Summary
Detta protokoll beskriver isolering och dissociation av mus medulloblastom vävnad, och efterföljande allografting av tumörcellerna i immunförsvagade mottagaren möss för att inleda sekundära medulloblastom.
Abstract
Medulloblastom är den vanligaste pediatrisk tumör i nervsystemet. En mängd djurstudier har fokuserat på cerebellär prekursorer granulat neuron (CGNPs) som cellen om ursprungsland för medulloblastom 1-4. Men de olika kliniska presentationer av medulloblastom subtyper hos människor (nodulär, Desmoplastiskt, klassisk och stor cell / anaplastisk), och det faktum att medulloblastom finns i en delmängd av mänskliga patienter utan ektopisk uttryck av CGNP markör 5, tyder på att cellulära och molekylära ursprunget medulloblastom är mer komplexa och långt ifrån fullständigt dechiffreras. Därför är det viktigt att avgöra om det finns ett alternativ medulloblastom tumörcellen om ursprungsland baserat på vilken celltyp specifika terapeutiska modaliteten kan utvecklas. För detta ändamål kommer intrakraniell orthotopic allografting av genetiskt märkta tumör celltyper följt av efterföljande analyser av sekundär tumörutveckling hos mottagare kunna bestämma den cellulära ursprunget av tumör-initiera celler. Här beskriver vi den experimentella protokoll för intrakraniell orthotopic allografting av medulloblastom celler från primära tumören, och detta förfarande kan även användas för att transplantera celler från etablerade cellinjer.
Protocol
1. Micro-dissekering av tumör-bärande lillhjärnan och dissociation av tumörvävnad
- Hämtning av tumörvävnad
- Sjuka möss med medulloblastom ofta runted och visa hydrocefalus och typiska neurologiska symtom, inklusive bakre förlamning och oförmåga att återfå ställning när välte. För att hämta tumörvävnad, euthanize möss med koldioxid inandning. Det är imporant inte utföra halsdislokation, ett förfarande som genererar trycket till den bakre skallen och kan äventyra tumörvävnad integritet.
- Halshuggning sker omedelbart efter döden med hjälp av en sax, ta bort hår och muskelvävnad så mycket som möjligt för god visualisering av skallen. Rengör ytan av skallen med Kimwipe indränkt med 95% etanol.
- Använd fin sax för att klippa en öppning längs mittlinjen av skallen och ta bort skallen vävnad med hjälp av fin pincett, då hela hjärnan, inklusive tumör-bärande lillhjärnan är utsatt för.
- Medan cerebella av friska vuxna visa väldefinierade halvklot och vermis, den cerebella av tumör-bärande möss är ofta förstorad, amorft med slät yta och iögonfallande blodkärl. Använda sterila tekniker, hämta lillhjärnan tumören med hjälp av pincett och lägg i iskallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Mg 2 + och Ca 2 +.
Observera: alla instrument desinficeras i 95% etanol och ånga autoklaveras före användning.
- Dissociation av tumörvävnad
- Överför tumörvävnad från PBS till 50% Accutase (som spätts i PBS) som är ca 4 gånger volymen av tumörvävnad, finhacka vävnaden med fina sax i 3 minuter vid rumstemperatur, följt av inkubering vid 37 ° C i 4 minuter , varefter vävnaden genomgår återkommande pipeting med en 1-ml Pipetman ytterligare 3 minuter. Denna metod bör ge en blandning av enskilda celler och små mobila aggregat.
- Späd cellulära fjädring 3-faldigt med PBS och centrifugera i 5 minuter vid 1000xg till pellets cellerna. (De förfaranden som ovan har beskrivits i "Isolering, anrikning och underhåll av celler medulloblastom stamceller", under tryckning JUPITER)
Resuspendera cellpelleten i nyberedd neurala stamceller medel som består av Neurobasal medium med glutamin, penicillin-streptomycin, N2, B27, mänskliga EGF (25 ng / ml) och grundläggande FGF (25 ng / ml). Beräkna celltäthet av lösningen och komma med lämpliga ytterligare spädningar med ytterligare neurala stamceller medium, som man kan ladda 4 mikroliter av lösning med ett lämpligt antal dissocierade tumörceller, t.ex. 5x10 5, i en steril avfasning spets 10μL spruta. Det exakta antalet celler som skall inokuleras bör bestämmas av forskaren enligt vissa experimentella krav. Håll cellen lösning i en mini-200μL mikrocentrifugrör (PCR rör) på is.
2. Anestesi för mottagaren Möss
För det kirurgiska ingreppet, är en desinficeras område för gnagare operation behövs under hela förfarandet. Helst inrätta en lång bänk med separata men närliggande områden för djur-beredning, drift fält och djur återhämtning. Operationshandskar, inte undersökningshandskar, krävs för operationen. Aseptisk teknik upprätthålls genom att hålla handskar på händerna ovanför midjan och används endast för att hantera sterilt objekt från en torr steril yta.
- En blandning av ketamin (100 mg ketamin per 1 kg av mus vikt) och xylazin (10 mg xylazin per 1 kg mus vikt) används för anestesi. Administrera anestetika intraperitonealt.
- Det tar normalt 3-5 minuter för anestetika att få full effekt. Avgöra om en mus är helt sövda av tå / svans nypa. Placera en liten mängd oftalmologiska salva på ögonen på musen. Ta helt sövd musen till operationsområdet, konstant övervakning för att kontrollera att musen är andas normalt.
