Summary
Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). VEC pode ser isolado de ambos os lados da cúspide ou folheto e imediatamente a seguir, a célula intersticial subjacente isolamento (VIC) é simples.
Abstract
Válvulas do coração é o único responsável por manter o fluxo sanguíneo unidirecional através do sistema cardiovascular. Esses finos, tecidos fibrosos são submetidos a tensões mecânicas significativas como abrir e fechar vários bilhões de vezes ao longo de uma vida. A resistência incrível destes tecidos é devido ao valvular residente endotelial (VEC) e células intersticiais (VIC) que constantemente reparação e remodelação em resposta a sinais locais mecânico e biológico. Apenas recentemente nós começamos a compreender os comportamentos ímpares dessas células, para o qual a experimentação in vitro tem desempenhado um papel fundamental. Particularmente desafiante é o isolamento e cultura de VEC. Cuidado especial deve ser usado a partir do momento em que o tecido é removido do host através de revestimento final. Aqui apresentamos os protocolos para o isolamento direto, o isolamento lado específico, cultura e verificação das populações puras de VEC. Usamos digestão enzimática seguido por uma técnica suave swab raspagem para retirar células da superfície somente. Estas células são então coletadas em um tubo e centrifugado em um pellet. O pellet é ressuspenso em seguida, e banhado em frascos de cultura pré-revestida com colágeno da matriz I. Fenótipo VEC é confirmado pelo contato inibiu o crescimento ea expressão de marcadores endoteliais específicos, tais como PECAM1 (CD31), fator de von Willebrand (vWF), e expressão negativa de alfa-actina de músculo liso (α-SMA). As características funcionais do VEC estão associados com altos níveis de LDL acetilada. Ao contrário de células endoteliais vasculares, VEC tem a capacidade única de transformar em mesênquima, que normalmente ocorre durante a formação embrionária válvula 1. Isso também pode ocorrer durante significativamente confluentes pós prolongada na cultura in vitro, assim que o cuidado deve ser feito para passagem em ou perto de confluência. Após o isolamento VEC, populações puras de VIC podem ser facilmente adquiridos.
Protocol
1. Preparação
- Autoclave em um instrumento coberto bandeja os seguintes itens:
- Pinça serrilhada - Para manuseio do tecido folheto
- Tesoura de tecido (8 cm) - Para corte de tecido e folheto cúspides
- Cotonetes de algodão - Para isolar a camada endotelial do folheto ou cúspide
- Fazer a solução de colagenase estéril
- Adicionar 4,0 gramas de pó DMEM para 250 mL de água de 18 mohms.
- Adicionar 1,11 gramas de bicarbonato de sódio.
- Add (600 U / mL) 180.000 unidades de colagenase.
- Adicionar 1% (3 mL) Penicilina / Estreptomicina.
- Ajustar o pH da solução para 7,2.
- Levar a solução até 270 mL.
- Esterilizar a solução, passando por um filtro de 0,2 mm.
- Adicionar 10% (30ml) de soro fetal bovino estéril.
- Faça médio de células endoteliais estéril
- Adicionar 6,7 gramas de pó DMEM para 400 mL de água de 18 mohms.
- Adicionar 1,85 gramas de bicarbonato de sódio.
- Adicionar (50 U / mL) 25.000 unidades de heparina.
- Adicionar 1% (5 mL) Penicilina / Estreptomicina.
- Ajustar o pH da solução para 7,2.
- Levar a solução até 450 mL.
- Esterilizar a solução, passando por um filtro de 0,2 mm.
- Adicionar 10% (50 ml) de soro fetal bovino estéril.
- Faça médio de células estéreis intersticial
- Adicionar 13,37 gramas de pó DMEM para 800 mL de água de 18 mohms.
- Adicionar 3,7 gramas de bicarbonato de sódio.
- Adicionar 1% (10 ml) Penicilina / Estreptomicina.
- Ajustar o pH da solução para 7,2.
