Summary
Stabil isotop profilering av gaskromatografi masspektrometrisk analys av mellanhand metabola flux beskrivs i rundmasken,
Abstract
Stabil isotop profilering har länge tillåtet känsliga utredningar av metabola konsekvenserna av genetiska förändringar och / eller farmakologiska terapier i cell-och däggdjur modeller. Här beskriver vi detaljerade metoder för att utföra en stabil isotop profilering av intermediär metabolism och metabola flux i nematoden, Caenorhabditis elegans. Metoder beskrivs för profilering hela masken fria aminosyror, märkt koldioxid, märkt organiska syror, och märkta aminosyror i djur som exponerats för stabila isotoper antingen från tidiga utvecklingen på media nematod tillväxt agarplattor eller i början som unga vuxna, medan exponerad för olika farmakologiska behandlingar i flytande kultur. Gratis aminosyror kvantifieras med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) helt mask portioner utvinns i 4% perklorsyra. Universellt märkt 13 C-glukos eller 1,6 - 13 C 2-glukos används som den stabila isotop föregångare vars märkt kol spåras genom masspektrometri av koldioxid (både atmosfäriska och upplöstes) samt i metaboliter som indikerar flödet genom glykolys , pyruvat metabolismen och de trikarboxylsyra cykeln. Representativa resultaten är med för att påvisa effekter av isotop exponeringstid, olika bakteriella protokoll clearing, och alternativa mask metoder störningar i vildtyp nematoder, liksom den relativa omfattningen av isotop inbyggnad i mitokondriell komplex III muterade maskar (ISP-1 (qm150) ) jämfört med vildtyp-maskar. Tillämpning av en stabil isotop profilering i levande nematoder ger en ny möjlighet att undersöka på hela realtid djur nivå metabola förändringar som orsakas av enskilda genetiska sjukdomar och / eller farmakologiska terapier.
Protocol
Protokoll A: Stabil isotop profilering av intermediär metabolism under C. elegans utveckling på NGM tallrikar.
* Obs: Stabil isotop anrikning framgångsrikt kan mätas i unga befolkningar vuxna nematod följande isotop exponering (med antingen universellt-märkt 13 C glukos eller 1,6 - 13 C 2-glukos) början antingen i tidig utveckling eller i tidig vuxen ålder. Detta protokoll möjliggör samtidig övervakning av djurens hälsa, utveckling och tillväxt på standard medier rundmasken tillväxt (NGM) plattor, vilket inte är så lätt att uppnå i flytande kultur.
- Förbered 100 mm petriskålar med 10 ml av media rundmasken tillväxt (NGM), per standardiserad teknik. 1
- Sprid NGM plattor med OP50 E. coli 1 och låt torka över natten.
- Tillsätt 500 mikroliter av 200 mm 1,6 - 13 C 2 glukos (för att uppnå en slutlig koncentration på 10 mm på NGM plåt) på samma sätt för plattan. Låt torka över natten.
- Bleach gravid vuxna maskar 1. Tavla återhämtade ägg på NGM plattor utan bakterier eller 1,6 - 13 C 2 glukos. Inkubera vid 20 ° C över natten.
- Nästa dag, överföring kläckts, L1-greps larver på NGM plattor tidigare sprids med 1,6 - 13 C 2-glukos och OP50 E. coli (per steg # 2, ovan). Grow maskar till unga vuxna stadiet (48-72 timmar, beroende på stam), gör svälta ta hand maskar inte.
- Samla synkron, första dagen unga vuxna maskar från tallrikar med 3-4 mL S. Basal.
- Tvätta maskar i 50 ml S. Basal i 50 ml Falcon rör. Låt maskar till pellets av tyngdkraften i 5 minuter. Avlägsna supernatanten till ~ 5 ml. Upprepa tvätta ytterligare två gånger.
- Uppskatta mask nummer genom att räkna tre 100 mikroliter alikvoter 2. Justera masken koncentration till 1000 maskar / mL S. basala.
- Pipettera 1 ml (1000 maskar) i en 1,5 ml plastflaska centrifugrör.
- Tillsätt 69 mikroliter av 60% PCA innehåller intern standard (ε-Aminokapronsyra) till en slutlig koncentration på 4% PCA och 200 mikromol av intern standard.
- Låt maskar lösa genom gravitation x 5 minuter. Avlägsna och spara supernatanten i ett annat rör.
- Grind mask proverna med hjälp av plast homogeniseringsblandare (Kontes Pellet Pestle) och motordrivna borr (Kontes Pellet Pestle Trådlösa Motor) i 15 sekunder. Visuellt bekräfta mask störningar genom ljusmikroskop. Upprepa om det behövs.
