Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie en dissociatie van de muis medulloblastoom weefsel, en de daaropvolgende allografting van de tumorcellen in immuungecompromitteerde ontvangende muizen in om secundaire medulloblastoom te starten.
Abstract
Medulloblastoom is de meest voorkomende pediatrische tumor van het zenuwstelsel. Een groot deel van onderzoek bij dieren is gericht op het cerebellum granule neuron precursors (CGNPs) als de cel-van-oorsprong voor medulloblastoom 1-4. Echter, de diverse klinische presentaties van medulloblastoom subtypes in menselijke patiënten (nodulair, desmoplastic, klassieke en grote cel / anaplastisch), en het feit dat medulloblastoom is gevonden in een subgroep van de menselijke patiënten zonder ectopische expressie van CGNP marker 5, suggereren dat de cellulaire en moleculaire oorsprong van het medulloblastoom zijn meer complex en lang niet volledig ontcijferd. Daarom is het essentieel om te bepalen of er een alternatief is medulloblastoom tumorcel-van-oorsprong op basis van welke cel-type specifieke therapeutische modaliteit kunnen worden ontwikkeld. Te dien einde zal intracraniële orthotopische allografting van genetisch gemarkeerde tumorcellen soorten, gevolgd door latere analyses van secundaire ontwikkeling van tumoren in de ontvangers laten bepalen van de cellulaire oorsprong van tumor-initiëren cellen. Hier beschrijven we de experimentele protocol voor intracraniële orthotope allografting van medulloblastoom cellen afkomstig van de primaire tumor weefsel, en deze procedure kan ook worden gebruikt voor het transplanteren van cellen van gevestigde cellijnen.
Protocol
1. Micro-dissectie van tumor-dragende kleine hersenen en dissociatie van tumorweefsel
- Ophalen van tumorweefsel
- Zieke muizen met medulloblastoom zijn vaak runted, en weer te geven hydrocefalie en typische neurologische symptomen, waaronder posterior verlamming en gebrek aan houding terug te krijgen wanneer deze is gekanteld. Te halen tumorweefsel, euthanaseren muizen door kooldioxide inademing. Het is imporant niet uit te voeren cervicale dislocatie, een procedure die druk genereert op de achterste schedel en in gevaar kunnen brengen tumorweefsel integriteit.
- Onthoofding wordt onmiddellijk uitgevoerd na de dood met behulp van een schaar, het verwijderen van haar-en spierweefsel zo veel mogelijk voor een goede visualisatie van de schedel. Reinig het oppervlak van de schedel met Kimwipe doordrenkt met 95% ethanol.
- Gebruik fijne schaar om een opening snijden langs de middellijn van de schedel, en de schedel weefsel met behulp van fijne pincet, op welk punt de gehele hersenen inclusief tumor-dragende cerebellum wordt blootgesteld te verwijderen.
- Terwijl de cerebella van gezonde volwassenen weer goed gedefinieerde halfrond en vermis, het cerebella van tumor-dragende muizen zijn vaak vergroot, amorfe met een glad oppervlak en opvallende bloedvaten. Met behulp van steriele technieken, halen de cerebellaire tumor met een pincet en plaats in de ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Mg 2 + en Ca 2 +.
Opmerking: alle instrumenten worden gedesinfecteerd in 95% ethanol en stoom autoclaaf voor gebruik.
- Dissociatie van tumorweefsel
- Breng de tumor weefsel van PBS tot 50% Accutase (verdund in PBS), dat is ongeveer 4 maal het volume van de tumor weefsel, gehakt het weefsel met fijne schaar gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 4 minuten , waarna het weefsel ondergaat repetitieve pipetteren met een 1-mL Pipetman voor een extra 3 minuten. Deze methode moet opleveren een mengsel van afzonderlijke cellen en kleine cellulaire aggregaten.
