Summary
この記事では、生体力学とmechanobiological研究のためにラット尾腱を調製するのに使用される実験手順を説明します。準備の主要なステップのいくつかの機能は、すすぎとバイオリアクターチャンバーにロードし、抽出、断面積の測定をはじめ、実証されています。
Abstract
ラット尾腱（ラウンドトリップ時間）は、腱生理学と腱の分野でのin vitro研究で実験に使用される一般的な生物学的なモデルです。これらの組織での作業は、彼らは非常に壊れやすいので、挑戦、そして今まではその分離には厳密に詳細なプロトコルはなかったさ。
これらの課題に直面し、我々は、ラウンドトリップ時間と制御の組織の生存性、無菌性と整合性の操作を容易にするための方法と手段を開発している。この記事では、生体力学とmechanobiological研究のためのRTTを準備するために使用される実験手順を説明します。バイオリアクターチャンバーに洗浄し、ロード、抽出、断面積の測定：私たちの仕事は主に4つのステップに分かれています。
それらは簡単に再現できるように、各ステップで、すべての手順、材料や操作を詳細に表示されます。また、開発された特定の楽器が紹介されています：RTTのを分離するために使用される操作板は、断面積の測定や、アンカーのシステムの間に組織を配置する光学マイクロメータは、バイオリアクターへのRTTを添付すること。
最後に、我々は我々の方法を検証するために複数のテスト後に得られた結果を説明します。実行可能性、滅菌性および完全性の評価は、私たちの手続きは、このようなラット尾腱のような脆弱な組織の操作のための十分に厳格であることを示している。
Protocol
どんな操作する前に、あなたが行っている実験と処分で装置に応じて使用される腱のグループを識別する必要があります。彼らは小さいと断面積を測定し、バイオリアクターチャンバーにそれらをフィットする際に操作するため、容易であるため、我々の目的のために、腹側腱が選ばれました。
すべての楽器はオートクレーブまたは70％エタノールで滅菌されていることに注意してください。また、70％エタノールを含むスプレーボトルは、各操作の前に実験者の手袋を消毒するために、各ワークステーションの横に配置されて。
パート1：抽出
切除後、尾は慎重に組織の損傷を防ぐために、その四肢によって操作されます。また、細胞の生存率を節約するために、すべての操作は冷生理食塩水で実施されています。
1A）材料：
- 冷たい生理食塩水（D - PBS）
- クラッシュアイス
- 表面プロテクター
- まな板
- 個々の操作プレート
- 2 500ミリリットル料理
- 2 2Lガラスの皿
- 接着テープ
- 1ピンセット
- 1鉗子
- 1ピンセットスタンド
- 外科鋏の1ペア
- 1メス
- 手術用ハサミの1ペア
図1の向きの識別による個別操作（"近位"は"P"）
1B）ワークステーション：
- 表面プロテクターを広げ、その上にまな板を置く。
- 砕いた氷を半分に、それぞれ2つの大型ガラス皿を記入し、紙の上に置きます。
- 操作板の角にテープを貼り、近位端を示すために文字で識別する。
- 冷食塩水で半分に二つの小さなガラスの皿と操作板のすべての溝を埋める。氷を含む大規模なガラスの皿に置いてください。
- 表面の保護上のすべての滅菌機器を整理する。
- 生理食塩水を含むガラス皿の一つに尾を移す。
1C）操作：
- 背側から腹側を区別するために尾の近位端の解剖学的構造を観察。腹側には、腱と優しく血液の小さな滴を生成するために尾を絞って検証することができる血管の大きい数を持っています。
- あなたが腹腱を（またはあなたが背腱が必要な場合は、腹側に沿って）抽出する場合は、外科はさみを使用して、尾の背側に沿って皮膚をカット。
- 近位端で切開を開き、慎重にテールの端を操作することにより、鉗子またはあなたの指を使って皮膚を削除し、。
- 生理食塩水で血液や髪を洗い流すと、新鮮な溶液を含む残りのガラス皿に試料を移す。手袋を変更します。
光学顕微鏡下で観察横断セクションは、6つの腱のグループを示しています。各グループから1つの腱は、それぞれの脊椎骨の尾側端に取り付けられているので、カットに沿って新たな腱を公開するために椎間板でカットされます。
図2。光学顕微鏡下で観察したラットの尾部の横断セクション。 - 外科はさみで短く軟骨2〜3椎骨を通して遠位端をカット。メスを用いて軟部組織を切断してすぐに溶液中でそれを置き換えるためにまな板の上の尾を置きます。