- Överför supernatanten från steg # 11 att kombinera med homogenatet från steg # 12.
- Centrifugera provet vid 2250 rpm (1300 xg) i 5 minuter.
- Överför supernatanten till frisk 7 ml provrör. Spara pellets för proteinkoncentration analysen, som beskrivs i steg # 20, nedan.
- pH-prover till 7-8 (friläge) intervall med hjälp av 4N KOH.
- Centrifugera neutraliseras prover i 7 ml provrör vid 2250 rpm (1300 xg) i 5 minuter för att ta bort salter.
- Överför supernatanten till frisk 7 ml provrör.
- Förbered neutraliseras prover för metabolit kvantifiering av:
- Högpresterande vätskekromatografi (HPLC): Separat 50 mikroliter av neutraliserat prov för direkt injektion i HPLC. Gratis aminosyra kvantifiering sker med hjälp av HPLC (Varian) med hjälp av färdiga kolonnen derivatisering med O-phthalaldehyde och lysrör upptäckt, som tidigare beskrivits 3-4.
- Gaskromatografi / masspektrometri (GC / MS): Fortsätt med utvinning av kvarvarande neutraliserade prover med jonbytarharts (Bio-Rad) för GC / MS bestämning av isotopisk anrikning i aminosyror och organiska syror, som beskrivs i protokoll D.
- Tillsätt 1 mL 1N NaOH till resterande protein pellets (från steg # 15) i 7 ml provrör.
- Inkubera NaOH-behandlade protein prov i rumstemperatur vid rotation (Labnet * LabRoller Rotator) över natten tills det är upplöst.
- Använd 75-100 mikroliter av NaOH-behandlade protein för att bestämma protein koncentration av standardmetoder (DC Protein-analys, Bio-Rad).
Protokoll B. Stabil isotop profilering av intermediär metabolism i C. elegans unga vuxna i flytande kultur.
* OBS: farmakologiska effekter på mellanhand metaboliska flödet i vuxen nematoder kan studeras efter isotop exponering början den första dagen av äggläggning antingen på NGM tallrikar (se protokoll A, ovan) eller i flytande kultur. Vi föredrar den senare metoden att maximera kostnadseffektiviteten av stabila isotopen och farmakologiska agent utnyttjande.
- Späd synkron, första dagen äggläggande unga vuxna i S. basala innehåller 0,0005% kolesterol (fås genom att lägga 0,5 ml 1% kolesterol (löst i 95% etanol) till 1L av S. Basal) till 2000 djur per 500 mikroliter.
- Sätt upp ~ 4 mL totala volymen kultur (er) i 25 ml E-kolvar, enligt följande:
BEHANDLING: INGEN "DROG A" S. Basal med kolesterol 3020 mikroliter 3020 UL - "Drug A" volym Stabila isotopen (1,6 - 13 C 2-glukos) 80 mikroliter 80 mikroliter K12 E. coli (OD 660 2,5-3) 400 mikroliter 400 mikroliter Young Adult Worms (2000) 500 mikroliter 500 mikroliter Drug A (önskad koncentration) - Som önskat - Täck flaskor med folie. Skaka flaskor i 24 timmar vid 220 rpm i 20 ° C inkuberas plattform shaker.
- Se till att kolvarna inte är helt täta, eftersom syre är nödvändigt för förmedlande metabola flux och resulterande märkning av endogena nematoder metaboliter.
- Tvätta maskar genom att tillsätta 4 volym mL kultur till 46 ml av S. basala i en 50 ml konisk plastslang. Låt maskar till pellets av tyngdkraften i 5 minuter. Vakuumsug supernatanten ner till ~ 5 ml kvar. Upprepa tvätta genom att fylla röret två gånger till 50 ml med S. basala.
- Koncentrera tvättas maskar till 1000 maskar / ml i en 1,5 ml plastflaska centrifugrör.
- Tillsätt 69 mikroliter av 60% perklorsyra (PCA) och 2 mikroliter av 10 mikroM intern standard (ε-Aminokapronsyra) för att uppnå en slutlig koncentration av 200 mikromol intern standard och 4% PCA.
- Förbered proven enligt steg # 11-22 i protokoll A.
PROTOKOLL C-1. Övervakning isotopisk användning hos vuxna maskar på tallrikar genom att spåra märkt kol i atmosfären och löst koldioxid.
