Summary
Insonation של microbubbles היא אסטרטגיה מבטיח אבלציה הגידול במועד, בממוצע סמכויות מופחת אקוסטי, כמו גם עבור משלוח ממוקד של הרפוי. מטרת המחקר הנוכחי היא לפתח נמוך מחזור אולטרסאונד אסטרטגיות פועם nanocarriers על מנת למקסם את אי - אבלציה תרמית כלי הדם ואספקת מטען אל תת עורית C6 gliomas.
Abstract
אנחנו מפתחים מינימלית פולשנית חומר ניגוד גישות טיפוליות microbubble מבוסס שבו permeabilization ו / או אבלציה של microvasculature נשלטים על ידי שינוי פרמטרים אולטרסאונד פועם. באופן ספציפי, אנחנו בודקים אם גישות כאלה עשויים לשמש לטיפול בגידולים ממאירים במוח באמצעות משלוח סמים אבלציה כלי הדם. מחקרים ראשוניים בוצעו כדי לקבוע אם התרופה ממוקדת נושאות משלוח nanoparticle ניתן בהנחייתם של חורבן אולטרסאונד בתיווך של סוכנים "מורכב" המסירה מורכבת 100nm פולי (lactide-Co-glycolide) (PLAGA) חלקיקים שהם דבקו microbubbles הפגיזו אלבומין . אנו מציינים אלה סוכנים כמו microbubble-nanoparticle סוכני מרוכבים (MNCAs). כאשר ממוקד תת עורית C6 gliomas עם אולטרסאונד, צפינו עלייה מיידית של פי 4.6 משלוח nanoparticle בגידולים MNCA שטופלו על גידולים שטופלו microbubbles מנוהל במשותף עם חלקיקים עלייה פי 8.5 על פני אי - טיפול בגידולים. יתר על כן, ביישומים סרטן רבים, אנו מאמינים כי זה עשוי להיות רצוי לבצע משלוח תרופות ממוקדות בשיתוף עם אבלציה של microcirculation את הגידול, אשר יוביל היפוקסיה אפופטוזיס הגידול. לשם כך, אנחנו צריכים לבדוק את היעילות של אבלציה ללא theramal-cavitation המושרה כלי הדם, מראה כי גישה זו מעוררת הפחתה זלוף אפופטוזיס הגידול, עיכוב צמיחה משמעותית, נמק. יחדיו, תוצאות אלה מצביעות על כך הגישה אולטרסאונד במיקוד שלנו יש פוטנציאל להגביר את היעילות הטיפולית על ידי יצירת נמק הגידול באמצעות אבלציה כלי הדם ו / או בעת ובעונה אחת שיפור מטען הסמים gliomas.
Protocol
1. Microbubble הפקה
- כדי להכין microbubbles אלבומין (MBS), במקום פתרון 1% של אלבומין בסרום של מלח רגיל בבקבוק עם שמיכה של גז (octafluoropropane) לעיל בשלב מימית. בקצרה sonicate הפתרון (30 שניות) עם disintegrator אולטרסאונד מצויד מורחבת ½ "בדיקה טיטניום. ניסוח זה דומה Optison (GE Heathcare), אשר סיפק בטווח ריכוז של 0.5-1.2 x 10 9 MBS / ml. קבע מתכוון בקוטר MB עם קולטר Multisizer מונה. מתכוונת אלבומין MB בקוטר השתמשו במחקר זה היה 1.93um ± 1.63um.
- כדי לפברק MBS שומנים בדם, להכין פיזור מימית של stearate 1 polyethyleneglycol-40 מ"ג / מ"ל (סיגמא כימית ושות', סנט לואיס, מיזורי) ו - 2 מ"ג / מ"ל phosphatidylcholine distearoyl (ליפידים אוואנטי פולאר, אלבסטר, AL) ו sonciate כמו בעבר תיאר (1.1) עם גז decafluorobutane. קבע מתכוון בקוטר MB עם מונה Multisizer קולטר. השומנים אומר MB בקוטר השתמשו במחקר זה היה 2.01um ± 1.29um.
