Summary
CFSE labels covalent langlevende intracellulaire moleculen met de fluorescente kleurstof, carboxyfluoresceïne. Als zodanig, als een CFSE-gelabelde cel zich deelt, zijn nakomelingen hebben de helft van de fluorescentie, die daarmee kan worden gebruikt om de celdeling te beoordelen. Dit artikel beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor het labelen muis lymfocyten met CFSE.
Abstract
Carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) is een effectief en populair middel om lymfocyten divisie 1-3 te controleren. CFSE labels covalent langlevende intracellulaire moleculen met de fluorescente kleurstof, carboxyfluoresceïne. Dus, als een CFSE-gelabelde cel zich deelt, zijn de nakomelingen begiftigd met de helft van het aantal carboxyfluoresceïne-gelabelde moleculen en dus elke celdeling kan worden beoordeeld door het meten van de overeenkomstige daling in cel fluorescentie via flowcytometrie. De capaciteit van CFSE te lymfocytenpopulaties met een hoge fluorescentie-intensiteit van de uitzonderlijk lage variantie, in combinatie met de lage cel toxiciteit label, maken het een ideale kleurstof om de celdeling te meten. Aangezien het een fluoresceïne-gebaseerde kleurstof is ook compatibel met een breed scala van andere fluorochromen waardoor het van toepassing is op multi-color flowcytometrie. Dit artikel beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor het labelen van de muis lymfocyten in het kader van de controle tot 8 celdelingen. Deze gelabelde cellen kunnen worden gebruikt zowel voor in vitro en in vivo studies.
Protocol
1) Reagens Setup
1.1) CFSE voorraad-oplossing
De CFSE kleurstof wordt gekocht als carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol), meestal in 25 mg flacons. Los van de 25 mg in 8,96 ml DMSO voor een definitieve oplossing voorraad van 5 mm (op te slaan als 50-100 pi porties bij -20 ° C gedurende enkele maanden). CFDA, SE zal reageren met waterige oplossing dus het is cruciaal dat een dergelijke blootstelling vermeden te worden tijdens de opslag.
1.2) Lymfocyten
Isoleer lymfocyten uit de milt en of de lymfeklieren van muizen en resuspendeer in 1 ml kweekmedium (bijv. RPMI) met 5% hitte-geïnactiveerd (HI) foetaal kalf serum (FCS), met een cel concentratie van 0,5 x 06 tot 10 oktober x 10 7 / ml.
2) CFSE Labeling
2.1) Routine methode:
- Grondig Resuspendeer cellen in de 1 ml van de middelgrote en plaats zorgvuldig in de bodem van een verse (niet-bevochtigd) 10 ml conische buis.
- Horizontaal Leg de buis (met een niet-bevochtigd buis zal de 1 ml-celsuspensie te voorkomen dat bewegen en voortijdig mengen met de CFDA, SE oplossingen).
- Voeg voorzichtig 110 pi PBS van de niet-bevochtigd gedeelte van de plastic aan de bovenkant van de buis ervoor te zorgen dat geen contact maken met de cel oplossing.
- Resuspendeer 1,1 pi van de 5 mM voorraad van CFDA, SE in de 110 pi PBS.
- Snel dop de tube en omkeren en vortex goed om snel een uniforme mengen van de oplossingen te krijgen. Merk op dat de CFSE kleurstof wordt bij een uiteindelijke concentratie van 5 uM, maar kan de optimale concentratie moeten worden bepaald voor elke bereide charge, en daarna iedere 6 maanden gecontroleerd om te zorgen dat effectief is.
- Incubeer cellen voor 5 min bij kamertemperatuur. Merk op dat bij conversie van CFDA, SE om te CFSE (zie discussie) de kleurstof wordt fluorescerende en dus vatbaar voor bleken door blootstelling aan overmatig licht. Zo is het raadzaam om de buis te beschermen tegen het licht van dit punt, bijvoorbeeld door te bedekken met aluminium folie.
- Was cellen door verdunning in 10 volumes van 20 ° C PBS met 5% FCS HI, sedimenting door centrifugeren bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C en het teruggooien van het supernatant. Herhaal dit nog twee keer wassen.