* OBS: I PROTOKOLL A och B metoder detalj för att övervaka isotop införlivande i fria metaboliter inom maskar under 2-3 dagar för utveckling eller en dag i vuxenlivet respektive grov bekräftelse på framgång och kinetik av isotopförhållandet inbyggnad under en kort tid kurs (dvs, minuter till timmar) kan uppnås genom att övervaka märkningen i atmosfärens koldioxid (CO 2) släpps ut från maskar eller i löst koldioxid inom mask extrakt. Live eller dödade bakterier kan ges till maskar när den odlas på tallrikar (protokoll C-1). Bakterier är inte nödvändigt för kortsiktiga isotop exponering av maskar i flytande kultur (protokoll C-2).
- Förbered 100 mm petriskålar med 10 ml NGM agar. Sprid NGM plattor med antingen levande eller UV-dödade OP50 E. coli (vilket framgår i figur 1). Låt plattorna torka över natten.
- Tillsätt 500 mikroliter av 200 mm 1,6-märkt-13 C 2-glukos till OP50 plattor sprida NGM (för slutlig isotop koncentration på 10 mm på NGM plåt). Låt plattorna torka över natten.
- Skaffa synkron, första dagen äggläggande, spridda unga vuxna maskar som odlas på NGM agarplattor bara med OP50 E. coli.
- Överför 1000 unga vuxna maskarna till experimentella plattor NGM agar innehåller stabila isotopen och E. coli (beredd enligt steg # 1-2, ovan).
- Placera experimentella NGM platta (utan lock) i anpassade glas kammare försedd med väl tillsluten 3-vägs kran för att möjliggöra exakt atmosfär provtagning och utbyte. Omedelbart tätning kammare med optiskt transparent glas skiva. Täck skarven där glas-skiva sitter på plattan med hög vakuum fett för att täta. Rekordtid som "Time 0".
- 10 ml av atmosfären från glas kammare med 3-vägs kranen med en 20 ml spruta vid 30, 60, 90 och 120 minuter. Överför varje atmosfäriska prov till ett i förväg förberett 10 ml gummipropp toppad glasrör som innehåller 1 ml 1 mM NaHCO 3 i 0,1 N NaOH som har vakuum förseglade.
- Injicera 10 ml luft tillbaka in varje glas kammare genom 3-vägs kranen med hjälp av en 20 ml spruta. Stäng kranen till kammaren efter provtagning / återinjektera atmosfär och innan återuppta inkubering mellan punkter samlingen tid.
- Injicera 100 ìl av 20% fosforsyra med propp i 10 ml gummiproppen toppad glasrör som innehåller atmosfärisk CO 2 prov.
- Ta 2 ml av atmosfär och injicera det i 12 ml blå-top automatisk provtagare rör förfyllda med helium för atmosfärisk CO 2-mätning.
- Analysera "atmosfärisk CO 2 prover" genom gas-Ratio masspektrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
- Öppna glas kammare efter två timmars isotop inkubationstiden och insamling av alla atmosfäriska prover.
- Tvätta maskar bort av NGM tallrikar med 3 mL S. basala.
- Tvätta maskar i 50 ml S. basala i 50 ml Falcon rör. Upprepa skölj två gånger till.
- Koncentrera maskar till ~ 1000 maskar / ml i 7 ml rundbottnad glasrör (s).
- Vakuum tätning glasrör med gummipropp.
- Tillsätt 100 mikroliter20% fosforsyra genom gummiproppen med spruta för att släppa löst CO 2.
- Ta 2 ml av atmosfär och injicera i 12 ml blå-top automatiska provtagare rör förfyllda med helium för löst CO 2-mätning.
- Analysera "löst CO 2 prover" genom gas-Ratio masspektrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
Alternativa protokollet (C-2): Övervakning isotopisk utnyttjande av vuxna maskar i flytande kultur genom att spåra märkt kol i atmosfären och löst koldioxid.
- Skaffa synkron, första dagen äggläggande, unga vuxna maskar som odlas på NGM agarplattor spridas med OP50 E. coli.
- Tvätta maskar i 50 ml S. basala i 50 ml Falcon rör. Låt maskar till pellets av tyngdkraften i 5 minuter. Avlägsna supernatanten till ~ 5 ml. Upprepa tvättar ytterligare två gånger.
- Överför 1000 unga vuxna maskar i 1 ml S. basala till 10 ml rundbottnad glasrör. Tillsätt 10,1 l 1 M lager av allmänt märkt-13 C-glukos till 1 ml av maskar för att uppnå slutlig koncentration på 10 mm.
- Syresätta rundbottnad glasrör med maskar och isotop genom att byta miljö med flytande 100% syrgas i öppet rör i 2 minuter. Omedelbart stänga röret med gummipropp.
- Skaka experimentella rör i 20 ° C inkuberas plattform shaker vid 220 rpm. Spela in starttid som "Time 0".