- ピンセットを使用して、遠尾部の端から一腱を引き出します。
- 両端にある穏やかなホールドで、個々の操作板に腱を配置。
それ以上腱まで、最後の2つの手順を繰り返しますが出からかわれ、新しい組織が露出する必要があればoneの椎骨を短くカットすることができます。
パート2：断面積の測定7
組織が機械的特性評価や刺激を受けるとき、その機械的性質は、ストレスに腱の内部に力を正規化して記述されています。これは、我々は断面積を評価する理由です。
2A）材料：
- 光マイクロメータ
- 実体顕微鏡
- デジタルカメラ
- エッジ認識とプロファイルの再構成アルゴリズム5,6
- 冷たい生理食塩水（D - PBS）
- 1 20 -200μLマイクロボリュームのピペット
- 光学マイクロメータの調整のための1 16進数のキー
- 2ピンセット
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図3。光学マイクロメータ
2B）ワークステーション：
- ソフトウェア（デジタルカメラおよびアルゴリズム）を開きます。
- 装置の腱をロードするのに十分な余地があるように、光マイクロメータを配置。
- 楽器や手元に置いて抽出した腱を含むガラス皿を整理する。
2C）操作：
- 両方のアンカーシステムが水没するまで冷生理食塩水で測定する区画を埋める。
- ピンセットで端を保持してコンパートメントに腱を転送します。
- マイクロボリュームピペットを介して吸引を使用して、シリコンチューブに一度に四肢を引く。端がシャフトのカラーを超えたまで吸引する。
- チューブを圧縮し、実体顕微鏡下で装置をインストールするには、シャフトのカラーを締めます。
- 折り目はもはや知覚されなくなるまで組織を観察しながら、105Xの倍率で、腱を伸ばす。追加の0.40パーセントでストレッチ。
図4：前と延伸後の105x倍率で腱投影。 - 位置を調整し、180 °回転以上腱の鮮明な画像を維持するために焦点を当てる。
- 緊張、フォーカスや位置を変更せずにすべての10 °の回転で写真を撮る。ローテーションを実施する唯一の回転軸を使用してください。その円錐形のために、これらの手順は、腱に沿って異なる点で繰り返すことができます。
- あなたが登録したデータベースを分析するために、エッジの認識と、プロファイルの再構成アルゴリズムをアクティブにします。
- シャフトのカラーを緩めて、マイクロボリュームのピペットを用いてシリコンチューブに空気を吹き付けることによって腱を解放する。
- 再び端でそれを処理、操作プレートの上に腱を挿入しなおす。
- 得られたプロファイルの再構成と断面積の値の形状を確認してください。
パート3：すすぎ
前回の操作中に発生した汚染物質を除去するために、組織は、バイオセーフティーキャビネットでリンスする。
3A）材料：
- 冷たい生理食塩水（D - PBS）
- 複数の溝操作プレート
- 個々の操作プレート
- 接着テープ
- 2ピンセット
- 1ピンセットスタンド
3B）ワークステーション：
- 事前にバイオセーフティキャビネット15分でファンをオンにし、70％エタノールで内側の表面をきれいに。
- バイオセーフティキャビネット内のすべての楽器を持参してください。
- 近位端を識別するために、個々のプレートの角の上にテープの断片を貼り付けてください。
- 滅菌生理食塩水で、全ての溝を埋める。
3C）操作：
- キャビネットで抽出された腱を含む操作のプレートを導入する。
- ピンセットを使用して、両端にある穏やかな把握と、そのプレートから腱を取り外します。
- 浸すと優しく近いから開始し、遠い溝に進む、複数の溝操作プレートの各区画の生理食塩水で腱をかき混ぜる。
- 最後に、水没個々の操作板の腱。
第4部：バイオリアクターチャンバーにロード
さらなる汚染を避けるために、以下の操作は、バイオセーフティーキャビネットで行われます。
4A）材料：
- バイオリアクターチャンバー4
- 無菌アンカー
- 1滅菌ペトリ皿
- コールド細胞培養培地（DMEM）
- シアノアクリレート
- 2ピンセット
- ピンセットスタンド
- 0.5 -10μlのマイクロボリュームピペット
- 1ルーラー
図5。リアクターチャンバー
4B）ワークステーション：