3. Intrakraniell Ympning av tumörcellerna
- Raka dorsala bakre huvudet regionen av musen med en hårtrimmer, för att avslöja den bakre skallen ovanför mitthjärnan och lillhjärnan.
- Applicera Betadine lösningen på utsatta hårbotten med hjälp av en applikator bomull spets, följt av avtorkning med en spritsudd. Upprepa dessa två sterilisering steg två gånger.
- Gör en kvarts tum snitt i den bakre hårbotten med en steriliserad skalpell. Borra ett 0,5 mm Burr hål 2 mm till höger och 2 mm posteriort om lambda med en steril Tandläkarborrmaskiner.
- Placera musen på en stereotaktisk ram genom att koppla sina framtänder på ramen håll. Försiktigt ned och placera fasade spets 10 mikroliter spruta laddad med 4 mikroliter av tumörcellerna lösning i Burr hålet. När fasningen på SyriNBE nålen är under skallen ytan, gå ner ytterligare 3 mm och sedan stiga till 0,5 mm. Injicera långsamt önskad mängd tumörceller, med stadig kraft i en 30 sekunders tid, i lillhjärnan hos mottagaren. Låt nålen på sin plats efter avslutad injektion i ytterligare två minuter. Ta sedan bort nålen och sprutan. Clip såret med hjälp av en autoclip.
- Håll musen på en värmande filt efter operationen för att behålla sin kroppstemperatur. Rörlighet och respiratoriska mönster kommer att följas kontinuerligt. När musen återhämtar sig från anestesi, sätt tillbaka den i ett sterilt hölje bur. Övervaka dagligen för mat-och vätskeintag, beteende, grooming, och röda fläckar i ögonen. Inspektera för tecken på infektion snittet platsen. Ta bort autoclips på dag 7 efter ingreppet.
Behåll mössen i genomsnitt 2-6 månader och offer de som visar typiska medulloblastom symptom för vidare studier.
4. Representativa resultat
Sekundär medulloblastomas utvecklats i mottagarens möss liknade mycket de av primära tumörer. Den cerebella med sekundära tumörer var ofta förstorad, amorft med ektopisk blodkärlen tydligt när ses som hel-fästen. Immunhistokemiska analyser av sekundära tumörvävnad visade att tumörceller är mycket proliferativ, uttrycka starka SmoM2-YFP och markörer för cerebellär prekursorer granulat neuron, som Math1 och Pax6. När dissocierade och odlade med hjälp av redovisade metoder ("Isolering, anrikning och underhåll av celler medulloblastom stamceller", Jové under tryckning), kan den sekundära medulloblastom tumörceller byggas ut snabbt, uttrycka flera stamceller markörer, är klonogena och kan ytterligare initiera tumörbildning när transplanteras in ytterligare nedsatt immunförsvar mottagare.
Figur 1. Typiska hel-fäste och sektions utsikt över en sekundär medulloblastom vävnad
Ett typiskt exempel på sekundär medulloblastom vävnad utvecklad 26 dagar efter injektion av 5x10 5 primära tumörceller. Hematoxylin färgning avslöjar typiska cellulär morfologi medulloblastom, inklusive hög kärn / cytoplasmiska förhållandet och nukleära polymorfism. Dessa sekundära tumörceller är mycket proliferativ vilket framgår av Ki67 uttryck och de har också kraftfullt uttryck membranös SmoM2-YFP.
Figur 2. Sekundär medulloblastom celler kan odlas och expanderade in vitro
Använder protokollet beskrivs för galvaniska element mus medulloblastom ("Isolering, anrikning och underhåll av celler medulloblastom stamceller", Jové under tryckning), kan dessa sekundära medulloblastom celler odlas och utökas för flera passager. Bilden visar samma kolonin representant tumör odlade på 4 dagar och 14 dagar. Den odlade tumörceller är bipolär, avlånga med knappa cytoplasma och ofta strålar ut från en tät kärna av cellulära samlade. De uppvisar inte hämning tillväxt kontakt. De små runda celler är röda blodkroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera kritiska faktorer för en lyckad medulloblastom cell allografting som ger sekundära tumörbildning är följande: Först använder endast 50% Accutase för vävnadsdissociering och inte över-smälta den vävnad som långvarig enzym behandling leder till betydande minskning av cellernas livskraft. Använd också bara 1 ml stora Pipetman som mindre tips kan även generera fysiska skador på dissocierade celler. Det är bra att ha en blandning av enskilda celler och små aggregat för allografting. För det andra, blanda och balansera att tumörcellerna lösningen varje gång innan du laddar Hamilton sprutan. Använd inte mer än 4 mikroliter för varje injektion som en större volym skulle generera för mycket intrakraniellt tryck och motstånd. Senast är det viktigt att vänta ytterligare 2 minuter för att låta den injicerade lösningen försvinna i lillhjärnan vävnad efter varje injektion.
De förfaranden som beskrivs här gör det möjligt att fastställa genetiskt märkta celler (er) som kan initiera och sprida tumörer. Detta protokoll gäller också situationer där de celler som ska injiceras inte härrör direkt från primär tumörvävnad, men från etablerade odlade cellinjer. Man kan förbereda lämpligt antal celler genom att antingen enzymet matsmältning och / eller repetitiva pipettering och börja från steg 2 i detta protokoll. Därför kan vi testa också funktioner kandidatgener och hämmande effekt av kemiska föreningar med en in vivo tumör-tillväxten avläsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats med bidrag från Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485) Childhood hjärntumör Foundation och National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