2.2) Alternatieve methode, die ook geschikt is voor hogere aantal cellen (10 - 30 x 10 7):
- Bereid een 2 x (10 uM) CFDA, SE-oplossing door het toevoegen van 2 pi van de 5 mM voorraad 1 ml PBS en snel toe te voegen aan 1 ml van grondig geresuspendeerd cellen, dan snel de dop op de tube en omkeren en vortex goed te krijgen snelle uniform mengen.
- Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en was net als in de stappen 2.1 (f) en 2.1 (g).
2.3) De cellen kunnen vervolgens worden toegepast op een protocol van belang zijn voor de inductie van de celdeling. Gelabelde cellen kan worden gebruikt in zowel in vitro als in vivo testen.
2.4) Bij de voltooiing van de proliferatie assay worden de cellen geoogst en geanalyseerd door flowcytometrie (zie hieronder voor representatieve voorbeelden).
3) representatieve resultaten
Voor de beoordeling van lymfocyten proliferatie door CFSE verdunning, is het nuttig om de fluorescentie van de onverdeelde cellen (dwz maximale fluorescentie) en niet-gelabelde cellen (dwz minimaal fluorescentie) te leren kennen. Daarom moet je experimenteel ontwerp met deze controles worden gehouden. Hieronder staan voorbeelden van in vitro en in vivo testen met behulp van CFSE aan CD8 + T-celdeling te meten door flowcytometrie.
3.1) In vitro stimulatie
Figuur 1 toont de CFSE profielen van CFSE-gelabelde ovalbumine (OVA)-specifieke T-cel-receptor transgene CD8 + OT-I T-cellen na 3 dagen cultuur met dendritische cellen gepulst met verschillende hoeveelheden OVA. CD8 + T-cellen gezuiverd van de milt en de lymfeklieren van de OT-I muizen werden gelabeld met CFSE en 1 x 10 5 cellen gekweekt met 3,3 x 10 4 DC. DC, waar gepulst met OVA gedurende 1 uur bij 37 ° C en tweemaal gewassen voorafgaand aan de cultuur. Na 3 dagen, waar de cellen geoogst en voorzien van anti-CD8-APC antilichamen en Hoechst 33258 en vervolgens geanalyseerd door flowcytometrie (50.000 gebeurtenissen verzameld). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + cellen worden weergegeven. Als controles, CD8 + T-cellen alleen gekweekt, toont de CFSE intensiteit van de niet-verdeelde cellen, terwijl de niet-gemerkte cellen toont de auto-fluorescentie van de cellen en de grenzen van detecteerbare celdelingen. Merk op dat 4 CFSE pieken te zien in elk van de panelen in dit voorbeeld, wat aangeeft dat de cellen hebben ondergaan tot 3 divisies.
3.2) In vivo stimulatie
Figuur 2 toont de CFSE profielen van CFSE-gelabelde OVA-specifieke T-cel-receptor transgene CD8 + OT-I T-cellen na 3 dagen in vivo in de aanwezigheid van 20 ug OVA. CD8 + T-cellen gezuiverd van de milt en de lymfklieren van CD45.1 congenic OT-I muizen werden gelabeld met CFSE en 5 x 10 6 cellen geïnjecteerd iv in de laterale staartader van C56BL/6J (CD45.2 +) muizen. Na 2 uur muizen werden geïnjecteerd iv met 20 ug van OVA. Na 3 dagen werden de milt van de muizen verzameld, gemaakt in een enkele celsuspensie, voorzien van anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 en anti-CD45.1-PE-Cy7 antilichamen en Hoechst 33258 en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie (1.000.000 gebeurtenissen verzameld). Live (Hoechst 33258 -) B220-cellen worden getoond in de linker paneel en gated CD8 + CD45.1 + cellen getoond in rechter paneel. Als controles, ongestimuleerde CFSE-gelabelde CD8 + T-cellen, toont de CFSE intensiteit van de niet-verdeelde cellen, terwijl de niet-gemerkte cellen toont de auto-fluorescentie van de cellen en de grenzen van detecteerbare celdelingen. Merk op dat het gebruik van het CD45 allotypic verschil is van vitaal belang in het oplossen van de overgedragen CD8 + T-cellen van de gastheer, omdat ze een kleine subset van de totale CD8 + T-cellen (linker paneel). Merk op dat de meeste cellen binnen 7 CFSE pieken in dit voorbeeld (rechter paneel), wat aangeeft dat de cellen hebben ondergaan tot zes divisies.
