Ett förfarande för att studera de Footshock-Induced Återinför av kokain söker i laboratorieråttor

Summary

Djurmodeller av återfall, känd som återställande förfaranden, har använts i stor utsträckning för att studera betydelsen av stress i återfall av narkotika söker. Här berättar vi om en metod för att framkalla ett återinförande av kokain söker i laboratorieråttor via akut exponering för mild, intermittent elektrisk footshock.

Abstract

Det mest försåtliga aspekten av narkotikamissbruk är det hög benägenhet för återfall. Djurmodeller av återfall, känd som återställande förfaranden, har använts i stor utsträckning för att studera neurobiologi och fenomenologi för återfall till narkotikamissbruk. Även processuella variationer har uppstått under de senaste decennierna, är de flesta konventionella återinförande förfaranden som bygger på drogen själv-administration (SA) modell. I denna modell är ett djur tränas för att utföra en operant respons för att få droger. Därefter är beteendet släckas genom att undanhålla svar-kontingenten förstärkning. Återinför av läkemedel som söker är då utlöses av en diskret händelse, till exempel en injektion av utbildningen drogen, åter exponering för narkotika-associerad ledtrådar, eller exponering för en stressfaktor ^1.

Återinför rutiner utvecklades ursprungligen för att studera möjligheten av akut icke-kontingent exponering för utbildning drogen att återinsätta läkemedel som söker hos råttor och apor ^{1, 2.} Återinför rutiner har sedan ändrats för att studera betydelsen av miljö-stimuli, bland annat narkotika-associerad ledtrådar och exponering för olika former av stress, i återfall av narkotikamissbruk söker ^{1, 3, 4.}

Under de senaste 15 åren har ett stort fokus till återinförandet litteraturen har på sig rollen av stress inom läkemedelsutveckling återfall. En av de vanligaste formerna av stress för att studera denna relation är akut exponering för mild, intermittent, elektriska footshocks. Förmåga footshock stressen att inducera återanställning av läkemedel som söker ursprungligen visat Shaham och kollegor (1995) hos råttor med en historia av intravenöst heroin SA ^5. Därefter var effekten generaliseras till råttor med historia intravenöst kokain, metamfetamin, och nikotin SA, samt muntlig etanol SA ^{3, 6.}

Även footshock-inducerad återanställning av läkemedel som söker kan uppnås tillförlitligt och robust, det är en effekt som tenderar att vara känsliga för vissa parametriska variabler. Dessa inkluderar arrangemanget av utrotning och återanställning testa sessioner, intensitet och varaktighet footshock stress, och förekomsten av narkotika i samband ledtrådar under utrotning och testning för återanställning. Här presenterar vi ett protokoll för footshock-inducerad återanställning av kokain söker som vi har använt med konsekvent framgång för att studera sambandet mellan stress och kokain söker.

Protocol

1. Djurstallar och acklimatisering procedurer

1. Man Lång Evans råttor som väger 300-325 gram vid ankomst till vivarium, förvaras separat i standard plast burar som innehåller återvunnet papper pellets sängkläder, med lock trådgaller att rymma vattenflaskor och mat.
2. Råttor hålls på en omvänd ljus-mörk schema (lampor på från 19:00 till 07:00), i en temperatur-och luftfuktighet kontrollerad vivarium.
3. Mat och vatten finns ad libitum i hemmet burar under hela försöksperioden.
4. Råttor får acklimatisera till vivarium och boendeförhållanden i en vecka före operationen. Under denna tid råttor lämnas orörda med undantag för regelbunden rengöring, utfodring, och uppföljning av vikt.

2. Intravenös Kateterisering Kirurgi

1. Enligt isofluran gas anestesi och med sedvanlig aseptisk kirurgisk teknik, är råttor förberedd med silastic katetrar i höger halspulsåder. Katetern lämnar in en modifierad kanyl (plast One) på ytan av skallen, och kanylen är monterad på skallen med juvelerare "skruvar och dentala cement. För mer information om kirurgiska ingrepp, se ^{7, 8.}
2. Vid slutet av operationen, är katetrar spolas med ca 0,2 ml av en lösning innehållande 50% heparin (1000 IE) och 50% dextros (25 g/50 ml). En plast blockerare placeras över öppnandet av kanylen för att skydda katetern från yttre skräp, och för att upprätthålla kateter patency.
3. Vid tidpunkten för operation, och igen dagen efter operationen, är råttor som givits 5 mg / kg, SC, av smärtstillande ketoprofen.
4. Råttor är tillåtna minst sju dagar att återhämta sig från operation innan försöket. Under denna tid är råttor ostört i hemmet burar, med undantag för regelbunden rengöring och utfodring och daglig kontroll av vikt och allmänna hälsa. På den sista dagen av återhämtningsperioden, är katetrar spolas med heparin / glukoslösning (avsnitt 2.2) att kontrollera att katetern patency.

