Summary
Insonation av mikrobubblor är en lovande strategi för att tumören ablation med reducerad time average akustiska befogenheter, liksom för de riktade leverans av läkemedel. Syftet med denna studie är att utveckla låg intermittens ultraljud pulserande strategier och nanocarriers att maximera icke-termisk mikrovaskulära ablation och nyttolast leverans till subkutan C6 gliom.
Abstract
Vi utvecklar minimalinvasiv kontrastmedel mikrobubblor baserade terapeutiska metoder, där permeabilization och / eller ablation av mikrocirkulation styrs av olika ultraljud pulserande parametrar. Närmare bestämt är vi testa om dessa metoder kan användas för att behandla elakartade hjärntumörer hjälp av drug delivery-och mikrovaskulära ablation. Preliminära studier har gjorts för att fastställa om målstyrning av läkemedel räntebärande nanopartiklar leverans kan underlättas genom ultraljud medierad förstörelsen av "komposit" leverans agenter består av 100 nm poly (laktid-co-glycolide) (PLAGA) nanopartiklar som följs albumin skalade mikrobubblor . Vi betecknar dessa agenter som mikrobubblor-nanopartiklar komposit medel (MNCAs). När det riktas till subkutan C6 gliom med ultraljud, konstaterade vi en omedelbar 4,6-faldig ökning av nanopartiklar leverans MNCA behandlade tumörer över tumörer behandlas med mikrobubblor administreras samtidigt med nanopartiklar och en 8,5-faldig ökning över icke-behandlade tumörer. I många cancer applikationer, anser vi att det kan vara önskvärt att genomföra målstyrning av läkemedel i samband med ablation av tumören mikrocirkulationen, vilket kommer att leda till tumör hypoxi och apoptos. För detta ändamål har vi testat effekten av icke-theramal kavitation-inducerad mikrovaskulära ablation, som visar att detta tillvägagångssätt framkallar tumörer perfusion minskning, apoptos, betydande tillväxthämning, och nekros. Sammantaget indikerar dessa resultat att våra ultraljud-målinriktad strategi har potential att öka terapeutiska effektiviteten genom att skapa tumörnekros genom mikrovaskulära ablation och / eller samtidigt öka drogen nyttolasten i gliom.
Protocol
1. Mikrobubblor Produktion
- För att förbereda albumin mikrobubblor (MBS), placera en 1% lösning av serumalbumin vid normal saltlösning i en kolv med ett täcke av gas (octafluoropropane) ovanför vattenfasen. Kortfattat Sonikera lösningen (30 sek) med ett ultraljud Disintegrator utrustad med en förlängd ½ "titan sonden. Denna formulering liknar Optison (GE Alla produkter och lösningar), som tillhandahålls i en koncentration rad 0,5 till 1,2 x 10 9 MB / ml. Bestäm medelvärde MB diameter med en Multisizer Coulter Counter. Det albumin menar MB diameter som används i denna studie var 1.93um ± 1.63um.
- Att tillverka lipid MB, förbereda en vattenlösning av 1 mg / ml polyetylenglykol-40 stearat (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) och 2 mg / ml distearoyl fosfatidylkolin (Avanti Polar Lipider, Alabaster, AL) och sonciate som tidigare beskrivits (1,1) med decafluorobutane gas. Bestäm medelvärde MB diameter med en Multisizer Coulter Counter. Den genomsnittliga lipid MB diameter som används i denna studie var 2.01um ± 1.29um.
2. Nanopartiklar Fabrication
- Dessa metoder var anpassade från vatten-i-olja-i-vatten emulsion lösningsmedelsavdunstning teknik som beskrivs av Davda (2002) och Chappell (2008).
- Bered en 2% Poly (vinylalkohol) PVA-lösning genom att lösa 20 g PVA i 1000 ml avjoniserat (DI) vatten. Låt lösningen att helt upplösa den uppståndelse tallrik över en natt. Centrifugera lösningen vid 1000 rpm i 10 minuter och filtrera med ett 0.22μm sterilt filter för att ta bort eventuella oupplösta PVA.
