Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד דיסוציאציה של רקמת מדולובלסטומה העכבר, לאחר מכן allografting של תאים סרטניים לעכברים הנמען immunocompromised כדי ליזום מדולובלסטומה משנית.
Abstract
מדולובלסטומה הוא הגידול השכיח ביותר בילדים של מערכת העצבים. גוף גדול של מחקרים בבעלי חיים התמקדה cerebellar נוירון מבשרי גרגיר (CGNPs) בתור מקור התא של מדולובלסטומה עבור 1-4. עם זאת, מצגות קלינית מגוונת של תת מדולובלסטומה בחולים אנושיים (קשרי, desmoplastic, קלאסית גדול תא / אנפלסטית), ואת העובדה מדולובלסטומה נמצא משנה של חולים עם ביטוי לא אנושי חוץ רחמי של CGNP סמן 5, עולה כי מקורות תאית ומולקולרית של מדולובלסטומה מורכבים יותר רחוק מלהיות פוענחה לגמרי. לכן, זה הכרחי כדי לקבוע אם יש גידול מדולובלסטומה חלופה תא-of-מקור אשר מבוסס על תאים מסוג מודליות טיפולית ספציפית ניתן לפתח. לשם כך, תוך גולגולתי orthotopic allografting של מסומן גנטית סוגי תאים סרטניים ואחריו ניתוח בדיעבד של התפתחות גידולים משניים מקבלי יאפשר קביעת המקור התאי של גידולים ייזום תאים. כאן אנו מתארים את פרוטוקול הניסוי עבור orthotopic תוך גולגולתי allografting מדולובלסטומה של תאים שמקורם ברקמת הגידול הראשוני, ועל הליך זה יכול לשמש גם עבור השתלת תאים של שורות תאים הוקמה.
Protocol
1. Micro-דיסקציה של המוח הקטן נושאות גידולים ו דיסוציאציה של רקמת הגידול
- איחזור של רקמת הגידול
- עכברים חולים נושאות מדולובלסטומה הם המנוון לעתים קרובות, ולהציג hydrocephaly ועל סימפטומים נוירולוגיים טיפוסי, כולל שיתוק האחורי ואי להחזיר יציבה כאשר התהפכה. כדי לאחזר את רקמת הגידול, להרדים עכברים משאיפת פחמן דו חמצני. זה imporant לא לבצע פריקה צוואר הרחם, הליך זה יוצר לחץ הגולגולת האחורי והוא יכול להתפשר שלמות רקמת הגידול.
- עריפת ראש מבוצעת מיד לאחר מותו באמצעות מספריים, הסרת שיער רקמת שריר ככל האפשר עבור להדמיה טוב של הגולגולת. נקו את פני השטח של הגולגולת עם Kimwipe ספוגה אתנול 95%.
- השתמש במספריים בסדר לחתוך פתח לאורך קו האמצע של הגולגולת, ולהסיר רקמה הגולגולת באמצעות פינצטה בסדר, ובנקודה המוח כולו כולל המוח הקטן נושאות גידולים חשוף.
- בעוד cerebella של מבוגרים בריאים להציג מוגדרים היטב ההמיספרות ו vermis, cerebella של נושאות גידולים בעכברים לעיתים מוגדלת, אמורפי עם משטח חלק וכלי דם בולט. באמצעות שימוש בטכניקות סטריליות, לאחזר את הגידול cerebellar באמצעות פינצטה ומכניסים פוספט קר כקרח בופר סליין (PBS) ללא Mg 2 + ו - Ca 2 +.
הערה: כל המכשירים הם וחיטוי באתנול 95% וקיטור autoclaved לפני השימוש.
- דיסוציאציה של רקמת הגידול
- מעבירים את רקמת הגידול של PBS על Accutase 50% (בדילול מלא PBS) כי הוא על נפח 4 פעמים של רקמת הגידול, לרכך את רקמת עם מספריים בסדר 3 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות , לאחר מכן הרקמה עובר pipeting חוזרות עם Pipetman 1-מ"ל במשך 3 דקות נוספות. שיטה זו אמורה להניב תערובת של תאים בודדים ו אגרגטים סלולריות קטנות.