- Prov 5 mL av atmosfären från 10 ml rundbottnad glasrör med en 10 ml spruta och 25 gauge nål genom gummimembranet på 30, 60, 90 och 120 minuter.
- Överför varje atmosfäriska prov till ett förberedda, gummipropp toppade 10 rör ml glasflaska som innehåller 1 ml 1 mM NaHCO 3 i 0,1 N NaOH som har vakuum förseglade.
- Injicera 5 ml luft tillbaka till varje experimentell rundbottnad glasrör med maskar och isotop genom gummiproppen med en 10 ml spruta och 25 gauge nål.
- Återuppta inkubation av experimentella 10 ml rundbottnad glasrör med maskar och isotop genom att skaka vid 220 rpm mellan punkter samlingen tid.
- Injicera 100 ìl av 20% fosforsyra med propp i atmosfären innehåller gummiproppen toppade 10 röret ml glasflaska.
- Ta 2 ml av atmosfär och injicera i 12 ml blå-top automatiska provtagare rör förfyllda med helium för atmosfärisk CO 2-mätning.
- Analysera "atmosfärisk CO 2 prover" genom gas-Ratio masspektrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
- Vid slutet av försöksperioden, tvätta maskar i 50 ml S. basala i 50 ml Falcon rör. Låt masken pellets för att bilda av tyngdkraften. Vakuumsug supernatanten ner till ~ 5 ml kvar. Upprepa tvätta två gånger mer i 50 ml S. basala.
- Koncentrera maskar till ~ 1000 maskar / ml i 7 ml rundbottnad glasrör. Lägg gummipropp och vakuum sigill rör. Tillsätt 100 ìl av 20% fosforsyra med hjälp av en 1 ml spruta med en 25 gauge nål genom gummimembranet att släppa löst mask CO 2.
- Ta 2 ml atmosfären och injicera i 12 ml blå-top automatisk provtagare rör förfyllda med helium för löst CO 2-mätning.
- Analysera "löst CO 2 prover" genom gas-Ratio masspektrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
Protokoll D. Behandling neutraliseras prover från protokoll A och B för aminosyror och organiska syror analys med gaskromatografi / masspektrometri.
- Bead Förberedelser:
- Tillsätt 1 N HCl till både Ag 1 och Ag 50 pärlor separat i 1L bägare.
- Rör om varje kolv i 30 minuter med magnetisk omrörare.
- Tvätta pärlor med avjoniserat vatten 10 gånger, tills pH sköljvätska lika pH-värdet i vattnet.
- Kolumn Förberedelser:
- Sätt en bomullstuss kontakten strax ovanför den smalaste delen av pasteurpipett spets.
- Lägg ut pärlor vardera till två kolumner per prov, fyllning vardera ungefär en tredjedel av kolonnen höjd. Använd AG1 pärlor för organisk syra extraktion. Använd AG50 pärlor för aminosyra extraktion.
- Exempel Bearbetning:
- Tillsätt 500 mikroliter av provet med en kolumn med laddade AG1 pärlor. Ingenting läggs till provet (se protokoll A, steg # 19B) innan de ansöker till AG1 kolumnen för att utvinna organiska syror, om provet redan vid neutralt pH.
- Tillsätt 1 ml 0,1 N HCl till de återstående prov innan det till AG50 kolumnen för att extrahera aminosyror.
- Låt prover för att köra helt genom kolumner.
- Tvätta kolonnen med vatten 10 gånger tills sköljvätska neutralt (7-8 pH-område).
- Eluera kolumner för färskt, märkt glas 4 mL prov injektionsflaskor:
- För ekologiska syraextraktion, tillsätt 3 ml av 3 N HCl till AG1 kolumn. Detta möjliggör analys av isotop anrikning av det totala antalet märkta kolatomer bland 3-kol arter (laktat), 4-kol arter (aspartat, succinat, malat)5-kol-arter (glutamat), och 6-kol arter (citrat).
- För Amino syraextraktion: lägg 3 ml av 4 N NH 4 OH att AG50 kolumn. Detta möjliggör analys av isotop anrikning av det totala antalet märkta kolatomer bland 3-kol arter (alanin) och 5-kol-arter (glutamin).
- Placera provet injektionsflaskorna i Reacti-Vap III förångare över natten tills det är torrt.
E. Exempel Derivitization och inställningar Machine för masspektrometri
Tillsätt 50 mikroliter acetonitril och 50 mikroliter av n-metyl-nt-butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) till varje prov flaska. Täck, blanda och inkubera i 30 minuter vid 60 ° C. Injicera 1-2 l per prov i gaskromatografi / masspektrometer (GC / MS).