- Att fabricera bovint serumalbumin (BSA) lastad poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLAGA) nanopartiklar (NPS), lös 180mg av de icke-begränsade 85:15 PLAGA i 6 ml metylenklorid (MC) i glas scintillation injektionsflaska. Vortex MC / PLAGA lösning i 2 minuter.
- Lös önskat nyttolast (15 mg BSA) i 1,5 ml PBS. Tillsätt PBS / BSA lösning i två delar PLAGA / MC-lösning med intermittent vortexa. Placera lösningen på is för 5minutes och Sonikera på 45W i 120 sekunder.
- Lägg till MC / PLAGA / last / PBS lösning 24ml på 2% PVA, i två delar med mellanliggande vortexa.
- Placera lösningen på is 5minutes och Sonikera på 45W för 120.
- Rör om NP emulsion 12 timmar på ett rör plattan i ett dragskåp att tillåta avdunstning av MC och NP stabilisering.
- Centrifugera suspensionen för 25minutes på 20.000 rpm vid 4 ° C två gånger för att isolera nationella parlamenten och ta bort rester av PVA. Återsuspendera pelleten i 8ml av DI-vatten och centrifugera i 10 minuter vid 1000 RMP vid 4 ° C för att isolera 100 nm befolkning NPS.
- Isolera supernatanten och blixt frysa det vid -80 ° C. Lyophilize den frusna provet för 48 timmar. Förvara det frystorkade partiklar i en exsickator vid -80 ° C tills de ska användas.
3. Komposit leveransfordon Fabrication (protokoll Anpassad från VisEn kemi Notes)
- Konvertering av VivoTag680 att karboxi ytan funktionalitet
- Kombinera en flaska VivoTag680 med 50 mikroliter av 1,0 M HEPES, pH 7 och bärnstenssyra anhydride (2,5 mg, 25 ìmol) i 25 mikroliter DMSO. Tillsätt 50 mikroliter av 1,0 M NaOH till denna lösning, blandas noggrant, gör lösningen att reagera i 2 timmar i rumstemperatur skyddat för ljus. Rena partiklar med hjälp av Bio-Rad Biogel (P100, medium) eluerande med 0,1 M MES buffert, pH 6,0. Samla det gröna bandet.
- Aktivering av karboxi-modifierade VivoTag680
- Kombinera karboxi modifierade VivoTag680 erhållits i 0,1 M MES buffert, pH 6, med 1 mg 1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) och 2,2 mg N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS). Låt verka i 2 timmar i rumstemperatur.
- Rena aktiveras partiklar från överskott aktiveringsmedel (EDC) med gel filtreringen med hjälp av Bio-Rad Biogel (P100, medium) eluerande med 0,1 M MES buffert, pH 6,0 och samla det gröna bandet. Omedelbart konjugat den aktiverade partiklarna amin-innehållande molekyler (t.ex. BSA-laddad nanopartiklar). Låt lösningen att reagera i 2 timmar i rumstemperatur. Amine konjugerade nationella parlamenten skulle renas från över EDC genom centrifugering på 20.000 rpm för 60min vid 4 ° C, hälla bort supernatanten efter centrifugering och resuspending i 0,1 MES buffert.
- Stanna här för att fabricera VivoTag680 taggade nationella parlamenten för studier drug delivery.
- Konjugering av karboxi-modifierad PLGA-BSA-VivoTag680 Nanopartiklar (NP680) till albumin bubblor
- Kombinera NP680 erhållits i 0,1 M MES buffert, pH 6 med 1 mg 1-Ethyl-3-(3 dimetylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) och 2,2 mg N-hydroxi-sulfosuccinimide (Sulfo-NHS). Låt lösningen reagera under 1 timme i rumstemperatur.
- Rena aktiveras nanopartiklar från överskott EDC genom centrifugering på 20.000 rpm för 60min vid 4 ° C, hälla bort supernatanten efter centrifugering. Resuspendera nanopartiklar i 0,1 MES buffert.
- Tvätta albumin MB tre gånger i avgasad PBS för att avlägsna överskott BSA från lösningen.