2. Nanoparticle ייצור
- שיטות אלו הותאמו מן המים ב-נפט ב-מים אמולסיה טכניקת אידוי הממס שתואר על ידי Davda (2002) ו Chappell (2008).
- הכן 2% פולי (ויניל אלכוהול) פתרון PVA ידי המסת 20 גרם של PVA ב 1000 מ"ל מים (די) deionized. אפשר פתרון מלא לפזר על צלחת ומערבבים לילה. פתרון צנטריפוגה בסל"ד 1000 למשך 10 דקות ולסנן עם מסנן סטרילי 0.22μm להסיר כל PVA שלא נמס שיורית.
- כדי לפברק שור בסרום אלבומין (BSA) טעון פולי (לקטית, חומצה גליקולית שיתוף) (PLAGA), חלקיקים (NPS), לפזר 180mg של הסיר את המיכסה 85:15 PLAGA ב מתילן כלוריד 6ml (MC) ב בקבוקון זכוכית הנצנץ. וורטקס הפתרון MC / PLAGA במשך 2 דקות.
- ממיסים מטען הרצוי (15mg של BSA) ב 1.5 מ"ל של PBS. מוסיפים את פתרון PBS / BSA בשני חלקים לפתרון PLAGA / MC עם vortexing לסירוגין. מקום פתרון קרח 5minutes ו sonicate ב 45W ל 120 שניות.
- הוסף את MC / PLAGA / מטען / פתרון PBS כדי 24ml של 2% PVA, בשני חלקים עם vortexing ביניים.
- הצבת פתרון קרח 5minutes ו sonicate ב 45W ל 120.
- מערבבים את תחליב NP במשך 12 שעות על צלחת ומערבבים במנדף קטר לאפשר אידוי של MC ו NP ייצוב.
- צנטריפוגה ההשעיה עבור 25minutes בסל"ד 20,000 ב 4 ° C פעמיים לבודד NPS ולהסיר PVA שיורית. Resuspend גלולה ב 8ml מים DI ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב RMP 1000 ב 4 ° C כדי לבודד את האוכלוסייה 100nm של NPS.
- לבודד את supernatant ופלאש להקפיא אותו ב -80 ° C. Lyophilize המדגם קפוא במשך 48 שעות. אחסן את חלקיקי lyophilized ב dessicator ב -80 ° C עד למועד השימוש.
3. משלוח מרוכבים ייצור רכב (פרוטוקול עיבוד הערות VisEn כימיה)
- המרת VivoTag680 פונקציונליות משטח carboxy
- שלב one בקבוקון של VivoTag680 עם 50 μL של 1.0 M HEPES, pH 7 ו אנהידריד Succinic (2.5 מ"ג, 25 ìmol) ב DMSO 25 μL. הוסף 50 μL של 1.0 M NaOH לפתרון זה, מעורב באופן יסודי; לאפשר פתרון להגיב למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לטהר חלקיקים באמצעות Bio-Rad BioGel (P100, בינוני) משחררי עם 0.1 M MES חיץ, pH 6.0. אסוף את הלהקה ירוק.
- הפעלת carboxy-שונה VivoTag680
- שלב carboxy-שונה VivoTag680 שהושגו 0.1 M MES חיץ, pH 6, עם 1 מ"ג של 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) ו 2.2 מ"ג של N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS). אפשר להגיב על 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- לטהר חלקיקים מופעל מהסוכן הפעלת עודף (EDC) על ידי הג'ל סינון באמצעות ביו רד BioGel (P100, בינוני) משחררי עם 0.1 M MES חיץ, pH 6.0 לאסוף את הלהקה ירוק. מיד המצומד החלקיקים הופעל על אמין המכילים מולקולות (למשל BSA טעון Nanoparticle). אפשר להגיב פתרון עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. NPS מצומדות אמין היו מטוהרים מן EDC עודף ידי centrifuging בסל"ד 20,000 עבור 60min ב 4 ° C, לשפוך את supernatant לאחר צנטריפוגה ו resuspending במאגר MES 0.1.