F. Analys av resultat
- Kvantifiering av aminosyra toppar. Kvantifiering av varje aminosyra av HPLC-analys beräknas med hjälp området varje topp i förhållande till den interna standarden.
- Beräkning isotopisk anrikning. Stabil isotopisk anrikning beräknas i Excel (Microsoft) för varje art enligt följande formel: Atom Procent Överskott, korrigerad (APE) = (R SA-R st) * 100 / [(R SA-R st) 100], där R SA - Kvoten av provet och R St - Kvoten av standarden.
- Bedöma statistiska skillnader mellan prov berikande. Students t-test används för att bedöma betydelsen av relativ aminosyror och isotop skillnader etiketten mellan proven.
Representativa resultat:
Stabil isotop är väl införlivas unga vuxna maskar, vilket framgår av etiketten kol mätt i atmosfärisk CO 2 och löst mask CO 2. I maskar matas antingen levande eller UV-bestrålade dödade OP50 E. coli, var förhållandet 13 CO 2 till 12 CO 2 större i den upplösta masken CO 2 bråkdel jämfört med utsläppt atmosfärisk CO 2 (Figur 1). Utfodring maskar lever eller dödade OP50 E. coli inte signifikant uppmätta 13 CO 2 till 12 CO 2-förhållandet i tvättade mask extrakt (Se protokoll C1).
Långvarig exponering för stabila isotopen från tidigt larver perioden ökade isotopisk anrikning i mellanhand metaboliter. Korrigerad Atomer Procent Överskott av märkta kol bestämmas mellanhand metaboliter av unga vuxna vildtyp maskar var större i alla glutamat arter när maskarna matades universellt-märkt 13 C-glukos och levande bakterier i hela utveckling relativt behandlats på liknande sätt djur som utfodrats märkta bakterier i 48 timmar först efter att nå äggläggande vuxna steg (figur 2).
Effekt av clearing gånger på isotopisk anrikning. Oavsett exponering tidsförloppet var alla djuren odlas på plattor "rensas" av isotopiska etiketten innan du nedströms förberedelse för GC / MS analyser. Jämförelse av clearing protokoll utfördes som visas i figur 2, bland annat foder maskar i 2 timmar på NGM agarplattor sprids med levande färska bakterier utan isotop eller utfodring på NGM agarplattor utan bakterier i 2 timmar, och livnär sig på NGM agarplattor utan bakterier antingen 2 eller 6 timmar. Oavsett isotop exponering var naturligtvis ingen signifikant skillnad i isotopisk anrikning i förmedlande metaboliter från unga vuxna hela masken extrakt iakttas när djuren rensades på plåtar utan bakterier för antingen 2 eller 6 timmar. Däremot var mindre isotopisk anrikning observerades i mellanhand metaboliter när djur har därefter "rensas" av överskott isotop av livnär sig på omärkta bakterier i två timmar. Ökade dock anrikning i tre, fyra och fem arter var uppenbart när maskarna utsattes för isotop från tidigt larver perioden. Därför var den optimala clearing-protokollet bestäms vara clearing maskar efter deras inkubation på NGM plattor sprids med stabila isotopen och bakterier genom efterföljande inkubation under 2 timmar på unspread NGM tallrikar. Att notera var maskar odlas i flytande kultur tvättas fri från isotop etikett och bakterier i tre volymer av S. basala (se protokoll B), GC / MS-analys av tvättar visade inga signifikanta isotopisk anrikning av tredje tvätt.
Worm slipning gav maximal vinst som mellanhand metaboliter. För att optimera procent anrikning i mellanhand metaboliter efter liknande behandling villkor, jämförelse gjordes av masken prover störs av ultraljudsbehandling ensam eller ultraljudsbehandling plus slipning. Figur 3 visar att maskar störde efter isotop exponering genom ultraljudsbehandling plus slipning hade större isotopisk anrikning än prov störs bara av sonication. Dessa data tyder på att fler sub-organismbiologi fraktioner stördes genom slipning än av sonication. Senare undersökningar visade slipning ensam utan sonication var tillräckligt för att uppnå maximal isotopisk anrikning (data visas inte).