- Levar a solução até 900 mL.
- Esterilizar a solução, passando por um filtro de 0,2 mm.
- Adicionar 10% (100 mL) de soro bovino estéril.
2. Isolamento dos folhetos da válvula cardíaca
- A raiz da aorta especiais de consumo imediato e de forma asséptica do coração após o sacrifício.
- Lave bem a raiz da aorta de sangue com o frio DPBS estéril. É imperativo para remover todos os componentes do sangue o mais rapidamente possível para limitar o VEC morte e contaminação bacteriana. Antibióticos e antimicóticos não são aconselhados, nesta fase, uma vez que são potencialmente prejudiciais para o VEC.
- Isolar folhetos da válvula (3 por válvula) diretamente a partir da raiz e coloque em um tubo cônico 15 mL estéril preenchida com 12 mL DPBS frio. Agite várias vezes para remover os resíduos e reabastecer com DPBS fresco.
- Transporte para o laboratório em gelo.
- À chegada ao laboratório, colocar o recipiente com o tecido sob o capô estéril.
3. Isolamento da camada endotelial
- Encha um prato estéril 35mm com 3 mL de solução de colagenase frio por válvula (3 folhetos).
- Coloque todos os três folhetos do tubo de 15 mL para o prato cheio com a solução de colagenase.
- Incubar o tecido por 5-10 minutos a 37 ° C.
- Remover suavemente a camada endotelial girando um algodão estéril e seco sobre a superfície do folheto. O sentido de rotação ea quantidade de cisalhamento aplicada é crítica para a pureza de sua amostra. A rotação da haste deve ficar em uma direção oposta ao movimento linear de sua mão criando uma tesoura controlada. Este corte é o que levanta a células endoteliais do tecido. A quantidade de força aplicada deve ser suficiente para sentir a resistência do tecido, mas, não penetram na membrana basal.
- Ocasionalmente, dab o swab dentro da solução de colagenase para desalojar as células das fibras ponta. Depois de esfregar está completa, a textura da camada endotelial deve se sentir um pouco mais suave do que antes.
- Recolher a suspensão de células / colagenase e transferir para um tubo estéril nova 15mL.
- Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 5 minutos para sedimentar as células isoladas e aspire o sobrenadante. Se isolar células intersticiais, bem como, realizar esse protocolo, enquanto essas células estão sendo centrifugado.
- Adicionar 3 ml de meio de suínos endoteliais para os 15 tubos mL, centrifugar uma segunda vez, e mídia aspirar. Esta segunda centrifugação ajuda a filtrar alguns dos materiais indesejáveis, tais como fibras de ponta.
- Re-suspender as células endoteliais centrifugadas em 5 mL de meio de suínos endoteliais e placa de as células em um pré-revestido frasco de T-25 com colágeno (use um frasco por tubo de centrifugação).
- Permitir que as células crescer pelo menos 2-3 dias antes de mudar o meio endoteliais. Isto ajuda a recuperar as células e dividir uma vez que o processo de isolamento é bastante dura eo rendimento das células pode ser baixo. É fundamental para as células passagem perto confluência vez que a inibição de contato pode levar à transformação celular.
4. Preparação de 60 Dish Cultura mm para isolamento específico Side
- A linha de 60 mm de vidro placas de Petri com papel de alumínio (2 pratos de vidro por leaflet). A folha de alumínio ajuda a remover a parafina, de modo que a placa de Petri de vidro pode ser reutilizado para outros isolamentos.
- Lugar contas de parafina dentro dos pratos, cerca de metade cheio, e cobertura para autoclave.
- Uma vez que a autoclave é completo e de parafina é derretida, mova o ensemble prato para uma superfície fria plana. Como a parafina esfria, ele vai endurecer e criar uma camada que irá apoiar punções de agulha.
- Após 30 minutos, o prato esterilizado pode então ser usado como uma câmara de isolamento para imobilizar o tecido folheto.