- Omedelbart konjugat den aktiverade partiklarna amin-innehållande molekyler (t.ex. albumin mikrobubblor). Låt NP680 lösning att reagera för 2 timme i rumstemperatur. Rena NP680 konjugerade mikrobubblor (MNCA) från obundet NP680s genom att tvätta tre gånger med avgasade PBS.
- Bestäm koncentrationen av MNCAs med hjälp av en Coulter Counter.
4. Tumör Modell
Alla djurförsök var förenliga med ett djur protokoll godkändes av University of Virginia Djurvård och användning kommittén.
- C6 Giloma råtta tumörcellen har tillhandahållits av Dr Jason Sheehan av UVA (Charlottesville, VA).
- Celler linjen testades för att se celler mykoplasma gratis.
- Behålla den cellinje i F-12K näringsämnen Blandning kompletteras med 16% häst serum, 3% fetalt bovint serum (FBS) och 1% Pen-Strep, (Gibco, USA) vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Inokulera C57BLJ6/Rag1 möss (Jackson) med 3 x 10 6 C6 Giloma tumörceller upphängd i 300 l av PBS subkutant i vänstra bakdelen. Låt tumören att växa i 12 dagar för att nå en maximal diameter på 8-10mm.
5. In Vivo Ultraljud Ansökan
- Bedöva möss med en intraperitoneal (IP) kombination injektion av ketamin hydroklorid (60 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (0,1 mg / kg kroppsvikt) före behandling.
- Förbered en underhåll bedövningsmedel av ketamin hydroklorid (20 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (0,3 mg / kg kroppsvikt). Administrera som behövs.
- Cannulate svansen ven för varje djur för intravenös (IV) administrering av en MB, MB / NP eller MNCA lösning.
- Tumör perfusion mätningar
- IV ingjuta en lösning lipid MB (1x10 8 MB / g kroppsvikt i 0,3 ml 0,9% koksaltlösning) i en takt av 15μl/min med en infusionspump (Harvard Apparater PHD 2000, Harvard Apparatur, Holliston, MA).
- En Acuson Sequoia 512 ultraljud systemet (Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA) utrustad med en 8 13 MHz linjär 15L8 sond användes i denna studie för att kvantifiera kontrastförstärka tumör perfusion. Par i 15L8 sonden till tumören med en vattenbaserad ultraljud gel (Parker Laboratories Aquasonic 100, Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ). Scan tumören i B-läge för att få bästa avbildning planet.
- I motsats pulssekvens (CPS) läge, skaffa en kontinuerlig video fånga mikrobubblor signalstyrka 5 sekunder före och 20 efter, med hög amplitud "burst" puls på en bildfrekvens på 13Hz. Upprepa mätningar i fyra avbildning plan.
- Vänta tio minuter för att ingjuta albumin MB och initiera terapeutisk lågfrekvent behandling för att lipid MB för att rensa ur cirkulationen.
- Terapeutiska ultraljudsbehandling
- Tio minuter efter tumör perfusion mätningar (5,3) paret en 0,75''diameter 1 MHz ofokuserad givare (A314S, Panametrics, Waltham, MA) på huden ovanför flanken tumören. IV ingjuta en albumin MB (1 x10 5 MB / g kroppsvikt i 0,3 ml 0,9% koksaltlösning), MB / NP (1 x10 5 MB / g och 0,2 NP ug / g kroppsvikt i 0,3 ml 0,9% koksaltlösning) eller MNCA lösning (1 x10 5 MNCAs / g kroppsvikt i 0,3 ml 0,9% koksaltlösning).
- Drug Delivery Behandling
- Insonate för sextio minuter med "1-Burst" pulssekvens (5.4.2.2) under en kontinuerlig infusion av NPS, en co-injektion av MBS och NPS, eller MNCAs (5.4.1).
- "1-Burst" pulserande sekvens består av 100 rad 1 MHz sinus (duty cycle = 0,00002) varje 1V topp till-topp amplitud från en vågform generator (AFG-310, Tektronix, Inc., Beaverton, OR). Förstärka vågform signal genom ett 55 dB RF med ett slutsteg (ENI 3100LA, Electronic Navigation Industries, Dallas, TX).