- לדלל את ההשעיה הסלולר של פי 3 עם PBS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1000xg כדי גלולה התאים. (ההליכים הנ"ל תוארו "העשרה בידוד, ותחזוקה של בתאי גזע מדולובלסטומה", יופיטר in press)
Resuspend התא גלולה ב המוכן טרי בינוני תא גזע עצביים המורכב בינוני Neurobasal עם גלוטמין, פניצילין, סטרפטומיצין, N2, B27, אדם EGF (25 ng / mL) ובסיסי FGF (25 נ"ג / מ"ל). חשב את צפיפות התאים של הפתרון ולעשות דילולים נוספת המתאימה נוסף בינוני עם תא גזע עצביים כגון שאפשר לטעון 4 μL של פתרון עם מספר מתאים של תאים סרטניים ניתק, למשל 5x10 5, לתוך מזרק שפוע שקצהו סטרילי 10μL. המספר המדויק של התאים להיות מחוסן צריך להיקבע על ידי החוקר על פי דרישות ספציפיות ניסיוני. שמור על פתרון תא צינור microcentrifuge מיני 200μL (צינור PCR) על קרח.
2. הרדמה נוהלי עכברים נמען
במשך ההליך הכירורגי, חיטוי אזור המוקדש לניתוח מכרסם נדרשת למשך ההליך. באופן אידיאלי, להגדיר ספסל ארוך עם אזורים נפרדים אך סמוכים להכנת בעלי חיים, תחום הפעלה ושחזור בבעלי חיים. כפפות מנתחים, לא כפפות הבחינה, נדרשים לניתוח. טכניקה אספטי מתוחזק על ידי אוחזים ידיים בכפפות מעל המותניים משמש רק כדי להתמודד עם אובייקטים סטרילי מפני השטח סטרילי ויבש.
- תערובת של קטמין (100 מ"ג קטמין לכל 1 ק"ג של משקל העכבר) ו xylazine (10 מ"ג xylazine לכל 1 ק"ג של משקל העכבר) משמש הרדמה. ניהול 'intraperitoneally הרדמה.
- זה בדרך כלל לוקח 3-5 דקות הרדמה ייכנסו לתוקף מלא. בדוק אם העכבר הוא הרדים במלואה על ידי צביטה הבוהן / זנב. מניחים כמות קטנה של משחה עיניים על העיניים של העכבר. תביאו את העכבר בהרדמה מלאה באזור הניתוח, ניטור מתמיד על מנת לוודא כי העכבר הוא נושם באופן רגיל.
3. תוך גולגולתי של השתלת תאים סרטניים
- לגלח את האזור הגבי ראש האחורי של העכבר, באמצעות גוזז שיער, כדי לחשוף את הגולגולת האחורי מעל המוח התיכון לבין המוח הקטן.
- החל פתרון בבטאדין על הקרקפת חשופה באמצעות קצה המוליך כותנה, ואחריו מנגב עם כרית אלכוהול. חזור על שני השלבים עיקור פעמיים.
- ביצוע חתך של סנטימטר בקרקפת האחורית באמצעות אזמל מעוקרים. לקדוח חור 0.5 מ"מ בר 2 מ"מ ימינה 2 מ"מ אחורי כדי למבדה באמצעות מקדח שיניים סטרילית.
- מניחים את העכבר על מסגרת stereotactic ידי משדלת החותכות שלו על להחזיק את המסגרת. יורדים בזהירות ולמקם את שפוע שקצהו 10 מזרק μL עמוסה μL 4 של פתרון תאים סרטניים לתוך החור בר. לאחר שפוע של syriמחט nge היא מתחת לפני השטח את הגולגולת, לרדת על 3 מ"מ אחר ואז לעלות על 0.5 מ"מ. לאט לאט להזריק את הכמות הרצויה של תאים סרטניים, עם כוח קבוע בתוך מסגרת הזמן 30 שנייה, לתוך המוח הקטן של הנמען. השאירו את המחט במקומה לאחר השלמת הזרקה של שתי דקות נוספות. ואז להסיר את המחט במזרק. קליפ את הפצע באמצעות autoclip.
- שמור את העכבר על שמיכה מחממת לאחר הניתוח על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף שלו. דפוסי ניידות הנשימה יקויימו ברציפות. לאחר העכבר מתאושש מן ההרדמה, מקום אותו בחזרה בכלוב דיור סטרילית. מעקב יומיומי אחר מזון צריכת המים, התנהגות, טיפוח ו מכתים באדום של העיניים. בדיקת סימנים של זיהום במקום החתך. הסר את autoclips על ניתוח שלאחר יום 7.
שמירה על עכברים במשך ממוצע של 2-6 חודשים להקריב אלה המציגים סימפטומים מדולובלסטומה טיפוסי למחקרים נוספים.