3. Behavioral Rutiner

Alla beteendemässiga förfaranden genomförs med hjälp av utrustning som levereras av Med Associates Inc. (Saint Albans, VT). Utrustningen, inrymt i ett särskilt rum, innehåller en uppsättning av standard operant kammare, var och en innesluten i en ljud-dämpning kapsling. Varje operant kammare är utrustad med två infällbara spakar, både förhöjda 6,5 ​​cm över en rostfri stång golvet. En vit stimulans ljus ligger precis ovanför en spak, och svar på den spaken (den så kallade "aktiva" spaken) resultera i samtidig belysning av stimulans ljus och aktivering av en infusionspump (Razel vetenskapliga instrument, St Albans, VT). Pumpen ligger på en hylla strax utanför operant kammaren, men inom ljud-dämpning kapsling. Den andra spaken (den så kallade "inaktiva" spaken) är kvar längre i kammaren inom alla experimentella förfaranden, att svara på denna spaken är utan konsekvenser. Slutligen är varje kammare utrustad för att ge konstant ström, intermittent, ofrånkomligt, elektrisk footshock genom en scrambler till stångens golvet. Alla experimentella förhållanden (t ex presentationer stimulans, infusioner läkemedel, chock leverans), samt registrering av uppgifter och konsolidering, åstadkoms via gränssnitt mellan test kammare och en central dator operativsystem Med Associates programvara (Med-IV).

Försöket genomförs i fem faser: 1) Tillvänjning, 2) Kokain SA, 3) Drogfri tid, 4) Utrotning, och 5) Test för återanställning. I alla faser (utom för den drogfria perioden), är råttor överförs för den dagliga sessioner från huset rummet till operant testkärlen. Djur överförs individuellt, i små plastförpackningar. Mat och vatten är inte tillgängliga i operant kammare.

