Summary
이 프로토콜은 마우스 medulloblastoma 조직의 격리와 분리를 설명하고, 보조 medulloblastoma를 시작하기 위해 immunocompromised받는 생쥐에 종양 세포의 후속 allografting.
Abstract
Medulloblastoma은 신경계의 가장 일반적인 소아 종양이다. 동물 연구의 큰 시체가 medulloblastoma 1-4에 대한 세포 수준의 기원으로 소뇌 과립 신경 세포의 엽 성의 전구 물질 (CGNPs)에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 인간의 환자 (결절 desmoplastic, 고전 및 셀 / anaplastic 대형) 및 medulloblastoma가 CGNP 마커 5 노 이소성 표정으로 인간 환자의 일부에서 발견되는 사실에 medulloblastoma의 subtypes의 다양한 임상 프레 젠 테이션 것이 좋습니다 medulloblastoma의 세포 및 분자 기원은 지금까지 완전히 해독되지 않도록 더 복잡하고 있습니다. 따라서, 어떤 세포 유형 특정 치료 양상을 개발할 수에 따라 대체 medulloblastoma 종양 세포 수준의 원산지가 있는지 확인하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 수신자의 이차 종양 개발의 후속 분석 다음에 표시된 유전자 종양 세포 유형의 allografting intracranial orthotopic는 종양 - 시작 세포의 세포 기원의 결정을하실 수 있습니다. 우리가 일차 종양 조직에서 파생된 medulloblastoma 세포의 allografting intracranial orthotopic에 대한 실험 프로토콜을 설명하고,이 절차는 또한 기존 휴대폰 라인에서 세포를 이식에 사용될 수 있습니다.
Protocol
1. 종양 - 베어링 소뇌 및 종양 조직의 분리의 마이크로 해부
- 종양 조직 검색
- medulloblastoma 베어링 병든 생쥐는 종종 runted 및 hydrocephaly 및 사후 마비 및 전복시 자세를 회복하기 위해 실패를 포함하여 전형적인 신경 증상을 표시하고 있습니다. 종양 조직을 검색하려면, 이산화탄소 흡입하여 쥐를 안락사. 그것은 자궁 경부 전위, 뒷부분 두개골에 압력을 생성하고 종양 조직 무결성을 손상 수있는 절차를 수행하지 imporant이다.
- 잘린은 두개골의 좋은 시각화를위한 머리 근육 조직 최대한 제거, 가위를 사용하여 죽은 후 즉시 수행됩니다. 95 % 에탄올로 적셔 Kimwipe와 두개골의 표면을 청소하십시오.
- 두개골의 정중선을 따라 개방 잘라하고, 어느 시점에 종양 베어링 소뇌를 포함하여 전체 두뇌가 노출, 괜찮아요 핀셋을 사용하여 두개골 조직을 제거하는 미세 가위를 사용합니다.
- 건강한 성인의 cerebella 잘 정의 반구와 vermis를 표시하지만, 종양이 베어링 생쥐의 cerebella은 종종 매끄러운 표면과 눈에 혈관과 비정질, 확대하고 있습니다. 무균 기술을 사용하여 얼음처럼 차가운 인산에 핀셋과 장소를 사용하여 소뇌 종양을 검색 호수 (PBS)가 MG이없이 버퍼 + 및 CA 2 +.
참고 : 모든 악기가 사용하기 전에 autoclaved 95 %의 에탄올과 증기로 소독하고 있습니다.
- 종양 조직의 분리
- 4 분간 37 인큐베이션 다음 실온에서 3 분 고급 가위, ° C로 조직을 말하다, PBS에서 종양 조직의 4 배 볼륨 약 50 % Accutase (PBS에 희석)에 종양 조직을 전송 , 그 이후 조직은 추가 3 분 1 - ML Pipetman와 반복 pipeting를 겪습. 이 방법은 단일 세포와 작은 세포 집합체의 혼합물을 얻을 것입니다.