- עצור כאן כדי לפברק VivoTag680 NPS מתויג ללימודי משלוח סמים.
- נטיה של carboxy-שונה PLGA-BSA-VivoTag680 חלקיקים (NP680) כדי microbubbles אלבומין
- שלב NP680 שהושגו 0.1 M MES חיץ, pH 6 עם 1 מ"ג של 1-אתיל-3-(3 dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) ו 2.2 מ"ג של N-hydroxy-sulfosuccinimide (Sulfo-NHS). אפשר פתרון להגיב שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- לטהר חלקיקים מופעל על ידי עודף מ EDC centrifuging בסל"ד 20,000 עבור 60min ב 4 ° C, לשפוך את supernatant לאחר צנטריפוגה. Resuspend חלקיקים חיץ MES 0.1.
- לשטוף MBS אלבומין שלוש פעמים PBS degassed להסיר BSA עודף מפתרון.
- מיד המצומד החלקיקים הופעל על אמין המכילים מולקולות (microbubbles אלבומין למשל). אפשר NP680 פתרון להגיב לשעה 2 בטמפרטורת החדר. לטהר NP680 microbubbles מצומדות (MNCA) מ NP680s מאוגד ידי שטיפה שלוש פעמים עם PBS degassed.
- קבע את הריכוז של MNCAs באמצעות מונה קולטר.
4. גידול דגם
כל הניסויים בבעלי חיים היו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי בעל חיים מאוניברסיטת טיפול בבעלי חיים וירג'יניה ועדת שימוש.
- C6 הגידול Giloma עכברוש קו תא סופק על ידי ד"ר ג'ייסון שיהאן של UVA (Charlottesville, VA).
- קו תאים נבדק כדי להבטיח התאים היו חופשיים mycoplasma.
- שמירה על קו תא תערובת F-12k מזין בתוספת סוס בסרום 16%, 3% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% עט דלקת, (Gibco, ארה"ב) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
- לחסן C57BLJ6/Rag1 עכברים (ג'קסון), עם 3 x 10 6 תאים C6 Giloma הגידול תלויה μl 300 של PBS תת עורי ב hindlimb שמאל. אפשר הגידול לגדול במשך 12 ימים כדי להגיע בקוטר מרבי של 8-10mm.
5. ביישום אולטראסאונד Vivo
- הרדימי עכברים עם זריקה (IP) intraperitoneal שילוב של קטמין הידרוכלוריד (60 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ו xylazine (0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף) לפני הטיפול.
- הכן תחזוקה הרדמה של קטמין הידרוכלוריד (20 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ו xylazine (0.3 מ"ג / ק"ג משקל גוף). ניהול לפי הצורך.
- Cannulate את הווריד הזנב של כל חיה לניהול (IV) תוך ורידי של MB, MB / NP או פתרון MNCA.
- זלוף מדידות גידול
- IV להחדיר MB השומנים פתרון (1x10 8 MBS / משקל הגוף גרם 0.3 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%) בשיעור של 15μl/min עם משאבת עירוי מתמשך (הרווארד Apparatus PHD 2000; הרווארד Apparatus, Holliston, MA).
- סקויה Acuson 512 אולטרסאונד המערכת (Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA) מצויד 8 13 MHz ליניארי 15L8 בדיקה נעשה שימוש במחקר זה לכמת זלוף משופרת לעומת הגידול. בני הזוג בדיקה 15L8 לגידול עם ג'ל על בסיס מים אולטרסאונד (פרקר מעבדות Aquasonic 100; פארקר Laboratories, Inc, Fairfield, NJ). סרוק את הגידול במצב-B כדי להשיג את המטוס הדמיה הטוב ביותר.
- בשנת דופק במצב ניגודיות (CPS) רצף, לרכוש לכידת וידאו רציפה microbubbles עוצמת האות 5 שניות לפני ו -20 שלהלן, משרעת גבוהה "פרץ" דופק בקצב מסגרת של 13Hz. חזור על מדידות ארבעה מטוסי הדמיה.