- Verwatering van de cellulaire suspensie 3-voudige met PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000xg om pellet de cellen. (De procedures hiervoor zijn beschreven in "Isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom stamcellen", Jove in press)
Resuspendeer de cel pellet in vers bereid neurale stamcellen medium dat bestaat uit Neurobasal medium met glutamine, penicilline-streptomycine, N2, B27, menselijke EGF (25 ng / ml) en basic FGF (25 ng / ml). Bereken de cel dichtheid van de oplossing en de nodige verdere verdunningen met extra neurale stamcellen medium, dat men 4 pi van de oplossing te laden met een passend aantal gescheiden tumorcellen, bijvoorbeeld 5x10 5, in een steriele schuine-tip 10μL spuit. Het exacte aantal cellen moet worden ingeënt moet worden bepaald door de onderzoeker op basis van specifieke experimentele eisen. Houd de cel oplossing in een mini-200μL microcentrifugebuis (PCR tube) op ijs.
2. Verdoving Procedures voor de Ontvanger Muizen
Voor de chirurgische ingreep, is een gedesinfecteerd ruimte gewijd aan de knaagdieren een operatie die nodig is voor de duur van de procedure. Idealiter, het opzetten van een lange bank met een aparte, maar aangrenzende gebieden voor dier-voorbereiding, operationele veld en dier herstel. Chirurgische handschoenen, geen examen handschoenen, zijn nodig voor de operatie. Aseptische techniek wordt onderhouden door holding gehandschoende handen boven de taille en alleen gebruikt om steriele objecten uit een droog steriel oppervlak te behandelen.
- Een mengsel van ketamine (100 mg ketamine per 1 kg van muis gewicht) en xylazine (10 mg xylazine per 1 kg gewicht van de muis) wordt gebruikt voor anesthesie. Dien de verdovingsmiddelen intraperitoneaal.
- Het duurt over het algemeen 3-5 minuten voor de verdoving te nemen volledige effect. Bepaal of een muis is volledig verdoofd door toe / staart knijpen. Plaats een kleine hoeveelheid oogzalf op de ogen van de muis. Breng het geheel verdoofde muis om de operationele omgeving, voortdurend in de gaten om ervoor te zorgen dat de muis normaal ademt.
3. Intracraniale enten van de tumorcellen
- Scheer de dorsale achterste hoofd gebied van de muis, met behulp van een haartrimmer, om de achterste schedel zichtbaar boven de middenhersenen en het cerebellum.
- Betadine oplossing toe te passen op de blootgestelde hoofdhuid met behulp van een wattenstaafje applicator, gevolgd door af te vegen met een alcoholdoekje. Herhaal deze twee stappen twee keer steriliseren.
- Maak kwart-inch incisie in het achterste hoofdhuid met behulp van een scalpel gesteriliseerd. Boor een 0,5 mm braam gat 2 mm naar rechts en 2 mm achter de lambda met behulp van een steriele tandartsboor.
- Plaats de muis op een stereotactisch kader door het inhaken van de snijtanden op het frame vast te houden. Voorzichtig afdalen en de positie van de schuine-tipped 10 pi spuit geladen met 4 pl van tumorcellen oplossing in de braam gat. Zodra de afschuining van de syriNSE naald wordt onder de schedel oppervlak, afdaling voor een ander 3 mm en daarna stijgen naar 0,5 mm. Injecteer langzaam de gewenste hoeveelheid van tumorcellen, met een gestage kracht in een 30 seconden tijd, in de kleine hersenen van de ontvanger. Laat de naald op zijn plaats na afronding van de injectie voor een extra twee minuten. Verwijder vervolgens de naald en spuit. Clip de wond met behulp van een autoclip.
- Houd de muis op een warming deken na de operatie te helpen zijn lichaamstemperatuur te behouden. Mobiliteit en luchtwegen patronen zal voortdurend worden nageleefd. Zodra de muis zich herstelt van de narcose, plaats deze terug in een steriele behuizing kooi. Monitor dagelijks voor voedsel-en wateropname, gedrag, verzorging, en de rode kleuring van de ogen. Controleer op tekenen van infectie op de incisie site. Verwijder de autoclips op dag 7 na de operatie.