4. נציג תוצאות
Medulloblastomas משני פיתחה בעכברים הנמען מאוד דומים לאלה של גידולים ראשוניים. Cerebella נושאות גידולים משניים היו לעתים קרובות מוגדלים, אמורפי עם כלי דם מחוץ לרחם לכאורה כאשר הוא מוצג כמכלול-mounts. מנתח immunohistochemical של רקמת הגידול המשני גילה כי תאים סרטניים הם שגשוג מאוד, להביע חזק SmoM2-YFP וסמנים של cerebellar נוירון מבשרי גרגיר, כגון Math1 ו Pax6. כאשר ניתק ותרבותיים דיווחו על שימוש בשיטות (", בידוד ותחזוקה של ההעשרה בתאי גזע מדולובלסטומה", יופיטר in press), גידול התאים משני מדולובלסטומה ניתן להרחיב במהירות, להביע מספר סמנים תא גזע, הם clonogenic והוא יכול להמשיך ליזום היווצרות הגידול כאשר הושתלו מקבלי החיסון נוספים.
באיור 1. אופייני כל הר ותצוגות חתך של רקמה מדולובלסטומה משני
דוגמה טיפוסית של רקמת מדולובלסטומה משני שפותחה 26 ימים לאחר הזרקה של 5x10 5 תאים סרטניים ראשוניים. מכתים Hematoxylin חושף את המורפולוגיה הסלולר הטיפוסי של מדולובלסטומה, כולל יחס גרעיני / cytoplasmic גבוהה פולימורפיזם גרעיני. אלו תאים סרטניים משניים שגשוג מאוד כפי שעולה ביטוי Ki67 והם גם וחסונה להביע קרומי SmoM2-YFP.
איור 2. תאים מדולובלסטומה משני יכול להיות מתורבת והרחיב במבחנה
באמצעות פרוטוקול תיאר העיקרי מדולובלסטומה תאים העכבר (", בידוד ותחזוקה של ההעשרה בתאי גזע מדולובלסטומה", יופיטר in press), תאים אלו מדולובלסטומה משני יכול להיות מתורבת והרחיב על קטעים מרובים. התמונה מראה את אותו נציג הגידול בתרבית מושבה בבית 4 ימים, 14 ימים. תאים סרטניים בתרבית הם דו קוטבית, מוארך עם הציטופלסמה דלים ולעתים קרובות להקרין מהליבה צפופה של המצרפי הסלולר. הם אינם מציגים קשר עיכוב צמיחה. תאים קטנים ועגולים הם כדוריות דם אדומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר גורמים קריטיים כדי להבטיח תא מדולובלסטומה מוצלח allografting כי התשואות היווצרות גידולים משניים הם כדלקמן: ראשית, להשתמש רק Accutase 50% רקמת ניתוק ואל יתר לעכל את הרקמה כטיפול אנזים ממושכת גורמת הפחתה משמעותית של כדאיות התא. כמו כן, להשתמש רק Pipetman גודל 1 מ"ל כמו טיפים קטנים יכולים גם ליצור נזק פיזי לתאי ניתק. זה בסדר יש תערובת של תאים בודדים ו אגרגטים קטנים allografting. שנית, לערבב לאזן את הפתרון תאים סרטניים בכל פעם לפני טעינת מזרק המילטון. אין להשתמש יותר מ 4 μL להזרקה כמו כל נפח גדול יותר היה ליצור לחץ תוך גולגולתי גם הרבה התנגדות. לאחרונה, חשוב להמתין נוסף 2 דקות כדי לתת את הפתרון מוזרק להפיג לרקמת המוח הקטן אחרי כל זריקה.
הנהלים המתואר כאן מאפשר קביעת סוג התא מסומן גנטית (ים) שיכולים ליזום ולהפיץ גידולים. פרוטוקול זה חל גם על מצבים שבהם התאים להיות מוזרק אינם נגזרים ישירות מתוך רקמת הגידול הראשוני, אלא הוקמה שורות תאים בתרבית. אפשר להכין את המספר המתאים של תאים על ידי עיכול או האנזים ו / או pipetting חוזרים, להתחיל שלב 2 של פרוטוקול זה. לכן, אנו יכולים גם לבחון את פונקציות של גנים מועמדים ואת ההשפעה המעכבת של תרכובות כימיות עם ב readout הגידול בצמיחה vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תרומות של ונדרבילט Ingram-Cancer Center תמיכה גרנט (P30 CA068485), המוח ילדות קרן גידול לבין המכון הלאומי לבריאות (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