Hela mask isotopanalys exponering möjliggör analys av mellanhand metabolismväg flux. Utfodring levande maskar med stabil isotop föregångare antingen under utveckling (protokoll A, Figur 4A) eller början hos vuxna stadium djur (protokoll B, figur 4B) möjliggör känslig analys av isotopisk anrikning bland metaboliter tecken på flödet genom glykolysen (laktat, alanin), pyruvat metabolism (alanin) och trikarboxylsyra cykeln (citrat, malat, succinat, aspartat, glutamat och glutamin). Universellt-märkt 13 C-glukos ger robust märkning av allt kol arter, medan utnyttjande av 1,6 - 13 C 2-glukos tillåter robust märkning endast i en art av varje metabolit. Denna teknik kan lyhört urskilja skillnader från vildtyp mask mellanhand metabola flux bland mitokondriella andningskedjan muterade stammar, såsom komplexa III mitokondriella andningskedjan subenheten mutant ISP-1 (qm150). Figur 5 illustrerar omfattningen av skillnader observerades i absoluta etiketten mellan ISP-1 (qm150) och N2 maskar varje exponerad i 24 timmar till 1,6 - 13 C 2-glukos i flytande kultur med K12 E. coli-bakterier från den första dagen av äggläggande unga vuxna stadium (protokoll B). Ytterligare en stabil isotop studier i en rad av mitokondriell muterade maskar pågår.
Figur 1. Universellt-märkt 13 C-glukos stabila isotopen var väl införlivas unga vuxna maskarna 13 CO 2: 12. CO 2-förhållande (atomer procent överskott (APE), rättat) i vildtyp (N2) maskar efter två timmar utfodring universellt märkt 13 C-glukos och antingen UV-dödats eller lever OP50 bakterier på tallrikar (Protokoll C1). 13 C införlivande i masken metaboliter var stark efter två timmars isotop exponering. Blå och röda staplar anger relativ isotopisk anrikning i gasfas ("atmosfärisk CO 2") och flytande fas ("mask CO 2"), respektive.
Figur 2. Långvarig isotop exponering från tidigt larver perioden och därefter "clearing" maskar på NGM agarplattor utan bakterier ökat isotopisk anrikning i fria glutamat av unga vuxna maskar. Isotopic anrikning i glutamat arter visas för maskar matade på NGM agarplattor med universellt-märkta 13 C-glukos och OP50 bakterier antingen hela utvecklingen från L1 larvstadiet genom 959 cellen unga vuxna stadium ("L1", se protokoll A), eller för fyrtioåtta timmar börjar när maskarna nådde den första dagen av äggläggande unga vuxna stadiet ("ya"). X-axeln visar det totala antalet märkta kolatomer i varje glutamat arter. Y-axeln anger procent anrikning (korrigerat atomer per överskjutande (APE)). Gröna staplar anger maskar rensas efter isotop exponering genom att mata OP50 E. coli utan isotop på NGM plattor i två timmar innan PCA utvinning. Blå och grå staplar indikerar maskar rensas efter isotop exponering på NGM plattor utan bakterier eller isotop för två eller sex timmar, respektive innan PCA utvinning.
Figur 3. Störa maskar genom slipning ger maximal isotopisk anrikning i metaboliter mellanhand mask. Procent av kol anrikning mäts i en citrat arter i vildtyp maskar som behandlats i 24 timmar i flytande kultur med 1,6 - 13 C 2-glukos utan bakterier (protokoll B). Svart och grå staplar anger maskar som stördes av ultraljudsbehandling enbart eller ultraljudsbehandling och slipning, respektive. Isotopisk anrikning efter exponering för 1,6 - 13 C 2-glukos är bäst bedömas metaboliter märkas på ett kol. Däremot är etiketten anrikas i alla arter av varje metabolit när universellt-märkta-13 C-glukos utnyttjas.
Figur 4. Representativa resultat belysa omfattningen av isotopisk anrikning i metaboliter mask mellanhand tecken på flödet genom glykolysen, pyruvat metabolismen och de trikarboxylsyra cykeln. Korrigerad atomer procent överskott (APE) bestämdes hos unga vuxna vildtyp (N2 Bristol) maskar efter 1, 6 till 13 C 2-glukos exponering antingen (A) under utvecklingen från L1 fas på tallrikar (protokoll A), eller (B) börjar den första dagen i äggläggande som unga vuxna i 24 timmar i flytande kultur (protokoll B) . Felstaplar indikerar standardavvikelsen där tillförlitliga isotopdata från tre biologiska replikat var tillgängligt.
Figur 5. Absolut aminosyra kvantifiering av aminosyra metabolit arter i vild-typ och mitokondriella mutant mask stammar. Absolut etiketten i varje art av fyra aminosyror har beräknats genom att multiplicera HPLC bestämd fri aminosyra koncentration (nmol / mg mask protein) genom rättad atomer procent överskott (APE) för varje art. Grå och svarta staplar indikerar vildtyp (N2 Bristol) och mitokondriella komplexet III subenheten muterade stammar (ISP-1 (qm150)), respektive. Staplarna anger genomsnitt av tre biologiska replikera experiment per stam.