Figuur 1. Vermogen van CFSE-gelabelde ovalbumine (OVA)-specifieke T-cel-receptor transgene CD8 + OT-I T-cellen om te reageren in vitro op DC gepulst met verschillende concentraties van de OVA, gegevens getoond worden na drie dagen cultuur. Nota niet-verdeelde populatie van CD8 + T cellen in de afwezigheid van antigeen (licht grijs histogram) en auto-fluorescentie van de niet-gemerkte bevolking (donker grijs histogram). De figuur toont CD8 + T-cellen die 1-3 keer zijn verdeeld op basis van CFSE verdunning pieken, met meer T-cellen te delen bij de hogere concentraties antigeen.
Figuur 2. Vermogen van CFSE-gelabelde ovalbumine (OVA)-specifieke T-cel-receptor transgene CD8 + OT-I T-cellen, als adoptief overgebracht naar C57BL / 6 muizen om te reageren op OVA, data getoond 3 dagen na de adoptieve overdracht Linkerpaneel:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 T-cellen in de ontvangende muizen. Rechts panel: CFSE proliferatie profiel. Let op niet-verdeelde populatie van CD8 + T-cellen in de ontvangende muizen niet ontvangen antigeen (licht grijs histogram) en auto-fluorescentie van de niet-gemerkte lymfocyten (donker grijs histogram). De figuur toont CD8 + T-cellen die 1-6 keer zijn verdeeld op basis van CFSE verdunning pieken.
Figuur 3. Een vertegenwoordiging van de verschillende moleculaire gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de etikettering van cellen met carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFDA, SE). Voor details van het proces zie Discussie tekst. Opmerking: De generieke acroniem 'CFSE', niet CFDA, SE, wordt gebruikt om de etikettering reagens en de etikettering procedure in het algemeen te beschrijven. Cijfer op basis Parish 4.
Discussion
Om te beseffen hoe CFSE werkt en waarom een snelle uniforme etikettering is vereist voor het gebruik ervan in verspreiding analyse is het nuttig om te begrijpen van de moleculaire basis van CFSE cel etikettering. Dit kan worden onderverdeeld in twee fasen, 1) Mobiele toegang en 2) Protein etikettering (figuur 3). 1) Cel entry: Het invoeren van de kleurstof in de cel wordt gemedieerd door het Gediacetyleerde vorm van de kleurstof, carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFDA, SE). De acetaten maken de kleurstof zeer membraan permeant waardoor zijn snelle flux doorheen het plasmamembraan. Esterases, aanwezig in de cel, splijten de acetaten van CFDA, SE en zo aanleiding geven tot de CFSE vorm van de kleurstof die veel minder membraan permeant, waardoor het concentreren van de kleurstof in de cel. 2) Eiwitten etikettering: Hoewel beide CFDA, SE en CFSE hebben amino-reactieve succinimidyl zijketens, alleen de CFSE is fluorescerend. De hoge intracellulaire concentratie van CFSE maakt een snelle en hoge intracellulaire labeling van eiwitten. CFSE labeling van cellen moet snel worden uitgevoerd om een homogeen gelabelde populatie van cellen, die essentieel is voor het oplossen van cellen die hebben ondergaan verschillende divisies, zoals aangegeven in de representatieve resultaten (figuur 1 en 2) te verkrijgen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk beschreven in dit artikel werd ondersteund door een National Health en Medical Research Council (NHMRC) van Australië Programma Grant (CRP) en een NHMRC Project Grant (CRP en BJCQ). Ook BJCQ is een NHMRC Peter Doherty Postdoctoraal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
