Summary
Beschrijven we de procedure voor te bereiden geënsceneerde
Abstract
De Drosophila embryo is een aantrekkelijk model voor onderzoek naar de cellulaire en moleculaire basis van neuronale ontwikkeling. Hier beschrijven we de procedure voor de visualisatie van Drosophila embryonale zenuwstelsel met behulp van antilichamen tegen neuronale eiwitten. Omdat de hele embryonale perifere zenuwstelsel en het centrale zenuwstelsel zijn goed gekarakteriseerd op het niveau van individuele cellen (Dambly-Chaudière et al., 1986;.. Bodmer et al., 1987;. Bodmer et al., 1989), eventuele afwijkingen aan deze systemen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen verschillende neuronale eiwitten. De zich ontwikkelende embryo's worden verzameld op bepaalde tijden te zorgen dat de embryo's worden in de juiste ontwikkelingsstadia voor visualisatie. Na het verzamelen, worden de buitenste lagen van het embryo, het chorion membraan en de vitelline envelop dat het embryo omgeeft, verwijderd voordat fixatie. Embryo's worden vervolgens geïncubeerd met neuronale antilichamen en gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde secundaire antilichamen. Embryo's in stadia 12 tot 17 worden gevisualiseerd op de embryonale zenuwstelsel toegang. In fase 12 van de CNS kiem band begint verkorten en door etappe 15 de definitieve patroon van de commissuur is bereikt. Per fase 17 van de CNS contracten en de PNS is volledig ontwikkeld (Campos-Ortega et al.. 1985). Zo veranderingen in het patroon van de PNS en CNS kan gemakkelijk worden geobserveerd tijdens deze ontwikkelingsstadia.
Protocol
1. Voorbereiding van de reagentia
- Bereid de PEMFA Buffer met behulp van 100mm Pipes, 2mm EGTA, en 1 mM MgSO 4. Breng de pH van de buffer tot 7,0. De buffer is PEMFA filter gesteriliseerd en opgeslagen bij 4 ° C.
- Bereid PBT door het toevoegen van 1 ml van Triton X-100 tot 100 ml 1x PBS (fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing) (pH 7,0). Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid 5% BSA (bovine serum albumine) met 0,01% NaAcide in 1x PBS (pH 7,0).
- Bereid de zoutoplossing met 0,7% NaCl en 0,03% Triton X-100 in gedeïoniseerd water.
- Bereid het fixatief door de combinatie van vier onderdelen PEMFA buffer met 1 deel 37% Formaldehyde.
2. Het verzamelen van embryo's
- Bereid een kooi voor de Drosophila stam van belang door het plaatsen van> 100 vliegt in een plastic fles met daarin een adapter met agar voeden plaat.
- Laat de kooi van vliegen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 72 uur, het wijzigen van platen iedere 8-12 uur, zodat de vliegen te krijgen gewend aan de kooi en niet in het bezit van hun eieren.
- Voor het experiment te verzamelen embryo's voor 12 uur. Haal de petrischaal uit de container en vervang deze. Neem de verwijderde petrischaal en was de embryo's uit de schotel met de zoutoplossing en een schone kwast.
- Het verzamelen van de embryo's in een fijne zeef. Spoelen met zoutoplossing om eventuele overtollige gist te verwijderen.
- Met behulp van een spatel voorzichtig pick-up van de embryo's en leg ze in een klein glazen flesje met een dop. Voeg ongeveer 1 ml zoutoplossing.
3. Verwijdering van de Chorion en Vitelline Membranen en fixatie
- Na het verzamelen van embryo's, de voorbereiding van de heptaan-Fix-oplossing door het combineren van 50% heptaan en 50% fixeermiddel. De oplossing zal worden gelaagd met heptaan aan de bovenkant en het fixeermiddel op de bodem.
- In het glazen flesje was de embryo's door het incuberen van hen in de zoutoplossing gedurende 5 minuten. Verwijder overtollig zout met behulp van een Pasteur pipet.
- Spoel de embryo's met gedeïoniseerd water.