Discussion
Tillämpa masspektrometri för att mäta halten av denna isotop i mellanhand metaboliter ger en underbart detaljerad bild av kritiska biokemiska förändringar 5. Här har vi lämnat detaljerade protokoll för att utnyttja denna mycket känsliga och specifika metoder för att bedöma flödet mellanhand metabola i den genetiskt mångsidiga modell djur, C. elegans. Ja, utfodring levande djur med stabila isotopen märkta metaboliska prekursorer (såsom 13 C-glukos) möjliggör nya insikter mellanhand metabolismväg flussmedel vid mätning isotopisk anrikning i efterföljande metaboliter. Vi har utvecklat tillförlitlig metod för att erhålla robusta analys av flödet genom glykolysen, pyruvat metabolismen och de trikarboxylsyra cykeln. Detta kan uppnås både i djur som utfodrats stabila isotopen från tidig larver utvecklingsstadier eller början efter mitotiska vuxen period. Isotopisk anrikning i olika metabolit arter kan studeras i samband med hela masken fria aminosyror profilering av högpresterande vätskekromatografi, som tidigare beskrivits 4, för att bestämma absoluta isotopisk anrikning i olika arter av mask alanin, aspartat, glutamat och glutamin. Faktum är konsekventa mönster av isotopiska anrikning erhålls vid mätning av aminosyror och organiska analyter syra i alikvoter av 1000 till 2.000 unga vuxna synkron maskar. Sådana metoder kan lyhört diskriminera onormala mellanhand flux i kärn genbaserade mitokondrie mutant stammar jämfört med vildtyp-maskar.
Denna teknik har värde för att undersöka flödet förändringar i specifika biokemiska vägar av betydelse för vanliga medfödda metabolism. I synnerhet informerar utnyttjande av glukos märkta med stabila isotopen kol flux genom centrala metaboliska vägar av betydelse för mitokondriell sjukdom. Ja, våra data tyder på tillämpningen av sådana metoder känsligt kan diskriminera onormala mellanhand flux i en nukleär genbaserade mitokondriella komplexet III subenheten mutant stam (ISP-1 (qm150)) jämfört med vildtyp-maskar.
Det är viktigt att inse att eftersom isotop exponeringen är klar över en period på en till flera dagar, kvantifieras isotopisk anrikning representerar en "steady state" berikande värde snarare än kvantifierbara flux över en definierad tidsperiod som kan fastställas i cell-baserade modeller utsätts för isotop under en period på några minuter till timmar. En annan potentiell begränsning av förhöra väg flux under loppet av nematoden utveckling avser olika lång larvutveckling som förekommer i synnerhet muterade stammar. Till exempel är många allvarliga mitokondriella mutationer kända för att orsaka arrestera vid den tredje (L3) larvstadium 6. Därför kan analyser av isotop inbyggnad bara djur som överlever till vuxen ålder inte vara representativ för hela muterade populationen. Dock kan denna metod vara anpassat för att bedöma isotopisk inbyggnad i mellanhand metaboliter vid ett specifikt larvstadiet (som L2) snarare än att vänta på djur för att nå den vuxna scenen. Likaså har djur som kommer in i alternativa larvstadiet kallas Dauer sannolikt förändrats signifikant (troligen lägre) metaboliska flödet i förhållande till djur som går direkt genom de fyra larvstadier. Framtida studier kan också göras för att direkt bedöma isotopisk inbyggnad i Dauer skede djur av olika genetiska bakgrunder. Exponera djur till stabila isotopen för en bestämd tidsperiod (här, 24 till 48 timmar) börjar när djuren nått unga vuxna scenen (som beskrivs i protokoll B) tar bort effekten av variabeln utvecklande perioder. Medan 13 C-glukos bara förhör glykolysen, pyruvat metabolismen och trikarboxylsyra cykel flux skulle andra isotopiska spårämnen eventuellt bedömas för att förhöra biokemiska väg flux genom andra vägar av intresse för nematoder. Till exempel kan 15 N-glycin utnyttjas för att bedöma aminosyra omsättningen i nematoder.
En annan möjlig begränsning med denna metod är graden av känslighet metabolit upptäckt. Vår erfarenhet visar ett minimum av 500 unga vuxna nematoder krävs för att lyckas kvantifiera isotopanalys införlivande av HPLC och GC / MS-metoder här. Användning av instrument med högre känslighet, såsom ultra vätskekromatografi (UPLC), tillåta ytterligare minskning av djur studerade nummer, även om vi räknar det är osannolikt att möjliggöra tillförlitlig kvantifiering av metaboliter och isotopiska införlivande metabolit arter från samma maskar. Vi studerade mask populationer av 1000 djur per försök, som vi fann att tillförlitligt upptäcka liten förekomst metaboliter i varje stam. Dock kan vissa metaboliter, såsom GABA, bara tillförlitligt kvantifieras i mycket större populationer av nematoder, på order av1x10 6 djur 4.