- חכו עשר דקות להחדיר MBS אלבומין וליזום תדירות טיפולי טיפול נמוך כדי לאפשר MBS שומנים כדי לנקות מן הדם.
- אולטראסאונד טיפולית טיפול
- עשר דקות לאחר מדידות זלוף הגידול (5.3) זוג''1 בקוטר 0.75 MHz מתמר ממוקד (A314S; Panametrics, Waltham, MA) על העור מעל הגידול האגף. IV להחדיר MB אלבומין (1 x10 5 MBS / g משקל הגוף ב 0.3 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%), MB / NP (1 x10 5 MBS / g ו - 0.2 NPS UG / g משקל הגוף ב 0.3 מ"ל של 0.9% מלח) או MNCA פתרון (1 x10 5 MNCAs / g משקל הגוף ב 0.3 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%).
- משלוח סמים טיפול
- Insonate שישים דקות עם רצף "1-Burst" דופק (5.4.2.2) במהלך עירוי מתמשך של NPS, שותף הזרקה של MBS ו NPS, או MNCAs (5.4.1).
- "1-Burst" רצף פועם מורכב 100 1 sinusoids ברציפות MHz (מחזור = 0.00002) כל שיא ל-1V שיא המשרעת של מחולל צורת גל (AFG-310; Tektronix, Inc, beaverton, OR). להגביר את האות waveform ידי 55 dB RF עם מגבר כוח (א £ 3100LA; אלקטרונית ניווט תעשיות, ריצ'רדסון, טקסס).
- טיפול פולשני
- זהה 5.4.2.1, insonate זאת עם "5 בינוני-Burst" או "5-Burst - מורחב" רצף פועם
- "5-Burst-Medium" רצף פועם מורכב 5000 1 sinusoids MHz (מחזור = 0.005) כל אחד 1V שיא אל שיא המשרעת. "5-Burst-Exteneded" רצף פועם מורכב 10,000 1 sinusoids MHz (מחזור = 0.01) כל שיא ל-1V שיא המשרעת.
- במהלך תקופה של טמפרטורה את הניסוי לנטר הגידול על ידי החדרת מחט תרמי בדיקה (אומגה T-סוג, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2cm לתוך הגידול. מדידות טמפרטורה שיא כל חמש דקות.
- חזור על מדידות זלוף הגידול כמתואר 5.3 עשר דקות לאחר טיפול רפואי.
6. זלוף גידול כימות
- באמצעות תוכנית CPS על סקויה, להיכנס למצב ACQ. בחירת הדואר האזור עניין המקיף את נפח הגידול להשלים. התאוששות עקומות זלוף יופק של הטופס y = (1 - e-βt) + C (Sadlowski 2002; Chromas 2001; יה 2004), כי הם מתאימים לנתונים CPS. הערכת β, מדד יחסי של מהירות תא דם אדום, טרום הטיפול שלאחר הטיפול.
- ייצוא CPS קבצים לניתוח off-line. המרת הנתונים לתוך קבצי AVI. הפסקת קבצי AVI לתוך מסגרת לפי מסגרת התמונה sequences. שימוש ב-Visual Fortan Compaq, או חבילת תוכנה דומה, ליצור זמן בממוצע תמונה של כל המסגרות של הדופק הרסני 8 שניות לאחר הדופק הרסני.
- כדי לקבוע את אזור הגידול perfused, באמצעות תוכנה ImageJ, להחיל על סף של 247 פעם 8-הנשיכה בממוצע תמונה CPS ולכמת את הפיקסלים אחוז משופר בתוך נפח הגידול. שכבת התמונה המתאימה B-mode עם זמן בממוצע תמונה thresholded להגדיר במדויק את אזור הגידול.
- ממוצע אחוז perfused שטח מינימום של ארבעה קליפים CPS להשיג באזור perfused הסופי בנקודת זמן נתונה על גידול מסוים.
- קח את המוצר של האזור perfused אחוזים (6.4) ו - β (0.1) כדי לקבוע יחסית זרימת הדם לגידול.