- Ablativ behandling
- Identisk med 5.4.2.1, dock insonate med "5-Burst-Medium" eller "5-Burst - Extended" pulserande sekvens
- Den "5-Burst-Medium" pulserande sekvens består av 5000 1 MHz sinus (duty cycle = 0,005) respektive 1V topp till-topp amplitud. Den "5-Burst-Exteneded" pulserande sekvens består av 10000 1 MHz sinus (duty cycle = 0,01) respektive 1V topp till-topp amplitud.
- Under den tid under försöket monitorn tumören temperaturen genom att sätta en nål termoelement givare (Omega T-typ, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2cm in i tumören. Spela temperaturmätningar var femte minut.
- Upprepa tumör perfusion mätningar som beskrivs i 5,3 tio minuter efter terapeutisk behandling.
6. Tumör perfusion Kvantifiering
- Använda CPS programmet på Sequoia anger ACQ läge. Välj the regionen av intresse som omfattar hela tumören volym. Perfusion återhämtning kurvor kommer att genereras av formen y = A (1 - e-βt) + C (Sadlowski 2002; Chromas 2001, Yeh 2004) som passar till CPS-data. Utvärdera β, ett relativt mått på röda blodkroppar hastighet, förbehandling och efterbehandling.
- Exportera CPS-filer för off-line analys. Omvandla data till AVI-filer. Bryt avi filer till bildruta för bildruta bildsekvenser. Använda Compaq Visual Fortan eller liknande programpaket, generera en tid genomsnitt bild av alla ramar från den destruktiva puls till 8 sekunder efter det destruktiva puls.
- För att avgöra perfusion tumörområdet, med hjälp av ImageJ programvara, tillämpar ett tröskelvärde på 247 till 8-bits tiden genomsnitt CPS bild och kvantifiera procent förbättrade pixlar i tumören volym. Overlay motsvarande B-mode bilden med tiden genomsnitt thresholded bilden för att exakt definiera tumörområdet.
- Genomsnitt procent perfusion området i minst fyra CPS klipp att framställa en slutlig perfusion område vid en given tidpunkt för en viss tumör.
- Ta en produkt av procent perfusion area (6,4) och β (0,1) för att bestämma relativ tumör blodflödet.
7. Nanopartikel biodistribution i tumör
- Tolv dagar innan behandling med fluorescerande nationella parlamenten plats möss på en låg alfasprot diet (Harlan, Indianapolis IN) för att minska autofluorescens orsakas av vanlig mus chow när avbildning.
- Raka imaging plats (flanken till levern) att ta bort alla hår.
- Ta bort rester av hår med en kemisk hårborttagning agent, som Nair.
- Skölj av alla kvarvarande kemiska hår remover eller kemiska brännskador kan uppstå.
- Bild möss på FMT systemet (VisEn Medical) före behandling och 0, 1, 4 och 24 timmar efter behandling enligt beskrivningen i 5.4.2.
- Innan avbildning söva möss med en IP-kombination injektion av ketamin hydroklorid (60 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (0,1 mg / kg kroppsvikt). Placera musen på bildbehandlingspatron. Förvärva reflektans bilder i vitt ljus och fluorescerande lägen. Utför fluorescerande tomografiska avbildning i VT680 kanal.
- Anställa FMT programvara för att generera 3D-rekonstruktioner av bilddata använder en normaliserad Född ekvation. Efter återuppbyggnaden, välj volymer av intresse (VOI s) genom att dra en region av intresse (ROI s) i alla 3 imaging plan (X, Y, Z). En genomsnittlig fluorescerande värde och total VOI volym och fluorokrom koncentration, på grund av fluorescerande taggade BSA NPS, kommer att skapas för VOI s omfattar fötter och levern.
8. Tumörtillväxt Rate
- Utvärdera tumörvolymen genom dagliga mätningar med hjälp av digitala kalibrar. Beräkna tumören volymer med en ellipsoid approximation, V = 1 / 6 π ABC. Där a, b och c är den största diameter av tumören mätt i tre rätvinkliga plan.