Sammanfattningsvis innehåller stabila isotopen profilering en icke-invasiv och säkra (icke-radioaktiv) metod som länge har använts för att studera medfödda metabolism. Tillämpningen av denna metod på C. elegans ger nya möjligheter att undersöka in vivo, realtid, metabola förändringar som inträffar på hela djuret nivå, vilket kan bli resultatet av enskilda genetiska sjukdomar och / eller farmakologiska exponeringar agent.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats delvis av National Institutes of Health (K08-DK073545 och NICHD-sponsrade Immateriella Utvecklingsstörning Research Center New Investigator Award), The Philadelphia Foundation och University of Pennsylvania McCabe utmärkelse (MJF), liksom Tristan Mullen fonden (MJF och MY). Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. basal | 1 - page 59 | Protocols A and B | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8503 | Protocol B |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocols A and C | |
| K12 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocol B | |
| NGM agar | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | Protocols A, B, and C |
| 13C glucose (universally labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 | Protocol A and C |
| 13C glucose (1,6 labeled) | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-2717 | Protocol B |
| 60% Perchloric acid (PCA) | Fisher Scientific | MK2766500 | Protocols A and B |
| ε-aminocaproic acid (Internal Standard) | Sigma-Aldrich | A-2504 | Protocols A and B |
| MTBSTFA | Regis | 270243 | Protocol E |
| Acetonitrile | Regis | 270010 | Protocol E |
| AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin | Bio-Rad | 140-1441 | Protocols A and B (organic acid extraction) |
| AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin | Bio-Rad | 142-1441 | Protocols A and B (amino acid extraction) |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | Protocol C |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | Protocol C |
| 3N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 1N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol A |
| 0.1 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Protocol D |
| 4N NH4OH | Sigma-Aldrich | 30501 | Protocol D |
| 4N KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Protocols A and B |
| Deionized water | Milli Q Biocel | ZMQA60F01 | Protocol D |
| Helium | Airgas | 24001364 | Protocol C2 |
| SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope | Nikon Instruments | NI MNA41000 | Protocols A, B, and C |
| pH meter | Fisher Scientific | S68167 | Protocols A and B |
| Table top centrifuge - 5804R | Eppendorf | 05-400-93 | Protocols A and B |
| Incubated platform shaker | New Brunswick Scientific | M1324-0004 | Protocol B |
| Mini LabRoller Rotator | Labnet International | H-5500 | Protocols A and B |
| Pestles | Kontes Corp | K749520-0090 | Protocols A and B |
| Drill | Kontes Corp | K749540-0000 | Protocols A and B |
| 1 L glass beaker | Fisher Scientific | 02-539P | |
| 1 L Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-368 | |
| 25 mL Erlenmeyer Flasks | VWR international | 89000-356 | Protocol B |
| 7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6431 | Protocols A, B, and C1,C2 |
| 10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR international | VT6430 | Protocol C2 |
| Blue top tubes | Labco | 438B | |
| 50 ml conical plastic tubes | Falcon BD | 14-959-49A | All protocols |
| 1.5 ml microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Protocols A and B |
| Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) | BD Biosciences | 301025, 301029, 301031 | Protocols C1 and C2 |
| 25 gauge needles | Fisher Scientific | 22-253-131 | Protocols C1 and C2 |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | Protocol D |
| Pasteur pipettes | VWR international | 14673-043 | Protocol D |
| 60mm Petri dishes | VWR international | 25373-085 | Protocol C |
| Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock | Custom Made | Protocol C | |
| Optically transparent glass plate | Custom Made | Protocol C | |
| Reacti-Vap III Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 18826 | Protocol D |
| Cotton | VWR international | 14224-516 | Protocol D |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | Protocol C1 |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-18 | Protocol B |
| Timer | ISC Bioexpress | T-2504-5 | Protocol C |
| Gas-Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Protocol D | |
| GC-MS | Hewlett-Packard | 5980/5971 | Protocol D |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6980N/5973N | Protocol D |
| HPLC | Varian Inc., Agilent | 9010 | Protocol D |
References
- Hope, I. A. C. elegans: A practical approach. , University Press. Oxford. (1999).
- Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
- Jones, B. N., Gilligan, J. P. o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids. Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).
- Falk, M. J. Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans. Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).
- Yudkoff, M. Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes. Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).
- Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span. J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).