7. Nanoparticle biodistribution בגידול
- שנים עשר ימים לפני הטיפול עם שכותרתו fluorescently עכברים NPS מקום בדיאטה alfasprot נמוכה (הארלן, אינדיאנפוליס IN) כדי להפחית autofluorescence הנגרמת על ידי עכבר רגיל לאכול, כאשר הדמיה.
- לגלח את האתר הדמיה (האגף אל הכבד) כדי להסיר את כל השיער.
- הסרת שיער שיורית עם סוכן הסרת שיער כימיים, כגון נאיר.
- יש לשטוף את כל שאריות מסיר שיער כימיים או כוויה כימית עלולה להתרחש.
- תמונה עכברים במערכת FMT (VisEn רפואי) לפני הטיפול על גבי שעות 0, 1, 4 ו 24 לאחר טיפול כמתואר 5.4.2.
- לפני עכברים הדמיה להרדים בזריקה שילוב IP של קטמין הידרוכלוריד (60 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ו xylazine (0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף). המקום העכבר על המחסנית הדמיה. לרכוש תמונות ההחזרה של אור לבן מצבי ניאון. ביצוע פלורסנט הדמיה טומוגרפית בערוץ VT680.
- להעסיק את התוכנה FMT ליצור 3D שחזורים של נתוני הדמיה ניצול משוואה נולד מנורמל. לאחר השחזור, בחר כרכים של עניין (VOI של) ע"י ציור אזור של אינטרס (ROI של) בכל 3 מטוסים דימות (X, Y, Z). ערך פלורסנט מתכוון נפח VOI הכולל ריכוז fluorochrome, בשל מתויג fluorescently BSA NPS, יופק עבור VOI של המקיף את הרגליים והכבד.
8. שיעור הגידול
- הערכת נפח הגידול על ידי שימוש במדידות יומי בקליבר הדיגיטלי. חישוב נפח הגידול באמצעות קירוב אליפסה: V = abc π 1 / 6. איפה a, b, ו-c הם בקטרים המקסימלי של הגידול נמדד בשלושה מישורים אורתוגונליים.
9. עיבוד וניתוח הגידול
- שבעה ימים לאחר הטיפול להרדים חיות. Cannulate החדר השמאלי הדם ולגרום לדימום מחודש עם 10 מ"ל של 2% Heparinized טריס CaCl 2 חוצץ (0.68 mM) זלוף, ואחריו מאגר 10ml טריס CaCl 2 (0.68 מ"מ), כל 10 דקות ב 100 מ"מ כספית.
- זלוף, לתקן רקמות עם עירוי של paraformaldehyde 4% PBS (4 ° C) עבור 10minutes על 100 מ"מ כספית. אפשר לתקן את המדגם עבור 60 דקות.
- דגימות והבלו, להטביע פרפין, וחותכים 5 מיקרון חלקים.
- בצע צביעה רגילה hematoxylin-eosin כדי להעריך את השינויים היסטולוגית, אשר ייתכן שאירעו כתוצאה של חשיפות אולטרסאונד.
- כדי לזהות תאים אפופטוטיים, השתמש במסוף deoxynucleotidyl deoxyuridine transferase בתיווך טריפוספט סוף הכינוי תיוג (TUNEL) assay (ApoptTag הערכה, Intergen ושות' Norcross, ג'ורג'יה, ארה"ב).
10. נציג תוצאות
1. Nanoparticle ייצור (2.0)
- אם זה פרוטוקול preformed כראוי NPS תהיה צורה כדורית, כפי שנקבע על ידי סריקת אלקטרונים microcopy (SEM), ויש להם הפצה גאוס סביב 100nm, כפי שנקבע על ידי טכניקות פיזור אור. תוצאות נציג מוצגים באיור 1.
