Summary
Identifiering av mikrobiella mål för adaptiv immunitet idiopatisk sjukdomar kan ske genom användning av enzymkopplad immunospot analys.
Abstract
Adaptiv immunitet är en viktig komponent för att clearance av intracellulära patogener. Förmågan att upptäcka och kvantifiera dessa reaktioner hos människor är ett viktigt diagnostiskt verktyg. Den enzymkopplad immunospot analys (ELISPOT) ökar i popularitet för sin förmåga att identifiera cellulära immunsvar mot mikrobiella antigen, inklusive immunsupprimerade patientgrupper, såsom patienter med HIV-infektion, transplantation och steroider. Denna analys har kapacitet att kvantifiera immunsvaret mot specifika mikrobiella antigener, samt särskilja om dessa svar är Th1 eller Th2 karaktär. ELISPOT är inte begränsat till platsen för inflammation. Den är mångsidig i sin förmåga att bedöma för immunsvaret i perifert blod, liksom i nätverket aktivt engagemang som lungsköljning, cerebrospinalvätska, och ascites. Upptäckt av immunsvar mot en enstaka eller flera antigener är möjlig, samt specifika epitoper inom mikrobiella proteiner. Denna analys underlättar upptäckt av immunförsvaret över tid samt skillnader i antigener erkänts av celler värd T. Tvåfärgade ELISPOT-analyser finns för detektion av samtidiga uttryck av två cytokiner. Nyligen tillämpningar för denna teknik inkluderar diagnos av extrapulmonell tuberkulos, liksom undersökning av bidrag av smittsamma antigener till autoimmuna sjukdomar.
Protocol
För följande protokoll, använder vi perifera mononukleära blodceller (PBMC) som de celler av intresse. Dock kan detta protokoll användas tillsammans med andra celltyper. Utför analysen i en vävnad kultur huva med steril teknik.
Dag 1: Förberedelse av Plate och celler
- Ta ut ett ELISPOT platta och öppna den i huven.
- Tvätta plattan 3 gånger med 150 mikroliter 1X PBS med hjälp av en flerkanalspipett, om tillgängligt, annars är enda väl pipettering acceptabelt.
- Ta ut ett paket av reservoarer och öppna den i huven.
- Tillsätt 2 mikrogram / ml fånga antikroppar, anti-humant interferon-γ, till 11 ml av 1X PBS. Vortex väl. Överföring antikropp blanda till en reservoar.
- Häll 100 mikroliter av beläggningen lösningen i varje brunn med hjälp av flera kanaler.
- Linda plattan i parafilm.
- Placera plattan i kylskåpet över natten. Plattorna är bra för veckor. Tumregeln är att om det fortfarande finns vätska kvar i brunnarna, kan plattan användas.
Cellberedningen
Om PBMC är färska då räknas cellerna och inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO 2. För PBMC förvaras i flytande kväve, upptining av celler är nödvändig. Protokollet är följande:
- Tina cryovial av celler i 37 ° C vattenbad tills nästan helt upptinad.
- Omedelbart resuspendera i 5 ml R10 medier.
- Spin i 5 minuter vid 225 x g.
- Resuspendera igen i 5 ml R10 media och räkna livskraftiga celler med hjälp av trypan blå.
- Ta med koncentration till 2 x 10 6 celler / ml i R10 medier.
- Vila över natten vid 37 ° C med 5% CO 2.
Dag 2: Inrättande av Plate
- Etikett platta lock med prov identifikationsnummer, bra villkor och datum.
- Tvätta plattan 6 gånger med 150 mikroliter sterilt 1x PBS med dump och blot-metoden. Var noga med att inte stänka plattan medan dumpning. Detta kan medföra att brunnar i plattan för att slå lila.
- Tillsätt 100 mikroliter av R20 till varje brunn.
- Inkubera plattan vid 37 ° C i 1 timme.
- Medan plattan ruvar, räkna de celler som vilade över natten.
- Snurra cellsuspension vid 1500 rpm i 5 minuter. Dekantera supernatanten och suspendera pelleten så att du har en slutlig koncentration av 1x10 6 celler per 1 mL i R10 medier.
- Efter 1 timme inkubation, avlägsna R20 med dump och blot-metoden. Var noga med att inte stänka plattan medan dumpning.
- Tillsätt 100 mikroliter av cell-lösning (10 5 celler) i varje brunn. Lägg till lämpliga peptider och / eller antigener till motsvarande brunnar i två exemplar. Använd en ny pipettspets varje gång du går in i peptiden brukslösning. Normal peptid koncentration är 10-40 mikrogram / ml. Sedan peptider varierar, bör varje utredare titrera peptider för att få optimalt resultat.