- 前のステップはまた生物学的安全キャビネット内に実現されて以来、不必要なツールの除去はより多くの作業スペースを与える。
- キャビネット内部のすべての他の楽器を持参してください。
4C）操作：
- 腱四肢上の中心と組織を巻き上げ、そのスプールにとスプール周りの操作板の上にアンカーを置きます。
- アンカーをロールオーバーし、組織がアンカーに接続されているとどまることを確保しながらゆるい四肢を開催。 ¾ターン後に停止します。
- 同じことを行うもう一方の端でのステップ。
- それらのセンター1間は6センチメートルになるまで均等に上の両方のアンカーをロールバックします。
- 溶液に浸漬し、固定されたセクションは、その機械的性質2-3を強化するために一時的に乾燥させるため腱を緩めます。
- シャーレにシアノアクリレート注ぐとマイクロボリュームのピペットに2.5μLを描く。
- 生理食塩水内の任意の接着剤を落とすことなく、傷アップの組織へのシアノアクリレートのドロップを適用します。 2滴を各アンカーに適用されるまで繰り返します。
- 腱がまだ完全に浸漬して、完全に乾燥するために接着剤を5分待ちます。
- この時間の間に、生理食塩水でチャンバー区画を埋める。
- 損傷を防ぐために、生理食塩水ですべての組織を再水和。
- 唯一のアンカーを操作することにより、バイオリアクターチャンバーに腱を転送し、転送中に漏れや汚染を防ぐために、それを閉じます。
パート5：代表的な結果：
プロトコルの結果が正しく実行されたときに、私たちの組織厳密な分離と準備手順は、組織の無菌性、生存性および完全性を維持する事を可能にしていることを示しています。
最初に、単純で反復的な抽出法を用いて、我々はそれを抽出後に実現したH＆E汚染されたセクションの顕微鏡分析によって観察することができるようにコラーゲンのネットワークにダメージを与えることなく、尾腱を抽出することができます。
図6。解凍後の腱コラーゲンのネットワーク（H＆Eで染色さ5μmの縦断面図）。
最大10日と実施された無菌試験のために我々は、その後、培養腱。毎日、我々は、メッキは、寒天培地上に培養液を使用し、24時間のためにそれをインキュベートした。は細菌の増殖が観察されなかったので、我々の操作は汚染が発生しないと結論付けた。
プロファイルの再構成アルゴリズムと光学マイクロメータで、我々は、エラー7の2％のマージン内に断面積を推定することができます。
図7。RTTのプロフィール再建。
最後に、我々は、洗浄ステップの後および12日間の培養期間後に、哺乳動物細胞用LIVE / DEADバイアビリティ/細胞毒性キットを使用して実行可能性を評価した。緑色蛍光生細胞の大多数が明白だったので、我々は分離法が生きている組織を維持に成功していることを確認することができます。同試験は、バイオリアクターチャンバーに腱をアタッチした後、二時間を実施した。我々は、アンカーで脱水し、接着剤が両方アンカーの間の組織に広がっていなかったことを確認。
図8。アンカーでの組織の生存率（緑=生細胞、赤=死細胞）
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Discussion
これらの実験手順を適用することにより、我々は組織のこの種のin vitro試験での多種多様を行うことができます。例として、組織の変性に関する研究は10日間の期間のためのラウンドトリップ時間に下の刺激のアプリケーションによって行われました。毎日、我々は非破壊応力緩和試験では組織の機械的特性を評価した。終わりに、我々は、RTT応力変化を観察するため、機械的性質の進行を分析することができた。
図9。RTTの応力変化を評価トラフの応力緩和試験（1日目〜10）。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この記事は、NSERCグラント＃299280、M.シールに学部学生研究賞としてG.の親とFRSQへの奨学金としてIRSSTによってサポートされていました。我々はビデオに記録された操作を実行するためのYoanレミュー- Lanevilleに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
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