1. Tillvänjning
   1. Tjugofyra timmar före första kokain SA session (. Se avsnitt 3.2), är råttor får vänja till operant kammare under ett 2-tim session, under den här sessionen den aktiva spaken är indragen.
2. Kokain SA utbildning
   1. Före varje daglig träningspass, är råttor vägas in i huset rummet. Därefter de överförs till operant kamrarna.
   2. Efter att ha blivit placerad i operant kammare, en fjäder och slang montering (som sträcker sig från drogen infusionspumpen) är ansluten till skallen monterade kanyl.
   3. Råttor är tillåtet att själv administrera kokain HCl under dagliga 3-H sessioner, för totalt 8-10 dagar (antingen efter varandra eller med två mellanliggande "lediga dagar" mellan sessioner 5 och 6).
   4. SA sessioner växelvis morgonen (9:00 till 00:00) och eftermiddag (13:00 till 16:00). Tidpunkten för SA sessioner varvas eftersom de förfaranden som i senare faser av försöket (dvs. utrotning och provning) förekommer i både tIME på dagen för alla djur (se avsnitt 3.4 och 3.5), och därför förhindrar detta arrangemang något förbryllande effekter av tid på dygnet på efterföljande narkotikarelaterade söker beteende.
   5. Varje träningspass föregås av en 5-min acklimatisering, under vilken djuren placeras i operant kammare med den aktiva spaken indragen.
   6. I början av träningspasset, är den aktiva spaken längre in i kammaren och den stimulans ljus (ovanför den aktiva spaken) lyser i 30 s. Dessutom är huset ljuset aktiveras vid denna tid, och fortsätter att lysa under hela sessionen. Tillsammans utgör dessa händelser signal tillgången på kokain.
   7. Under sessionen, är svar på den aktiva spaken förstärks av ett 3-S infusion av kokain (0,23 mg/65 mikroliter, iv) på ett fast förhållande-1 schema för förstärkning. Parallellt med aktivering av infusionspump och drug delivery är en 20-S aktivering av stimulans lampan ovanför den aktiva spaken. Denna 20-S ljus presentation motsvarar en "time-out" period under vilken ytterligare aktiva spaken svar registreras men inte förstärkt.
   8. Djur är tillåtna maximalt 50 infusioner per 3-tim session. Vi ställer rutinmässigt detta kriterium i vårt arbete och i vår erfarenhet, har funnit att det kraftigt minskar, om inte eliminerar, tillbud dödsfall till följd av överdosering.
   9. Vid slutet av varje daglig session, är råttornas katetrar spolas med 0,2-0,3 mL heparin-glukoslösning (se avsnitt 2.2) och råttorna kommer tillbaka till sitt hem bur.
3. Drogfri tid
   1. Efter den sista kokain SA session, är råttor lämnas orörd (med undantag för regelbunden rengöring, utfodring, och övervakning av vikt) i sitt hem bur i minst sju dagar.
4. Utrotning av kokain utbildade beteende
   1. Råttor överförs till operant kamrarna mellan 9:00 till 10:00 för utrotning utbildning.
   2. Våren och slangar församling är ansluten till skallen monterade kanyl.
   3. I överensstämmelse med villkoren för SA utbildning är varje dag att dö ut utbildningen föregås av en 5-min acklimatisering, under vilken djuren placeras i operant kammare med den aktiva spaken indragen.
   4. Råttor får sedan fyra 60-min utrotningshotade sessioner, separerade med 30-minuters intervall. Varje 60-min session initieras av samma händelser som inträffar i början av träningen (dvs belysning av huset ljus, förlängning av den aktiva spaken och 30-sek belysning av stimulans lampan ovanför den aktiva spaken). Under hela sessioner, är alla tillstånd som var närvarande under SA utbildning bibehålls (dvs. svar-kontingenten belysning av stimulans ljus för 20 sek och 3-S aktivering av infusionspump), förutom att aktivt spaken svar är inte längre förstärkta med kokain infusioner . Under 30-minuters intervall som separerar varje 60-min utrotningshotade session är den aktiva spaken indragen och huset ljuset är släckt.
   5. I slutet av den sista 60-min session, är råttor återvände till sina hem bur.
   6. Steg 3.4.1. till 3.4.5. upprepas för 3 dagar i följd.
5. Återställande av kokain utbildade beteende genom footshock stressen
   1. Råttor överförs till operant kamrarna mellan 9:00 till 10:00
   2. Efter att ha blivit placerad i operant kammare, är våren och slangar församling ansluten till skallen monterade kanyl.
   3. I överensstämmelse med villkoren för utbildning och utrotning, är en 5-min acklimatisering period som, under vilken råttor placeras i operant kammare med den aktiva spaken indragen.
   4. Råttor får sedan två 60-min utrotningshotade sessioner (se 3.4.4.) Åtskilda av ett 30-min intervall, identiska med dem som ges under utrotning fas.
   5. Om efter den andra 60-min session det totala antalet svar på tidigare aktiva spaken är mindre än 15, är djur som fått ett test för återställande efter ytterligare 30 minuters intervall. I denna 30-min intervall, är footshock eller simulerade footshock (dvs inget footshock) som administreras (se 3.5.6.). Om ett kriterium på 15 eller färre svar på den aktiva spaken inte uppnås efter den andra sessionen, är ytterligare ett utdöende session (s) ges före testning för återanställning.
   6. Tio minuter efter den andra 60-min utrotningshotade session (eller efter ytterligare 60 minuters utrotningshotade session (er) som krävs för att fastställa utrotning kriteriet 15 eller färre svar), är djur som exponerats för 20 min av intermittent elektrisk footshock stress (eller simulerade footshock) i operant kammaren. Footshock ges under en tid då den aktiva spaken dras tillbaka och hus och stimulans lamporna är släckt. Footshock levereras enligt en variabel tidsplan, i ett genomsnittligt intervall på 40 sekunder (1-70 s utbud). Varje stöt levereras vid en intensitet på 0,9 mA, och är 0,5 s varaktighet. Dessa parametrar footshock bygger på omfattande pilotarbetegenomförts i vårt labb för att fastställa tillförlitliga återanställning av kokain söker, med minsta intensitet och varaktighet footshock exponering. Enligt dessa parametrar, djur uppvisar en reflexiv hoppar svar på 0,5 s chock, och ibland avger en kort vocalization. Även djuren observeras under hela chocken perioden, intensitet chock inte tillräckligt stark för att framkalla mer uttalade tecken på ångest.
   7. Omedelbart efter uppsägning av footshock sessionen är den aktiva spaken utökade och råttor får spaken tryck i utdöende förhållanden (det vill säga, är svaren inte förstärkta med kokain, men fortsätta att resultera i belysning av stimulans ljus och aktivering av infusionspump ). Denna tidsperiod definieras som test för återställande och är normalt 1-3 timmar i längd. De flesta svarar inträffar i början av testsession (första 30 min-1 h), och därefter släcker över mer omfattande test perioder. Således är en 1 h prov räcker för att fånga återanställning effekt med längre testperioder ger en mer fullständig utrotning profil effekten.
   8. När en upprepad åtgärder design är anställd, ska varje råtta testade under footshock och bluff footshock förhållanden. Steg 3.5.1. till 3.5.8 upprepas på ytterligare ett prov dag, och den alternativa test för återställande (footshock eller simulerade footshock) administreras.