- I den negativa kontrollen brunnar, bara lägga till celler (ingen peptider)
- I den positiva kontrollbrunnarna, lägg phytohemagglutinin (PHA, 10 mikrogram / ml, Sigma).
- Inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO 2 (~ 18 timmar).
Dag 3: Utveckling av Plate
- Tvätta plattan 6 gånger med 150 mikroliter 1xPBS med dump och blot-metoden.
- Tillsätt 100 mikroliter PBS i varje brunn i plattan med flerkanalspipett.
- Sätt plåten i kylen i 15 minuter.
- Ta plåten ur kylskåpet och placera den i vävnadsodling huven.
- Förbered biotin antikroppen lösningen
- Lägg till 0,5 mikrogram / ml biotin antikroppar (MAB 7-B6-1) till 11ml PBS.
- Vortex lösningen att blanda väl.
- Om du planerar att lägga om lösningen med en flerkanalig, häll det i en reservoar.
- Kassera PBS genom att ställa den i papperskorgen. Var noga med att inte stänka plattan medan dumpning.
- Häll 100 mikroliter av lösningen i varje brunn.
- Inkubera plattan i vävnadsodling huven i rumstemperatur i en timme.
- Tvätta plattan 6 gånger med 150μL 1xPBS med dump och blot-metoden. Den 6: e tvätt, lämna PBS på plattan tills du har förberett Streptavidin antikropp.
- Förbered Streptavidin antikropp.
- Lägg till 5,5 μ l Streptavidin antikropp (Streptavidin-ALP) till 11ml PBS (1:2000 utspädning).
- Vortex lösningen att blanda väl.
- Om du planerar att lägga om lösningen med en flerkanalig, häll det i en reservoar.
- Kassera PBS kvar i brunnarna och blot plattan.
- Tillsätt 100 mikroliter av Streptavidin lösning till varje brunn.
- Inkubera plattan i vävnadsodling huven i rumstemperatur i 1 timme.
- Tvätta plattorna 6 gånger med PBS genom att använda soptipp och blot-metoden. Den 6: e tvätt, lämna PBS på plattan tills du har gjort färgen lösningen.
- Arbetet i mörkret. Bered den alkaliska fosfatassubstratlösningen (Alkaliskt fosfatas-substrat Kit IV BCIP / NBT):
- Tillsätt 4 droppar av substrat reagens 1 till 11 ml Tris-buffert, virvel väl. Tillsätt 4 droppar av substrat reagens 2 till Trisbuffert, virvel väl. Tillsätt 4 droppar av substrat reagens 3 till Tris-buffert, virvel väl.
- Kassera resterande PBS och torka plattan.
- Tillsätt 100 mikroliter av färgen lösning till varje brunn i plattan genom att använda flera kanaler.
- Sätt på ljuset efter 5 till 10 minuter av färg utvecklas.
- Låt färgen reagens kvar på plattan tills fläckarna börjar vända lila och är ganska mörkt. Detta bör ta allt från 5 till 20 minuter. Var noga med att inte lämna substratlösningen för länge eftersom detta kan orsaka hög bakgrund.
- Tvätta ELISPOT plattan 3 gånger med kranvatten.
- Låt torka i ungefär en timme eller över natten.
- Läs plattan antingen manuellt eller med ELISPOT plattläsaren.
- Förvara plattan i en låda från ljus exponering.
Representativa resultat:
ELISPOT är konstruerad för att kvantifiera immunsvar mot mikrobiella antigener. Varje plats indikerar en lyhörd cell, uttrycker cytokin av intresse. Fläckarna kan räknas manuellt eller med hjälp av en ELISPOT plattläsaren.
Bedömning att ELISPOT har utförts korrekt bör inledas med utredningen av den negativa kontrollen för bakgrund produktion av cytokin av intresse. I den negativa kontrollbrunnarna man kan förvänta sig att se några fläckar, även om en liten bakgrund (lila färg) kan förekomma. Normalt bör det vara mindre än i genomsnitt fem prickar per brunn. Den positiva kontrollbrunnarna bekräftar att reaktionen har utförts korrekt, och att cellerna är lyhörda för antigen stimulering. I den positiva kontrollbrunnarna du förväntar dig att se en djup lila bakgrund på grund av ett sammanflöde av fläckar (Fig 1). Det bör vara liten eller ingen vit bakgrund. Om den positiva kontrollen och negativa kontrollprover är lämpliga, kan man räkna sedan brunnarna innehållande antigen av intresse. En "suboptimal" result skulle återspeglas genom höga bakgrunden (brunnarna är lila), inga fläckar eller mycket få fläckar, tom centrum, dåligt definierade fläckar eller konfluenta fläckar. En lista över felsökningstips finns (tabell 1).