2. משלוח סמים ממוקד (5.4.1)
- בהתבסס על מחקרים שפורסמו שבוצעו במעבדה שלנו (שיר 2002, Chappell 2008) והתוצאות פורסמו להציג באיור 2, קולי תוצאות ההרס microbubble במשלוח משופרת של חלקיקים intravascular לרקמת הגידול. הראינו גם כי MNCA שלנו טכניקת המסירה התוצאות משלוח nanoparticle מוגברת מיד לאחר הטיפול.
3. גידול אבלציה (5.4.3)
- הראינו כי ממושך הרס microbubble קולי, על מחזורי חובה נמוכה יחסית (0.005-0.01), התוצאות אבלציה מכניות שלmicrovasculature רגרסיה הגידול של הגידול. אם זה פרוטוקול מבוצע כראוי יש לצפות לשינויים (i) שיעור הגידול (איור 3), (ii) hemodynamics הגידול (איור 4), (iii) אזור נמקי וכן (iv) אפופטוזיס.
באיור 1. אפיון PLAGA חלקיקים נושאי BSA. (א) SEM תמונה של חלקיקים מפוברק כראוי. (ב) SEM תמונה של חלקיקים מפוברק כראוי.
איור 2. (א) Fluorescence בתיווך טומוגרפיה (FMT) תמונות אולטרסאונד של מטופלים (למעלה) ושליטה מטופלים (התחתון) תת עורית gliomas מיד לאחר הטיפול עם MNCAs, שבו חלקיקים (NPS) הן נושאות 680 אותות הקרינה הן על גבי אפור מישוריים אור עירור התמונה.
איור 3. לשנות לקפל נציג הגידול הבאים insonation microbubble עם פרוטוקול חמש פרץ הפועם המורחבת.
איור 4. B-Mode (A, C) בניגוד משופרת אולטרסאונד (B, D) תמונות של גידול C6 glioma תת עורית של עכבר. בתמונה המקדים הראשוני (א) הגבול של הגידול hypoechoic בעיקר כבר איתר בכחול. ממוצע זמן שיפור לאחר הזרקה תוך ורידית של סוכן בניגוד מוצג המקדים (B). לאחר הטיפול, לפני הזריקה, לעומת זאת, הגידול שוב hypoechoic בעיקר (ד '). לאחר ההזרקה לעומת זאת, יש שיפור משמעותי פחות בגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קריטי שלבים
Cannulation וריד הזנב של העכבר:
הזרקה תוך ורידי לווריד זנב עכבר יכול להיות הליך מאתגר. עם זאת, קטטר וריד הזנב יכול לשפר באופן משמעותי את הסיכוי של זריקה מוצלחת. כדי להפוך את הקטטר, לכופף שוב ושוב הלוך ושוב מחט מד 25 עד שהוא נשבר מהרכזת. הכנס את הקצה אל הקצה הקהה של 20 צינורות PE ו לאטום את החיבור עם דבק סיליקון. כדי להכין את הקטטר עבור cannulation, לצרף מזרק עמוס 1% heparinized מלוחים קאתר ו להחדיר נוזלים לתוך החלל המת של הקטטר. מיקום העכבר הרדים על צידו כך וריד הזנב לרוחב היא בתצוגה. להרחיב את הזנב עם מים חמים (105 ° - 110 ° F). הכנס את המחט לתוך הווריד. אם דם מוצלח בדרך כלל להזין את הקטטר. ודא כי המחט היא ברוח ידי ניקוי וריד עם כמות קטנה של מלח. Secure את הקטטר במקום עם הקלטת לפני הצמדת מזרק כדי לשאוב את העירוי.
Nanoparticle Resuspension:
חלקיקים עשויים lyophilization הבאים במצטבר. חלקיקים Resuspend ב-PBS, בקצרה מערבולת שוב ושוב sonicate (10 שניות) באמבט מים קוליים. זה קריטי שצריך resuspend המדגם lyophilized. לאפיין את ההשעיה עם במיקרוסקופ SEM ופיזור אור בטכניקות הבאות lyophilization ו resuspension.