5. Isolamento de camada específica Side endotelial
- Remove os folhetos dos tubos 15mL e coloque no prato de cultura preparado 60mm para isolamento específico lado.
- Manipular o folheto de modo que o lado ventricularis é a face para baixo sobre a superfície de parafina deixando o lado fibrosa expostos. Pin das bordas do folheto para expor a camada endotelial.
- Coloque algumas gotas de colagenase frio em cada superfície (para cima-facing) e incubar endoteliais do tecido por 5-10 minutos a 37 ° C.
- Como antes, remover suavemente a camada endotelial girando um algodão estéril e seco sobre a superfície do folheto. O sentido de rotação ea quantidade de cisalhamento aplicada é crítica para a pureza de sua amostra. A rotação da haste deve ficar em uma direção oposta ao movimento linear de sua mão criando uma tesoura controlada. Este corte é o que levanta a células endoteliais do tecido e nada mais. A quantidade de força aplicada deve ser suficiente para sentir a resistência do tecido, mas, não penetram no tecido.
- Ocasionalmente, dab o swab dentro da solução de colagenase para desalojar as células das fibras ponta. Depois de esfregar está completa, a textura da camada endotelial deve se sentir um pouco mais suave do que antes.
- Recolher a suspensão de células / colagenase e transferir para um tubo estéril nova 15mL. Indicam especificidade lado na etiqueta (folhetos da válvula mesmo pode ser agrupados).
- Transferir os folhetos para um prato nova cultura para que o lado ventricularis está agora exposta e repita os passos (5,3-5,6).
- Uma vez que todos suspensão celular / colagenase é coletado, centrifugar os tubos a 1000 rpm por 5 minutos para sedimentar as células isoladas e aspire o sobrenadante. Se isolar células intersticiais, bem como, realizar esse protocolo, enquanto essas células estão sendo centrifugado.
- Adicionar 3 ml de meio de suínos endoteliais para os tubos, centrífuga uma segunda vez, e aspire mídia. Esta segunda centrifugação ajuda a filtrar alguns dos materiais indesejáveis, tais como fibras de ponta.
- Re-suspender as células endoteliais centrifugadas em 5 mL de meio de suínos endoteliais e placa de as células em um pré-revestido frasco de T-25 com colagem (use um frasco por tubo de centrifugação).
- Permitir que as células crescer pelo menos 2-3 dias antes de mudar o meio endoteliais. Isto ajuda a recuperar as células e dividir uma vez que o processo de isolamento é bastante dura. Se você observar o rendimento ser muito baixa, considerar a mudança para um pequeno frasco ou placa bem desde a adesão célula-célula promove o crescimento celular. Lembre-se de passagem perto confluência vez que a inibição de contato pode levar à transformação celular.
6. Isolamento de células intersticiais
- Encha um tubo de centrifugação estéril 15 mL com 10 mL de solução de colagenase por válvula (3 folhetos).
- Depois de esfregar os folhetos de células endoteliais, imediatamente colocá-los no tubo apropriado 15mL com a solução de colagenase.
- Incubar por aproximadamente 12 a 18 horas (agitar suavemente se desejar).
- Misture delicadamente o tecido degradadas com uma pipeta sorológica, até suspensão de células / colagenase fica homogeneizado. Esta homogeneização ajuda a quebrar o tecido e liberar as células intersticiais.
- Centrifugar o tecido digerido por 5 minutos a 1000 rpm e aspire o sobrenadante.
- Adicionar 5 mL de médio suína intersticial para os tubos de 15mL, centrífuga uma segunda vez, e aspire sobrenadante.
- Re-suspender as células endoteliais centrifugadas em 5 mL de meio de suínos intersticial e placa de as células em um T-75 frasco (use um frasco por tubo de centrifugação).