Figur 1. En representant för ELISPOT plattan. Varje platta bör innehålla en positiv kontroll, negativ kontroll och peptid av intresse genomförs på minst två brunnar. C9, C10, D9 och D10 är den positiva kontrollen brunnar, som ni kan se finns det en djup lila färg, konfluenta celler och knappt någon vit bakgrund. Den negativa kontrollen brunnarna är G11, G12, H11 och H12. Dessa brunnar har inga lila bakgrund och inga fläckar som förväntat. Fläckarna G7, G8, H7 och H8, illustrerar cellulära svaren på mikrobiella peptider, den lila fläckar utgör en enda lyhörd cell som manifesterar den cytokin av intresse.
Tabell 1
| Observation | Möjliga problem | Möjlig lösning |
| Hög bakgrund | 1. Båda sidor av membranet tvättas inte ordentligt 2. Alltför många celler utsöndrar cytokiner 3. Tavla torkat ordentligt 4. Under utvecklat tallrik | 1. Tvätta båda sidor av membranet med destillerat vatten före och efter färg utveckling. Reagenser kan läcka genom membranet in i botten av tallriken, och dessa kan orsaka högt bakgrunden om inte tvättas bort. 2. Minska antalet celler per brunn, kommer detta att kräva optimering 3. Torka plattan längre innan läsning 4. Minska utveckla tid |
| Inga fläckar / Mycket få fläckar | 1. Inte tillräckligt med celler utsöndrar cytokin / protein av intresse 2. Se till att cellerna stimuleras på rätt sätt 3. Cellerna inte inkuberas lOng nog eller kan ta tid att svara på stimulerande 4. Otillräcklig färgutveckling 5. Inte tillräckligt med primär eller sekundär antikropp | 1. Öka antalet celler. Detta kräver optimering 2. Använd också en positiv stimulans kontroll - ett njutningsmedel som du vet kommer att framkalla uttryck för din cytokin / protein av intresse 3. Öka tiden cellen inkubation eller använda indirekta metoden (förbehandla celler med stimulerande) 4. Övervaka färgutvecklingen med en overhead mikroskop och se till att utveckla reagens har lagrats på rätt sätt och har inte förlorat aktivitet 5. Koncentration av det primära och / eller sekundär antikropp kommer att behöva ökas. Detta kräver optimering. |
| Tomma områden | 1. Membranet inte förbehandlats 2. Membranet har torkat ut i något skede 3. Celler ojämnt fördelade | 1. Se till att membranet är tillräckligt förbehandlats med 70% etanol (alla membran behöver inte detta så kontrollera med din leverantör). Tvätta väl med PBS 3X efteråt 2. Se till att membranet inte torkar 3. Se till att du blandar de celler försiktigt för att ha en bra homolog cellsuspensionen innan pipettering ut i brunnar |
| Blank Center | 1. Skador från tvätt | 1. Flöde på automatiserade bricka (eller pipettering) kan vara för hög. Behöver du en mer skonsam tvättförfarande |
| Falska positiva | 1. Sekundär antikropp aggregat 2. Celler fortfarande på membranet 3. Cellodling kontamination | 1. Filtrera sekundär antikropp 2. Se till att alla celler tvättas från membranet med PBS Tween 20 innan sekundär antikropp inkubation. Celler kvar på membranet ger oregelbundna fläckar 3. Förvara reagenser som sterila och rena som möjligt. Se till att din cellkultur teknik är aseptiska. Kontrollera om falska positiva genom att köra en media negativ kontroll. För plåt rörelse, se dåligt definierade fläckar |
| Sammanflytande fläckar | 1. Dålig beläggning, för mycket antikroppar 2. Långvarig cellodling 3. Celler över-stimulerade | 1. Minska primära antikroppen koncentration 2. Ju längre cellerna inkuberas, desto mer cytokin / protein de utsöndrar. Detta kommer att resultera i större fläckar som kommer att börja gå samman och bli omöjliga att särskilja. 3. Minska cellodling tidssteg inkubation. Över-stimulering kommer att resultera i en massa cytokin / protein som utsöndras av cellen. Detta kommer att ge fläckar som kommer att börja gå samman och bli omöjliga att särskilja. Minska mängden stimulerande i kultur media eller kultur för en kortare tid |
| Dåligt definierade Spots | 1. Membranet inte förbehandlats (om membran kräver detta, kolla med leverantören) 2. Tavla rörelser under cellen inkubation | 1. Membranet måste förbehandlas med etanol eller detta kan resultera i suddig, dåligt definierade fläckar. Det blir svårt för läsaren att skilja dessa 2. Låt inte plattan för att flytta under cellen inkubation som celler som har flyttat kommer att skapa mer än en plats. Om möjligt använda en dedikerad inkubator som inte kommer att öppnas under inkubationstiden. Klicka inte på plattan efter att ha lagt celler |
| Positiv kontroll brunnar är låg | 1. Underutveckling - kan vara ett resultat av att använda Streptavidin-ALP och / eller BCIP / NBT-lösningar som inte har kommit till rumstemperatur | 1. Ta reagenser till rumstemperatur innan du lägger till brunnarna |