9. Tumör Bearbetning och analys
- Sju dagar efter djuren behandlas euthanize. Cannulate vänster kammare och exsanguinate blod med 10 ml 2% hepariniserad Tris CaCl 2 Buffer (0,68 mM) perfusion, följt av 10 ml Tris CaCl 2 Buffer (0,68 mM), var i 10 minuter vid 100 mmHg.
- Perfusion-fix vävnad med en infusion av 4% paraformaldehyd i PBS (4 ° C) i 10 minuters på 100 mmHg. Tillåt prov att fixa i 60 minuter.
- Punktskatter prover, bädda in på paraffin, och skuren i 5-mikron sektioner.
- Utför vanliga hematoxylin-eosin färgning att utvärdera histologiska förändringar som kan ha uppstått som ett resultat av ultraljud exponeringar.
- För att upptäcka apoptotiska celler, använder en terminal deoxynucleotidyl transferas deoxiuridin trifosfat nick slutet märkning (Tunel) analys (ApoptTag kit, Intergen Co, Atlanta, GA, USA).
10. Representativa resultat
1. Nanopartiklar Fabrication (2,0)
- Om detta protokoll är förformad korrekt nationella parlamenten kommer att vara klotformig, som bestäms av skanning elektron microcopy (SEM) och har en normalfördelning runt 100 nm, som bestäms av ljusspridning tekniker. Representativa resultat visas i figur 1.
2. Targeted Drug Delivery (5.4.1)
- Baserat på publicerade studier som utförts i vårt laboratorium (Song 2002, Chappell 2008) och opublicerade resultat som finns i figur 2, ultraljud mikrobubblor förstörelsen leder till ökad leverans av intravaskulär nanopartiklar till tumörvävnad. Vi har också visat att våra MNCA utsändningsteknik resulterar i ökad nanopartiklar leverans omedelbart efter behandling.
3. Tumör Ablation (5.4.3)
- Vi har visat att långvarig ultraljud mikrobubblor förstörelse, på relativt låga driftcykler (0,005-0,01), resulterar i mekanisk ablation avtumör mikrocirkulation och regression av tumörtillväxt. Om detta protokoll utförs på rätt sätt bör man förvänta sig förändringar i (i) graden av tumörtillväxt (Figur 3), (ii) tumör hemodynamik (Figur 4), (iii) nekrotiska området, och (iv) apoptos.
Figur 1. Karakterisering av PLAGA nanopartiklar med BSA. (A) SEM-bild av korrekt tillverkade nanopartiklar. (B) SEM-bild av felaktigt tillverkade nanopartiklar.
Figur 2. (A) Fluorescens-medierad tomografi (FMT) bilder av ultraljud behandlade (överst) och kontroll behandlade (nederst) subkutan gliom omedelbart efter behandling med en MNCAs, där nanopartiklar (NPS) bär 680 fluorescens signaler ovanpå gråskala plana excitation ljus bild.
Figur 3. Representant faldig förändring av tumörtillväxt efter mikrobubblor insonation med den utökade fem brast pulserande protokollet.
Figur 4. B-läge (A, C) och kontrastförstärkt ultraljud (B, D) bilder av en subkutan C6 gliom tumör i en mus. I den inledande förbehandling bilden (A) har gränsen av mestadels hypoechoic tumör spårats i blått. Tid genomsnittlig förbättring efter intravenös injektion av kontrastmedel visas i (B) förbehandling. Uppföljningsbesök, innan kontrast injektion tumör återigen mestadels hypoechoic (D). Efter kontrast injektion, det är betydligt mindre förbättring i tumören.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
Kanylering av mus svansvenen:
Intravenös injektion i musen svansvenen kan vara en utmanande förfarande. Däremot kan en svansvenen kateter förbättras avsevärt sannolikheten för en lyckad injektion. För att katetern, upprepade gånger böja fram och tillbaka ett 25 gauge nål tills den går sönder från navet. Sätt i den trubbiga änden i slutet av PE 20 slang och täta kopplingen med silikon lim. För att förbereda kateter för kanylering, bifoga en spruta laddad med 1% hepariniserat saltlösning till Cather och ingjuta vätska i dead space av katetern. Placera en sövda mus på sidan så den laterala svansvenen är i sikte. Vidga svansen med varmt vatten (105 ° - 110 ° F). Stick in nålen i venen. Om det lyckas blodet kommer oftast in i katetern. Kontrollera att nålen är i venen genom att rensa ven med en liten mängd av saltvatten. Säkra katetern på plats med tejp innan du ansluter sprutan till infusionspump.