- Dechorionate de embryo's door het incuberen van hen in 50% bleekwater gedurende 3 minuten.
- Spoel de embryo's met gedeïoniseerd water.
- Bevestig de embryo's door het incuberen ze gedurende 30 minuten in de Heptane-Fix oplossing met zacht schudden.
- Met behulp van een Pasteur pipet vervangen door het fixeermiddel (onderste laag) met methanol het verlaten van de heptaan in de buis. Schud krachtig om de vitelline membraan te verwijderen. De devitellinized embryo's zal zinken naar de bodem van de buis.
- Het verzamelen van de embryo's in een nieuwe glazen flacon met behulp van een Pasteur pipet. Spoel de embryo's vijf keer met methanol, telkens uitbroeden van de embryo's voor 5 minuten.
4. Antilichaam kleuring, Montage, en Visualisatie
- Hydrateren de embryo's in een mengsel van 50% PBT-oplossing en 50% methanol gedurende 5 minuten. Vervolgens hydrateren in 100% PBT-oplossing gedurende 5 minuten.
- Blokkeer de embryo's door het incuberen van hen in 5% BSA met 0,01% NaAcide-oplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Embryo's zijn nu klaar voor antilichaam kleuring. Bereid de primaire antilichaam door het verdunnen van het aan de juiste concentratie met 5% BSA met 0,01% NaAcide oplossing. We maken gebruik van een antilichaam tegen de cysteine snaar eiwit (CSP), een vesiculaire synaptische eiwit en een anti-HRP of mierikswortelperoxidase antilichaam, dat een specifieke neuronale-koolhydraatgroep aanwezig in het oppervlak glycoproteïnen en labels alle neuronen herkent.
- Incubeer de embryo's een nacht bij 4 ° C in het primaire antilichaam oplossing.
- De volgende dag, was de embryo's 10 keer met PBT in de loop van een uur.
- Bereid het secundaire antilichaam oplossing door verdunning van de juiste concentratie. We maken gebruik van Alexa secundaire antilichamen bij een concentratie van 1:200.
- Incubeer de embryo's gedurende twee uur in 4 ° C in het secundaire antilichaam oplossing.
- Was de embryo's 10 keer met PBT in de loop van een uur.
- Incubeer de embryo's 's nachts in Vectashield Mounting Medium.
- Monteer de embryo's op een glasplaatje en sluit de deksel slip met nagellak. Visualiseer embryo's met behulp van een fluorescentie microscoop.
5. Representatieve resultaten
CSP 
HRP-FITC 
Samengevoegd
Figuur 1: Een vertegenwoordiger van beelden die het embryonale stadium CNS in 16-17, met behulp van antilichamen tegen CSP (rood) en HRP (groen). Let op de duidelijke kleuring van de commissuur.
CSP 
HRP-FITC
"/>
Samengevoegd
Figuur 2: Een vertegenwoordiger van beelden die het embryonale stadium PNS in 16-17 met behulp van antilichamen tegen CSP (rood) en HRP (groen). Let op de herhaalde patronen van de perifere neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Drosophila embryo is een krachtig systeem voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire veranderingen tijdens neuronale ontwikkeling. In dit protocol hebben we laten zien hoe je ganse berg embryo's voor te bereiden op immunohistochemie. We hebben aangepast dit protocol bij het protocol beschreven in Carroll en Scott, 1985. Dit protocol kan ook worden aangepast aan andere neuronale antistoffen te testen, maar optimalisatie van antilichamen moet worden gedaan. Verder kunnen defecten in de ontwikkeling van het embryonale PNS en CNS gemakkelijk gevisualiseerd door het vergelijken van embryo's van verschillende mutant lijnen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze protocol bij de PNS en de CNS in embryo's met motor eiwit mutanten te visualiseren. Onder hoge vergrotingsfactor we hebben tevens de axonale tracks in de embryonale PNS en CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
SG wordt ondersteund door middelen van de State University van New York in Buffalo en van John R. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