| Densitet av fläckarna gör det svårt att kvantifiera dem | 1. Alltför många celler tillsätts | 1. Gör spädningar av celler (dvs 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 celler per brunn) för att bestämma det optimala antalet celler som kommer att resultera i bildandet av olika fläckar |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ELISPOT-analysen har utvecklats till en av de viktigaste och mest använda testmetoder för att kontrollera immunförsvaret hos människor och en mängd andra arter. Med ELISPOT-analysen kan immunceller frekvenser mätas på enskild cellnivå utan expansion eller manipulation av cellpopulationer. ELISPOT-analysen har i stor utsträckning att undersöka antigenspecifikt immunsvar hos olika sjukdomar inklusive infektioner, cancer, allergier och autoimmuna sjukdomar. Tillämpningen av denna analys har i stort sett tillämpats på studier där kvantifiering av antigen-specifika celler är kritisk eller jämförelse av immunsvaret mot specifika antigen i olika sjukdomstillstånd, såsom tuberkulos före eller efter antibiotikabehandling 1. Men senare rapporter visat att denna analys kan användas för att upptäcka frekvenser av antigen-specifika T-celler i isolerade celler material som ascitic vätska, cerebrospinalvätska eller lungsköljning. Sung-Han Kim et. al. har visat att genom att använda ELISPOT analys på PBMC från patienter som misstänks buken tuberkulos, det finns en känslighet på 89% för att diagnostisera aktiva buken TB 2. Det har också visat att T-cells baserad ELISPOT-analysen hade en 91% sensitivitet för diagnostik av aktiv tuberkulos hos patienter med misstänkt i centrala nervsystemet engagemang från tuberkulos med hjälp av perifert blod och ryggmärgsvätska mononukleära celler 3. Vårt laboratorium utnyttjar ELISPOT-analysen för att bedöma cellulära erkännande av mykobakteriell antigen ESAT-6 i PBMC av sarkoidos patienter. Denna rapport är viktig eftersom den visar hur ELISPOT-analysen kan användas också som en diagnostisk metod för att definiera en roll för smittämnen i idiopatisk sjukdomar 4,5. En annan fördel med denna analys är det också möjliggör identifiering av tuberkulos hos patienter som genomgått BCG-vaccination. Analysen är inte begränsad av immunhämmande sjukdomar som steroider och HIV-infektion 6. Det har också underlättat kvantifiering och karakterisering av humant immunbristvirus (HIV)-specifika CD8 + T cells svar 7. Svaren kan även påvisas hos friska försökspersoner till mikrobiella antigener, såsom Aspergillus fumigatus 8. ELISPOT har också använts för att identifiera immunodominant epitop från autoantigenet antigener från överlevande Hantavirus hjärt-syndrom 9, samt för att bedöma T-cell-funktionen vid kronisk hiv-infektion 10. På grund av den korta in vitro-kultur, speglar den uppmätta svaret noga in vivo-T-cell frekvens. Den ELISPOT-analysen har den lägsta påvisbara gränsen mellan "standard" T-cell analyser som lymfproliferation analys (LPA) och cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) analys. Denna sammanfattning ger endast en begränsad bild av det stora möjligheter att den relativt enkla, billiga analys. De möjliga tillämpningar av denna analys fortsätta att expandera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Delvis stöd i Vanderbilt CTSA bevilja ett UL1 RR024975 från National Center for Research Resources, National Institutes of Health. Detta arbete har finansierats av NIH R01 HL 83.839, R01 AI 65.744.
Materials
A. Preparation of Media |
|||
 |
|||
B. Preparation of Tris Buffer |
|||
|
|||
C. Materials necessary for ELISPOT analysis: |
|||
 |
References
- Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
- Sung, H. K. E. Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells. Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).
- Kim, S. -H. Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells. Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).
- Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis. Infect Immun. 75, 527-530 (2007).
- Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses. Respir Res. 25, 36-36 (2008).
- Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden. Thorax. 65, 315-320 (2010).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens. PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).
- Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus. PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).
- Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection. Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).
