig is door de transcraniële HIFU en de controle van de mate van microvasculaire permeabilisatie. De twee specifieke therapeutische toepassingen van dit werk in de hersenen gerichte toediening van medicijnen en niet-thermische ablatie. De relatieve niveaus van de verhoogde permeabiliteit en permanente ablatie kan worden gecontroleerd door het aanpassen van een geluidsniveau, afhankelijk van de vraag of de nadruk ligt op verbetering drug delivery, permanent microvasculaire ablatie, of een combinatie van drug delivery en permanente microvasculaire ablatie. Dit potentieel vermogen om te bepalen hoe de microvaten reageren creëert een mogelijkheid om verschillende permutaties van onze behandelingsstrategie voor specifieke transcraniële therapeutische toepassingen te ontwikkelen. Wij geloven dat deze aanpak heeft het potentieel om drastisch te veranderen hoe hersentumoren worden behandeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ondersteund door NIH R01 HL74082, de Hartwell Foundation, en de Focused Ultrasound Surgery Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
- Chappell, J., Song, J., Burke, C., Klibanov, A., Price, R. Targeted delivery of nanoparticles bearing fibroblast growth factor-2 by ultrasonic microbubble destruction for therapeutic arteriogenesis. Small. 10, 1769-1777 (2008).
- Chomas, J. E., Pollard, R., Wisner, E., Ferrara, K. Subharmonic Phase-Inversion for Tumor Perfusion Estimation. IEEE. 2, 1713-1716 (2001).
- Davda, J., Labhasetwar, V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells. Int J Pharm. 233, 51-51 (2002).
- Hynynen, K., McDannolod, N. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Microbubble contrast agent with focused ultrasound to create brain lesions at low power levesl: MR imaging and histological study in rabbits. Radiology. 241, 95-106 Forthcoming.
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: Association with cavitation activity. Phys Med Biol. 51, 793-807 Forthcoming.
- McDannold, N., Clement, G. T., Black, P., Jolesz, F., Hynynen, K. Transcranial magnetic resonance imaging- guided focused ultrasound surgery of brain tumors: initial findings in 3 patients. Neurosurgery. 66, 323-332 (2009).
- Meairs, S., Alonso, A.
- Optison, products insert. , Food and Drug Administration. (2009).
- Sadlowskie, A., Chromas, J., Pollard, R., Bloch, S., Griffey, S., Wisner, W., Ferrara, K. W. Mean Flow Rate and Intergrated Perfusion Estimates Obtained with Contrast-Assisted Ultrasound. IEEE Ultrasonics Symposium. , 1977-1980 (2002).
- Song, J., Chappell, J. C., Qi, M., VanGieson, E. J., Kaul, S., Price, R. J. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. J Am Coll. Cardiol. 39, 726-731 (2002).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of blood-brain barrier opeing induced by ultrasound in the presences of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- Tanter, J., Fink, M. Focusing and steering through absorbing and aberrating layers: Application to ultrasonic propagation through the skull. J Acoust Soc Am. 103, 2403-2410 (1998).
- Yeh, C. K., Kruse, D. E., Lim, M. C., Redline, D. E., Ferrara, K. W. A New High Frequency Destruction/Reperfusion System. IEEE. 1, 433-436 (2003).