Nanopartiklar resuspension:
Nanopartiklar kan lägga samman efter frystorkning. Återsuspendera partiklar i PBS, upprepade gånger Vortex och låt ligga en kort stund (10 sek) i en Sonic vattenbad. Det är viktigt att korrekt resuspendera frystorkade prov. Karakterisera fjädring med SEM mikroskopi och ljus tekniker spridning efter frystorkning och resuspension.
Eventuella ändringar:
När det gäller justering av protokollet nanopartiklars tillverkning, tjänar BSA som ett surrogat drog och kan bytas ut för en mängd läkemedel. Beroende på lösligheten av terapeutiskt medel, kan nanopartiklar vara som tillverkats som en olja-i-vatten emulsion eller en olja-i-vatten-i-olja emulsion. Lastning effektivitet och frigörande av terapeutiskt medel från PLAGA NPS, kan också justeras avsevärt om så önskas. För att öka belastningen effektiviteten, öka wt / wt lastning av läkemedel i polymera bärare via optimering av NP tillverkning parametrar. Att skräddarsy frisättningshastighet av terapeutiskt medel, variera hydrolyshastighet konstant genom förändringar i molekylvikt och mjölksyra / glykolsyra förhållandet PLAGA. Genom talioring både lastning effektivitet och frisättningshastighet terapeutiskt medel, i och från PLAGA NPS, kan det önskade lokala koncentrationen levereras till vävnad. När det gäller justering av leverans-protokollet, de viktigaste faktorerna är graden av ultraljud MNCA förstörelse och mikrovaskulära permeabilization. Det har rapporterats att albumin skalade mikrobubblor har en halveringstid på 1,3 ± 0,69 minuter (medelvärde ± SD) (Optison 2008). Vår hypotes är att kontinuerlig agenten infusion och långvarig ultraljud ansökan kommer att öka omfattningen av microvessel permeabilization. Genom att öka behandlingstiden vi siktar på att övergående öka permeabilization av mikrocirkulation.
Den icke-termisk mekanisk ablation protokoll kan justeras genom att ändra MB koncentration eller ultraljud topptryck. Det förväntas att öka MB koncentration och / eller ultraljud topptryck kommer att öka graden av skada på tumörvaskulatur.
Användningsområden:
Vi utvecklar tekniker för att sänka den akustiska effekt som krävs av transkraniell högintensivt fokuserat ultraljud (HIFU) för att nå önskad effekt.
Delvis på grund av komplikationer i samband med behandling genom skallen och betydelsen av omgivande vävnad, termisk ablation tumörvävnad med hög fokuserat intensitet ultraljud (HIFU) har ännu inte uppnått allmänt används som ett terapeutiskt alternativ för hjärncancer. Preliminära slutsatser från de tre första patienterna i en klinisk tåg har indikerat deep brain HIFU behandling på sub-ablativ fokus temperaturer resulterar i kraniella uppvärmning (McDannold 2009). Nyckeln till framgång HIFU som en klinisk behandling för transkraniell behandling av hjärntumörer är förmågan att lokalisera leverans av akustisk energi till en väl avgränsad region. Förmågan att leverera akustisk energi kompliceras av ben-eller-gränssnitt, som skallen och tidigare kirurgisk fria stationer, som genererar fas och makt aberrationer som ultraljud energi dämpas längs förökning sökväg (tanter 1998). Dessa avvikelser bidrar ofta till att pre-prioriterade uppvärmning (McDonnald 2009) och kavitation i friska vävnader.