4. Representativa resultat:

Figur 1. Stiliserade svar profiler för aktivitet på den aktiva och inaktiva spakarna under egen administration utbildning, utrotning, och återanställning testning.

Figur 1 visar stiliserade operant respons profiler, typiska för sådana som erhållits under de olika faserna i den experimentella protokoll som beskrivs häri.

1. Aktiv spak svar

1. Kokain SA utbildning. Figur 1 (vänster) visar en typisk kokain SA utbildning kurva som omfattar både antalet infusioner och totalt antal aktiva spaken pressar. Råttor förvärva allmänhet kokain SA inom 1-3 sessioner och när beteendet är etablerat, hålla en stabil hastighet av drogintag (vanligtvis mindre än 20% mellan sammanträdesperiod variansen) under efterföljande sessioner.
2. Utrotning av kokain-utbildade beteende. Det kan ses i figur 1 (mitten panel) som dag 1 att utrotas, då svaren inte är förstärkta för första gången, är det totala antalet svar på den aktiva spaken initialt högre än vid slutet av utbildningen fasen (motsvarande en så kallad "utrotning burst"), gradvis under de fyra utrotningshotade sessioner svarar minskar. Dag 2 och 3 i utdöende, kan en viss återhämtning att svara (i förhållande till vad som observerats under den senaste sessionen från föregående dag) avläsas, men svaren är i allmänhet färre än i början av den föregående dagen för utrotning och utrotning i allmänhet intäkterna snabbare under de fyra sessioner för den dagen.
3. Återställande av kokain söker. Det kan ses i figur 1 (högra panelen) att 20 minuter av exponering för intermittenta footshock inducerar en ökning av icke-armerad svara på den aktiva spaken, i förhållande till den som observerades i slutet av föregående utrotning sessionen. Footshock inducerar också en ökning av att svara jämfört med vad som observerats under förhållanden där falska footshock administreras. Således kan ett återinförande av kokain söker genom footshock stressen uttryckas antingen som: 1) det ökade antalet icke-förstärkta reaktioner efter exponering för footshock, i förhållande till svar i utdöende sessionen innan footshock eller 2) det ökade antalet icke-förstärkta svar efter footshock förhållande till bluff footshock.

2. Inaktiv spaken svar

Det kan ses i figur 1 (röd linje) som, i alla experimentella faser, det är mycket låga svar nivåer associerade med inaktiva spaken. Det är dock en blygsam ökning svara på denna spak ibland observerats efter exponering för footshock stress. Även i fall där en sådan ökning svarar inträffar tenderar ökningen av aktiva spaken svara på proportionellt mycket större.

Discussion

Under de senaste decennierna har tre varianter av SA återanställning förfarande utvecklats för att studera återanställning av läkemedel som söker i laboratorium råttor och apor. De skillnader som definierar processuella variationer avser i huvudsak huruvida läkemedlet SA, utdöende, och sessioner testning sker inom samma dag eller på olika dagar ^1. Förfarandet vi beskrivit i denna uppsats är vanligtvis kallas den "inom-mellan" session variation, eftersom läkemedlet SA inträffar under dagliga sessioner (dvs i en mellan-session sätt) som är separata från utrotning och sessioner test, men utrotning och testning ske samma dag (dvs i en inom-session sätt) [t.ex. ^{7, 9].} Alternativt, i så kallade "mellan sessioner" förfaranden, alla faser av experimentet sker sekventiellt, så att SA, utrotning och sessioner testning ges på olika dagar (dvs alla faser finns mellan sessioner) [t.ex. ^{8, 10, 11].} Däremot helt "inom sessioner" förfaranden, SA utbildning, utrotning, och sessioner testa sker alla inom samma dag [t.ex. ^12].