- Permitir que as células crescer pelo menos 1-2 dias antes de mudar o meio de célula intersticial. Haverá restos de tecido muito mais do que com as células endoteliais, mas, que é esperado. As células também deve crescer a confluência mais rápido que as células endoteliais por causa do rendimento das células e sua natureza.
7. Imagens representante
Figura 1. A morfologia das células isoladas em 2-3 dias após o isolamento. (A) VEC apresentam uma morfologia típica endoteliais e formar grupos para promover o crescimento. (B) VIC morfologia é semelhante a miofibroblastos que geralmente são fusiformes e espalhe uniformemente em todo o frasco.
Figura 2. A morfologia das células isoladas na confluência. (A) VEC apresentam uma morfologia típica endoteliais que geralmente são de paralelepípedos e contactar o crescimento inibido. (B) VIC morfologia é semelhante a miofibroblastos que geralmente são fusiformes e não contato com crescimento inibido.
Figura 3. As características da função de células isoladas 6. (A) VEC estão associados com altos níveis de captação de LDL acetilada (vermelho). (B) VIC estão associados com baixos níveis de captação de LDL acetilada.
Figura 4. Marcadores celulares de células isoladas 6. (A) fenótipo VEC é contribuído para coloração positiva para o Fator de Von Willebrand (verde), azul (núcleos). (B) é o fenótipo VIC contribuiu para coloração negativa de Von Willebrand.
Figura 5. Marcadores celulares de células isoladas. (A) fenótipo VEC é contribuído para coloração negativa para alfa-SMA (verde), azul (núcleos). (B) é o fenótipo VIC contribuiu para coloração positiva para a SMA alpha.
| Dissociação Agent | Dissociação Técnica | Coleta de célula | Quantidade de células | Célula Pureza | Contaminação |
| EDTA (3mm) sem CaCl 2 | 5, 20, 60 min. antes disso CaCl 2 | 20, 60, 120 min. antes da coleta | - | + / - | + + + |
| EDTA (6mm) sem CaCl 2 | 5, 20, 60 min. antes disso CaCl 2 | 20, 60, 120 min. antes da coleta | + / - | + | + + + |
| Tripsina-EDTA (0,5 g / L) | 5, 10, 15 min. antes de desactivação | Médias coletadas imediatamente | + | + | + + |
| Colagenase II (300 U / mL) | 5, 10, 15 min. antes de desactivação | Médias coletadas imediatamente | -, +, + + | -, + +, + | + |
| Colagenase II (600 U / mL) | 5, 10, 15 min. antes de desactivação | Médias coletadas imediatamente | +, + +, + + + | + +, + +, - | - |
Tabela 1. Resultados preliminares de valvular protocolos de isolamento das células endoteliais.
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Discussion
Uma compreensão da biologia valvular tem sido prejudicada por dificuldades técnicas de isolamento e as populações de cultura pura de células endoteliais valvular. Técnicas de isolamento típico envolvem digestão enzimática da matriz subjacente basal ou dissociação química de ligações adesivas endotelial 2,3. Experimentos de isolamento preliminares foram avaliados qualitativamente por diferentes agentes dissociação e períodos de incubação. Os resultados destes experimentos mostraram que EDTA de incubação (ou Tripsina-EDTA) para até 60 minutos não teve sucesso em células desalojar. No entanto, uma digestão collagense por 5-10 minutos mostrou-se eficaz para recuperar um número útil de pura valvular células endoteliais (Tabela 1). Soluções de outras enzimas têm sido sugeridas, tais como a suplementação com dispase, uma metaloprotease capaz de visar especificamente o colágeno tipo IV e fibronectina, que são componentes principais da matriz subjacente 4. Células liberadas pode ser purificado por meio de processamento adicionais, tais como a expansão clonal ou métodos de selecção magnética 5.