שינויים אפשריים:
מבחינת התאמת פרוטוקול ייצור nanoparticle, BSA משמש כתרופה פונדקאית ניתן להחלפה עבור מספר רב של סוכני טיפולית. בהתאם מסיסות של הסוכן הטיפולי, חלקיקים יכול להיות מפוברק כמו תחליב שמן בתוך מים או תחליב שמן ב-מים בתוך שמן. יעילות העמסה שחרורו של הסוכן הטיפולי מ PLAGA NPS, עשוי גם להיות מותאם באופן משמעותי אם תרצה בכך. כדי להגביר את היעילות טוען, להגדיל את הטעינה wt / wt של התרופה נשאים פולימרים באמצעות אופטימיזציה של הפרמטרים NP ייצור. כדי להתאים את קצב שחרור הסוכן הטיפולי, לשנות את קצב הידרוליזה קבוע דרך שינויים משקל מולקולרי ויחס לקטית / גליקולית של PLAGA. עד talioring הן יעילות העמסה שיעור שחרורו של הסוכן הטיפולי, ומתוך PLAGA NPS, ריכוז המקומית הרצויה ניתן יהיה להעביר את רקמות. מבחינת התאמת פרוטוקול המסירה, הגורמים החשובים ביותר הם מידת ההרס MNCA קולי ו permeabilization כלי הדם. זה כבר דווח כי microbubbles הפגיזו אלבומין יש זמן מחצית חיים של 1.3 ± 0.69 דקות (ממוצע ± סטיית תקן) (Optison 2008). אנו משערים כי עירוי סוכן רציפה יישום אולטרסאונד ממושכת תגדיל את היקף permeabilization microvessel. בזמן הטיפול הגדלת אנו שואפים להגביר transiently permeabilization של microvasculature.
פרוטוקול אי - אבלציה תרמית מכני יכול להיות מותאם על ידי שינוי ריכוז MB או את הלחץ לשיא אולטרסאונד. צפוי כי הגדלת ריכוז MB ו / או שיא הלחץ אולטרסאונד יגדיל את מידת הפגיעה בכלי הדם של הגידול.
יישומים:
אנחנו מפתחים טכניקות כדי להקטין את כוח אקוסטי נדרש על ידי אולטרסאונד ממוקדת בעוצמה גבוהה transcranial (HIFU) להשיג את האפקט הטיפולי הרצוי.
בין השאר, בשל סיבוכים הקשורים לטיפול דרך הגולגולת ואת החשיבות של הסביבה, רקמה אבלציה תרמית גידול רקמות בעוצמה גבוהה אולטרסאונד ממוקד (HIFU) לא השיגה עדיין בשימוש נרחב כאופציה טיפולית בסרטן המוח. מסקנות ראשוניות של שלושת החולים הראשונים של רכבת קליניים הראו עמוק במוח HIFU הטיפול משנה פולשני תוצאות בטמפרטורות מוקדי חימום גולגולתי (McDannold 2009). המפתח להצלחה של HIFU כטיפול קליניים לטיפול transcranial של גידולים במוח היא היכולת למקם את אספקת האנרגיה האקוסטית לאזור התחום היטב. היכולת לספק אנרגיה אקוסטי מסובך ידי ממשקים העצם או אוויר, כגון הגולגולת כריתות כירורגיות קודמות, אשר יוצרים סטיות שלב וכוח כמו אנרגיית אולטרא סאונד הוא נחלש לאורך השביל התפשטות (Tanter 1998). סטיות אלה לעתים קרובות לתרום לחימום מראש מוקד (McDonnald 2009) ו cavitations ברקמות הבריאות.