Under de senaste åren har användningen av mikrobubblor för att sänka akustisk effekttäthet för riktade, reversibel BBB störningar och tumör ablation rönt stort forskningsintresse (Hynynen 2001, Sheikov 2004, McDannold 2006a, 2006b, Meairs 2005). McDannold et al. (2006a) har visat att intravenös injektion av mikrobubblor vid HIFU behandling resulterade i en 91% minskning avtime average akustisk effekttäthet tröskeln för mekaniska skador jämfört med kontroller där inga mikrobubblor var närvarande, vilket visar potentialen för att skapa lesioner med nedsatt temperaturstegring. Att minska den termiska tröskeln för lesioner i sin tur minskar sannolikheten för värmelagring i off målvävnaden eller ben. Dessutom har det visat sig att intravenös tillförsel av mikrobubblor vid tidpunkten för resultaten ultraljudsbehandling övergående, lokal, BBB öppning med befogenheter cirka två storleksordningar lägre än de som krävs för blåsor bildas.
Det är målet med detta arbete för att utveckla ultraljud-mikrobubblor tekniker för att både sänka akustiska effekt som krävs av transkraniell HIFU och kontrollera graden av mikrovaskulära permeabilization. De två särskilda terapeutiska tillämpningar av detta arbete i hjärnan målstyrning av läkemedel och icke-termisk ablation. Den relativa nivåerna av ökade permeabilitet och permanent ablation kan kontrolleras genom att justera ljudnivåer beroende på om tonvikten ligger på förbättrade drug delivery, permanent mikrovaskulära ablation, eller en kombination av drug delivery och permanent mikrovaskulära ablation. Denna potential förmågan att kontrollera hur mikrokärl reagerar skapar en möjlighet att utveckla olika varianter av vår metod för att behandla specifika transkraniell terapeutiska tillämpningar. Vi tror att detta tillvägagångssätt har potential att drastiskt förändra hur hjärntumörer behandlas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Med stöd av NIH R01 HL74082, den Hartwell Foundation och fokuserat ultraljud Kirurgi Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
- Chappell, J., Song, J., Burke, C., Klibanov, A., Price, R. Targeted delivery of nanoparticles bearing fibroblast growth factor-2 by ultrasonic microbubble destruction for therapeutic arteriogenesis. Small. 10, 1769-1777 (2008).
- Chomas, J. E., Pollard, R., Wisner, E., Ferrara, K. Subharmonic Phase-Inversion for Tumor Perfusion Estimation. IEEE. 2, 1713-1716 (2001).
- Davda, J., Labhasetwar, V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells. Int J Pharm. 233, 51-51 (2002).
- Hynynen, K., McDannolod, N. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Microbubble contrast agent with focused ultrasound to create brain lesions at low power levesl: MR imaging and histological study in rabbits. Radiology. 241, 95-106 Forthcoming.
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: Association with cavitation activity. Phys Med Biol. 51, 793-807 Forthcoming.
- McDannold, N., Clement, G. T., Black, P., Jolesz, F., Hynynen, K. Transcranial magnetic resonance imaging- guided focused ultrasound surgery of brain tumors: initial findings in 3 patients. Neurosurgery. 66, 323-332 (2009).
- Meairs, S., Alonso, A.
- Optison, products insert. , Food and Drug Administration. (2009).
- Sadlowskie, A., Chromas, J., Pollard, R., Bloch, S., Griffey, S., Wisner, W., Ferrara, K. W. Mean Flow Rate and Intergrated Perfusion Estimates Obtained with Contrast-Assisted Ultrasound. IEEE Ultrasonics Symposium. , 1977-1980 (2002).
- Song, J., Chappell, J. C., Qi, M., VanGieson, E. J., Kaul, S., Price, R. J. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. J Am Coll. Cardiol. 39, 726-731 (2002).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of blood-brain barrier opeing induced by ultrasound in the presences of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- Tanter, J., Fink, M. Focusing and steering through absorbing and aberrating layers: Application to ultrasonic propagation through the skull. J Acoust Soc Am. 103, 2403-2410 (1998).
- Yeh, C. K., Kruse, D. E., Lim, M. C., Redline, D. E., Ferrara, K. W. A New High Frequency Destruction/Reperfusion System. IEEE. 1, 433-436 (2003).