Evidências recentes sugerem que a válvula aórtica contém uma distribuição muito heterogênea de tipos celulares que podem levar a dificuldades na avaliação fenótipos celulares. Em contraste com o endotélio vascular, VEC também deve alinhar perpendicular à direção de fluxo de fluido 6. Perfis transcricional da VEC são dependentes tanto do lado de especificidade e de ambiente mecânico. Aórtica em relação endotélio lado ventricular foram identificados como tendo distintos fenótipos endotelial in vivo. Os perfis de expressão gênica sugerem que o endotélio na válvula aórtica é propenso lado a lado, mas a calcificação protegido contra iniciação inflamatória por mecanismos antioxidantes 7. Na presença de fluxo de cisalhamento, as células endoteliais para baixo genes regulados calcificada, tais como BMP-4 e POSTN manter seu fenótipo quiescente. Fluxo de cisalhamento parece agir como uma medida de protecção para os tipos de células endoteliais de Chondro / osteogênico diferenciação, que é uma possível explicação para a proteção endotelial ventricular 8.
Isolamentos clonal da valva aórtica humana pulmonar sugeriram um espectro de células progenitoras endoteliais existem expressando diferentes quantidades de α-SMA, CD144 e CD31. Alguns foram mostrados a transição para um fenótipo mesenquimal, análoga à EMT, especificamente em resposta a TGFB2 em diferentes graus 9. Isolamento clonal provar ser uma maneira eficaz de purificar populações de células, mas seleciona para subpopulações específicas que podem ter singularidade fenotípica que não é generalizável. Isto é muito importante para endotélio de superfície, como muitos outros tipos de células estão presentes em quantidades diferentes de zero. Estes incluem circulando células endoteliais, células derivadas da medula óssea e monócitos, que pode expressar uma ou mais características semelhantes endotelial 10, 11. Além disso, os isolados clonal sofrer muitas divisões celulares para atingir o número de células adequado para experimentos, altura em que muitos não-fenótipos progenitor terá envelheceram ou indiferenciado. Portanto, o isolamento de células primárias, como descrito aqui dá a melhor representação da população valva nativa endoteliais. O desafio será o de verificar se sub-fenótipos que emergem são intrínsecos ou emergem de respostas diferenciadas aos estímulos externos. Com esta abordagem, um deve ser capaz de determinar a prevalência relativa de cada um e suas conseqüências, em resposta a tratamentos específicos.
Métodos de triagem magnética também forneceram uma forma de purificar populações de células, mas são altamente dependentes das condições de anticorpos rotulagem e população de células derivadas. Com a crescente compreensão populações válvula de celular, marcadores endoteliais, tais como CD31, CD144, e negativo α-SMA pode não ser suficiente para classificar para uma população valvular puro. Isolamentos clonal provaram que células endoteliais contêm um amplo espectro de expressão marcador levando a imprecisões possível com a classificação. Quando as células endoteliais classificadas foram classificados para CD31, a pureza da amostra aumentou para quase 96%. No entanto, células intersticiais começou a reaparecer em culturas cresceu um dia pós confluência-4. Embora a classificação magnética é uma opção, deve-se considerar a classificação para os marcadores adicionais e níveis de expressão, como positivo para CAD-11 e negativo para periostin 6.
Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). Usando este método de processamento adicional, como o isolamento e os métodos de selecção clonal magnética podem ser eliminados para atingir uma população representativa de lado específico de células endoteliais. Célula morfologia, características funcionais, múltiplos marcadores, e níveis de expressão devem ser considerados quando se avalia a população.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa é apoiada pela concessão de CARREIRA NSF, a Fundação Hartwell, e da American Heart Association (# 0830384N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 50-103-PB | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300-058 | |
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Critical Swabs | VWR international | 89031-270 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | |
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | |
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 24 Well Plate | Falcon BD | 353047 | |
| 60x15 mm Dishes | VWR international | 25384-092 | |
| 60x15 Glass Dishes | VWR international | 89000-310 | |
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | |
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | |
| 500 mL Nalgene Filters | VWR international | 73520-985 | |
| 1L Nalgene Filters | VWR international | 73520-986 | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | |
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
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