בשנים האחרונות, השימוש microbubbles להנמיך את העוצמה אקוסטי ממוקד עבור הפרעה, BBB הפיך אבלציה הגידול משכה עניין רב במחקר (Hynynen 2001, Sheikov 2004, McDannold 2006a, 2006b, Meairs 2005). McDannold et al. (2006a) הראו כי הזרקת intravascular של microbubbles בזמן טיפול HIFU הביא לירידה של 91% בזמן ממוצע סף כוח אקוסטי לכל נזק מכני בהשוואה לקבוצת הביקורת אשר microbubbles לא היו נוכחים, מראה את הפוטנציאל ליצירת נגעים עם העלאת הטמפרטורה מופחת. הפחתת סף תרמית להיווצרות הנגע בתורו מוריד את ההסתברות של הצטברות חום ברקמת העצם מעל היעד או. יתרה מזאת, הוכח כי עירוי לוריד של microbubbles בזמן הטיפול תוצאות אולטרסאונד בפתיחת חולף, מקומי BBB, עם סמכויות כ בשני סדרי הבהירויות נמוכים מאלה הדרושים להיווצרות הנגע.
זוהי המטרה של עבודה זו לפתח אולטרסאונד-microbubbles טכניקות לשלטון הן אקוסטי התחתון הנדרש על ידי HIFU transcranial ושליטה מידת permeabilization כלי הדם. שני יישומים טיפולית ספציפית של עבודה זו במוח ממוקדות משלוח סמים ולא אבלציה תרמית. הרמות היחסית של חדירות מוגברת אבלציה קבוע יכול להיות נשלט על ידי התאמת רמות הספק אקוסטי תלוי אם הדגש הוא על משלוח סמים משופרת, אבלציה כלי הדם קבע, או שילוב של משלוח סמים אבלציה כלי הדם קבע. יכולת זו פוטנציאל לשלוט microvessels להגיב יוצר הזדמנות לפתח פרמוטציות שונות של אסטרטגיית הטיפול שלנו עבור יישומים ספציפיים טיפוליות transcranial. אנו מאמינים בגישה זו יש פוטנציאל לשנות באופן דרסטי איך גידולים במוח מטופלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
נתמך על ידי NIH R01 HL74082, קרן Hartwell, כירורגיה התמקדה הקרן אולטראסאונד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
- Chappell, J., Song, J., Burke, C., Klibanov, A., Price, R. Targeted delivery of nanoparticles bearing fibroblast growth factor-2 by ultrasonic microbubble destruction for therapeutic arteriogenesis. Small. 10, 1769-1777 (2008).
- Chomas, J. E., Pollard, R., Wisner, E., Ferrara, K. Subharmonic Phase-Inversion for Tumor Perfusion Estimation. IEEE. 2, 1713-1716 (2001).
- Davda, J., Labhasetwar, V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells. Int J Pharm. 233, 51-51 (2002).
- Hynynen, K., McDannolod, N. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Microbubble contrast agent with focused ultrasound to create brain lesions at low power levesl: MR imaging and histological study in rabbits. Radiology. 241, 95-106 Forthcoming.
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: Association with cavitation activity. Phys Med Biol. 51, 793-807 Forthcoming.
- McDannold, N., Clement, G. T., Black, P., Jolesz, F., Hynynen, K. Transcranial magnetic resonance imaging- guided focused ultrasound surgery of brain tumors: initial findings in 3 patients. Neurosurgery. 66, 323-332 (2009).
- Meairs, S., Alonso, A.
- Optison, products insert. , Food and Drug Administration. (2009).
- Sadlowskie, A., Chromas, J., Pollard, R., Bloch, S., Griffey, S., Wisner, W., Ferrara, K. W. Mean Flow Rate and Intergrated Perfusion Estimates Obtained with Contrast-Assisted Ultrasound. IEEE Ultrasonics Symposium. , 1977-1980 (2002).
- Song, J., Chappell, J. C., Qi, M., VanGieson, E. J., Kaul, S., Price, R. J. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. J Am Coll. Cardiol. 39, 726-731 (2002).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of blood-brain barrier opeing induced by ultrasound in the presences of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- Tanter, J., Fink, M. Focusing and steering through absorbing and aberrating layers: Application to ultrasonic propagation through the skull. J Acoust Soc Am. 103, 2403-2410 (1998).
- Yeh, C. K., Kruse, D. E., Lim, M. C., Redline, D. E., Ferrara, K. W. A New High Frequency Destruction/Reperfusion System. IEEE. 1, 433-436 (2003).