Houden de muizen voor een gemiddelde van 2-6 maanden en offers die het weergeven van typische symptomen medulloblastoom voor verdere studies.
4. Representatieve resultaten
Secundaire medulloblastomen ontwikkeld in de ontvangende muizen zeer leken op die van de primaire tumoren. De cerebella lager secundaire tumoren waren vaak vergroot, amorfe met ectopische bloedvaten zichtbaar wanneer bekeken als een geheel-mounts. Immunohistochemische analyses van de secundaire tumor weefsel is gebleken dat de tumorcellen zijn zeer proliferatieve, maken zich grote SmoM2-YFP en markers van cerebellaire korrel neuron voorlopers, zoals Math1 en PAX6. Wanneer gedissocieerd en gekweekt met behulp van gemelde methodes ("Isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom stamcellen", Jove in press), de secundaire medulloblastoom tumorcellen snel kan worden uitgebreid, express meerdere stamcellen bevat, worden Monogene en kan verder initiëren de vorming van tumoren bij getransplanteerd in extra immuungecompromitteerde ontvangers.
Figuur 1. Typische whole-mount en doorsneden van een secundaire medulloblastoom tissue
Een typisch voorbeeld van secundaire medulloblastoom weefsel ontwikkeld 26 dagen na de injectie van 5x10 5 primaire tumor cellen. Hematoxyline vlekken onthult de typische cellulaire morfologie van medulloblastoom, met inbegrip van hoge nucleaire / cytoplasmatische verhouding en nucleaire polymorfisme. Deze secundaire tumorcellen zijn zeer proliferatieve zoals aangegeven door Ki67 expressie en ze ook fors drukken membraneuze SmoM2-YFP.
Figuur 2. Secundaire medulloblastoom cellen kunnen worden gekweekt en uitgebreid in vitro
Met behulp van het protocol beschreven voor primaire muis medulloblastoom cellen ("Isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom stamcellen", Jove in press), kunnen deze secundaire medulloblastoom cellen worden gekweekt en uitgebreid voor meerdere passages. De foto toont dezelfde vertegenwoordiger tumor kolonie gekweekt op 4 dagen en 14 dagen. De gekweekte tumorcellen zijn bipolair, langwerpig met weinig cytoplasma en vaak stralen uit een dichte kern van cellulaire aggregaat. Ze vertonen geen groei contact remming. De kleine ronde cellen zijn rode bloedcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een aantal kritische factoren voor een succesvolle medulloblastoom cel allografting dat de rendementen secundaire tumoren ontstaan zijn als volgt te waarborgen: Gebruik eerst slechts 50% Accutase voor weefsel dissociatie en niet over-verteren het weefsel als langdurige enzym behandeling leidt tot een significante vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen. Ook gebruik alleen de 1 mL grootte Pipetman als kleinere tips kan genereren ook fysieke schade aan de gedissocieerde cellen. Het is fijn om een mengsel van afzonderlijke cellen en kleine aggregaten voor allografting. Ten tweede, meng en evenwicht van de tumorcel oplossing iedere keer voor het laden van de Hamilton spuit. Gebruik niet meer dan 4 pi voor elke injectie als een groter volume zou te veel intracraniale druk en weerstand te genereren. Laatste, is het belangrijk om een extra 2 minuten te wachten te laten de geïnjecteerde oplossing verdwijnen in het cerebellum weefsel na elke injectie.
De hier beschreven procedure toe voor de bepaling van genetisch gemarkeerde celtype (s) die kunnen initiëren en uitdragen tumoren. Dit protocol geldt ook voor situaties waarin de cellen te injecteren niet direct afgeleid van de primaire tumor weefsel, maar van de gevestigde gekweekte cellijnen. Men kan de voorbereiding van de juiste aantal cellen door een van beide enzymdigestie en / of repetitieve pipetteren, en beginnen vanaf stap 2 van dit protocol. Daarom kunnen we ook testen van de functies van kandidaat-genen en het remmende effect van chemische verbindingen met een in vivo tumor-groei uitlezing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), de Childhood Brain Tumor Foundation en het National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