- 세포 현탁액 PBS 및 1000xg에서 펠릿 세포 5 분 동안 원심 분리기 3 배 희석. (위의 절차는 목성은 언론에서 "medulloblastoma의 줄기 세포의 분리, 농축 및 유지 보수"에 설명되어있다)
글루타민 페니실린 - 스트렙토 마이신, N2, B27, 인간 EGF (25 NG / ML)과 기본 FGF (25 NG / ML)로 Neurobasal 매체의 구성 신선한 신경 줄기 세포 매체에있는 세포 펠렛을 Resuspend. 솔루션의 세포 밀도를 계산하고 하나는 멸균 베벨 - 스쳐 10μL 주사기로, dissociated 종양 세포의 적절한 숫자, 예를 들어 5x10 5 솔루션 4 μL를 로드할 수있는 등 추가로 신경 줄기 세포 매체와 적절한 추가 dilutions합니다. 주사하는 세포의 정확한 숫자는 특정 실험 조건에 따라 연구자에 의해 결정되어야합니다. 미니 200μL microcentrifuge 관의 세포 솔루션 (PCR 튜브) 얼음에 보관하십시오.
2. 받는 마우스에 대한 마취 절차
수술 들어, 설치류 수술 전용 소독 지역은 절차의 기간 동안 필요합니다. 이상적으로, 동물 준비, 운영 분야 및 동물 복구를 위해 별도하지만 인접한 영역 긴 벤치를 설정합니다. 수술 장갑이 아닌 시험 장갑은 수술이 필요합니다. 무균 기술은 허리 위에 장갑 낀 손을 잡고하여 유지하고 건조 멸균 표면 살균 개체를 처리하기 위해서만 사용됩니다.
- 마취제 (마우스 중량 1kg 당 100 MG의 마취제)와 xylazine (마우스 중량 1kg 당 10 MG xylazine)의 혼합물은 마취에 사용됩니다. anesthetics의 intraperitoneally을 관리할 수 있습니다.
- 그것은 일반적으로 전체 적용하기 위해 anesthetics에 대한 3~5분 걸립니다. 마우스 발끝 / 꼬리 핀치에 의해 완전히 anesthetized 있는지 확인합니다. 마우스의 눈 안과 연고의 작은 금액을 넣으십시오. 끊임없이 마우스가 정상적으로 호흡 있는지 확인하기 위해 모니터링, 운영 영역에 완전히 anesthetized 마우스를 가져와.
3. 종양 세포의 이식 Intracranial
- midbrain과 소뇌 위의 후부 두개골을 나타내기 위해 머리 깎기를 사용하여 마우스 등의 사후 헤드 영역을, 면도.
- 알코올 패드로 닦아 다음 면화 팁 작은 주걱을 사용하여 노출된 두피에 Betadine 솔루션을 적용합니다. 이 두 살균 단계를 두 번 반복합니다.
- 멸균 메스를 사용하여 사후 두피 안에 25 인치 절개를합니다. 오른쪽으로 0.5 mm 버 구멍 2mm 및 살균 치과 드릴을 사용하여 람다에 후부 2mm를 드릴.
- 프레임 개최에 해당 incisors 넣었지하여 stereotactic 프레임에 마우스를 놓습니다. 조심스럽게 내려가면 및 버 구멍에 종양 세포 솔루션 4 μL와 함께 로드된 베벨 - 스쳐 10 μL 주사기 위치. syri의 일단 사각nge 니들은 두개골 표면 아래 다른 3mm에 대한 하강 후 0.5 mm를 위해 승천. 천천히받는 사람의 소뇌로, 30 번째 프레임에서 꾸준한 강제로, 종양 세포의 원하는 금액을 주입. 추가 2 분 동안 주입 완료 후에 그 자리에 바늘을 둡니다. 그런 다음 바늘과 주사기를 제거합니다. autoclip를 사용하여 상처를 클립.
- 의 체온을 유지하기 위해 수술 후 온난 화 담요 위에 마우스를 유지. 이동성과 호흡 패턴이 지속적으로 관찰됩니다. 마우스가 마취에서 회복되면 살균 주택 케이지에 다시 그것을 놓으십시오. 음식과 물 섭취, 행동, 정리, 그리고 눈이 붉은 얼룩에 대해 매일 모니터링합니다. 절개 사이트에서 감염의 흔적을 살펴보세요. 일 6.25 게시 수술에 autoclips를 제거합니다.
2-6개월의 평균에 대한 쥐를을 유지하고 더욱 연구에 대한 전형적인 medulloblastoma 증상을 표시하는 사람들을 희생.