Även om det finns publicerade rapporter om footshock-inducerad återanställning av läkemedel som söker med hjälp av olika varianter av återanställning förfarande, har vi funnit denna stressfaktor (åtminstone i djur med en historia av kokain SA) vara mest effektiva när utrotning och testning sker på samma dag (dvs i en "inom-mellan" sessioner sätt). Alternativt har vi haft framgång med att få tillförlitlig footshock-inducerad återanställning av kokain som söker hjälp av en helt "mellan sessioner" förfarande, men endast under förhållanden som djuren hålls i SA kamrarna under hela försöksperioden ^8, eller åtminstone under utrotning och testning ^13. Nackdelen med denna mellan-session tillvägagångssätt, över det som beskrivs i det nuvarande protokollet, är att det begränsar antalet ämnen som kan vara utbildade och testade på en gång och därmed minskar effektiviteten i datainsamlingen. Även enligt villkoren i detta protokoll endast en grupp av djur kan släckas och testas vid en viss tidpunkt, kan en större genomströmning uppnås genom häpnadsväckande med en vecka starttiden för SA utbildning fasen för två grupper av råttor. I detta scenario kan en första grupp av råttor in i drogfria fas som den andra gruppen går in i vecka 2 av SA utbildning, och därefter kan utrotas och testning utföras i den första gruppen medan den andra gruppen är i sin drog utan fas. Detta tillvägagångssätt möjliggör en mer effektiv användning av resurser och påskyndar graden av datainsamling, samtidigt leder till mycket effektiva och tillförlitliga footshock-inducerad återanställning.

Viktigt i vårt förfarande sker utrotning av de tidigare narkotika förstärkt beteende och testning för återinträde i närvaro av narkotika tillhörande ledtrådar. Även om vi aldrig har utförts utrotning utbildning eller tester i frånvaro av drog-relaterade ledtrådar, det är vår uppfattning, baserad på personlig kommunikation, att stressfaktor kan i själva verket vara ineffektiva i att förmå återanställning vid test inträffar i frånvaro av släckas ledtrådar ( åtminstone när det gäller djur med en historia av kokain SA). En systematisk undersökning av denna variabel, och de teoretiska konsekvenser det medför, är en viktig fråga för framtida forskning.

En sista processrättsliga faktor som motiverar kommentar är att effekten av footshock stress på återställande tycks vara mycket känslig för manipulationer av sammanhang. Till exempel är footshock stressen bara effektivt att framkalla ett återinförande av läkemedel som söker om det ges i den miljö där droger SA och utrotning förekommer, det vill säga inte footshock inte återinföra drog söka om exponering för stressfaktorer förekommer i en roman sammanhang, tyder på ett viktigt samspel mellan stressfaktorer och drog miljön i dess effekter på återanställning ^14.

Sammanfattningsvis förfaranden footshock återanställning, som de beskrivs i detta dokument har använts med stor framgång att belysa de grundläggande beteendemässiga och neurobiologiska mekanismer som reglerar förhållandet mellan stress och drog återfall. Ja, dessa förfaranden, när modifierats för att rymma farmakologiska förbehandlingar eller neurokemiska manipulationer riktade mot särskilda neuronala substrat, kan fungera som kraftfulla verktyg för att karakterisera neurobiologi återställande av narkotika söker av stress.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package		Med Associates, Inc.	MED-008-CT-B1
Deep extra tall MDF sound attenuating cubicle	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-018MD
Standard modular test chamber with drug infusion top and waste pan	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-008CT
Stainless steel grid floor	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-005
House light, hooded, 28V	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-215M
Stimulus light 1” white lens	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-221M
Low profile retractable response lever	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-112CM
SmartCtrl 8 Input/16 output package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	DIG-716P2
Single speed syringe pump, 3.33 RPM	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-100
Rat self infusion package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-119B-23-D
Drug Delivery, Arm assembly	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-110-SAI
Square wave aversive stimulator	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	ENV-414S
Patented quick disconnect harness for stainless steel grid floor	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	ENV-005-QD
Shock output cable	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	SG-219G-10
MED-PC IV Software	Software	Med Associates, Inc.	SOF-735