4. 대표 결과
받는 생쥐에서 개발된 보조 medulloblastomas는 매우 기본 종양의 문제들을 닮은. 전체 - 마운트로 볼 때 이차 종양 베어링 cerebella 종종 겉보기 이소성 혈관과 비정질, 확대되었다. 보조 종양 조직의 Immunohistochemical 분석은 종양 세포가 강한 표현 SmoM2 - YFP과 같은 Math1 및 Pax6 같은 소뇌 과립 신경 세포의 엽 성의 전구 물질의 표시 높은 proliferative 있다고 밝혔다. dissociated과 교양을 사용 신고 방법 ( "분리, 농축 및 medulloblastoma의 줄기 세포의 유지 보수"언론의 조브), 보조 medulloblastoma 종양 세포가 급속하게 확대 될 수있을 때, 표현 여러 줄기 세포 마커는 clonogenic하고 때 더욱 종양 형성을 시작할 수 있습니다 추가 immunocompromised받는 사람에 이식.
그림 1. 일반 전체 장착 및 보조 medulloblastoma 조직의 단면보기
보조 medulloblastoma 조직의 전형적인 예를 들어 26 일 5x10 5 일차 종양 세포의 주사 후 개발했습니다. Hematoxylin의 얼룩이 높은 세포질 / 핵 비율과 핵 다형성 포함 medulloblastoma의 전형적인 세포 형태를 보여준다. Ki67 표현으로 표시 이러한 보조 종양 세포는 매우 proliferative하고 그들은 또한 견고 SmoM2 - YFP 막의 표현한다.
그림 2. 보조 medulloblastoma 세포는 교양과 체외에서 확장 가능
기본 마우스 medulloblastoma 세포 ( "분리, 농축 및 medulloblastoma의 줄기 세포의 유지 보수"언론의 조브)에 설명된 프로토콜을 사용하여 이러한 보조 medulloblastoma 세포는 교양 여러 구절에 대한 확장하실 수 있습니다. 그림 4 일 14 일에서 교양 같은 대표적인 종양의 식민지를 보여줍니다. 교양 종양 세포는 세포 골재의 고밀도 코어에서 부족한 세포질과 자주 방출로 길쭉한 바이폴라입니다. 그들은 성장 접촉 억제를 전시하지 않습니다. 작은 원형 세포는 적혈구 수 있습니다.
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Discussion
산출 보조 종양 형성은 다음과 같은 것을 allografting 성공 medulloblastoma 세포 수 있도록 여러 가지 중요한 요소 : 첫 번째는 조직 분리에 대해서만 50 % Accutase를 사용하고 연장 효소 치료는 세포 생존에 상당한 감소에 이르게으로 조직을 덮어 소화하지 않습니다. 작은 팁 또한 dissociated 세포에 물리적 손상을 생성할 수 있습니다로도 오직 하나 ML 크기 Pipetman를 사용합니다. 그것은 allografting 하나의 세포를 작은 집계의 혼합물을 가지고 좋은 것입니다. 둘째, 해밀턴 주사기를로드하기 전에 혼합하고 종양 세포 솔루션 매번 평형. 더 큰 볼륨이 너무 intracranial 압력과 저항을 생성하는 것처럼 각각의 주입에 대해 4 개 이상의 μL를 사용하지 마십시오. 마지막 주입 솔루션이 각 주사 후 소뇌 조직으로 분산하도록 추가 2 분 기다려야하는 것이 중요합니다.
절차는 종양을 시작하고 전파할 수있는 유전자 표시 셀 타입 (S)의 결정에 대해 허용을 여기에서 설명한. 이 프로토콜은 또한 주입하는 세포가 일차 종양 조직에서 직접 파생되지 않은 상황에 적용되지만 설립 교양 세포 라인에서. 하나는 효소 분해 및 / 또는 반복적인 pipetting에 의해 세포의 적절한 숫자를 준비하고,이 프로토콜의 2 단계에서 시작할 수 있습니다. 따라서, 우리는 후보 유전자의 기능과 생체내 종양 성장 판독에와 화합물의 억제 효과를 테스트할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 밴더빌트 - 잉그램 암 센터 지원 그랜트 (P30 CA068485), 아동 뇌종양 재단과 국립 보건원 (NS042205)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
