Summary
Надежный метод высокоэффективной
Abstract
В выражении пробирке и электрофизиологические записи рекомбинантных напряжения закрытого ионных каналов в культуре клеток человеческого эмбриона почки (НЕК-293T) является повсеместной стратегии исследований. НЕК-293T клетки должны быть покрыты на стеклянные покровные при достаточно низкой плотности, так что они не находятся в контакте друг с другом, с тем чтобы позволить электрофизиологические записи не смешивая эффекты из-за контакта с соседними клетками. Трансфицированных каналы также должны выразить с высокой эффективностью в плазме мембраны для цельноклеточной патч зажим записи обнаруживаемых токах выше уровня шума. Гетерологическая ионные каналы часто требует длительного периода инкубации при температуре 28 ° C после трансфекции с целью достижения адекватного выражения мембраны, но Есть увеличения потерь клеточной адгезии и покровное мембраны стабильность при этой температуре. Чтобы обойти эту проблему, мы разработали оптимизированные стратегии для трансфекции и пластины НЕК-293T клеток. Этот метод требует, чтобы клетки трансфицированных быть на достаточно высоком слияния, и инкубировали при 28 ° С в течение различных периодов инкубации после трансфекции, чтобы обеспечить адекватное выражение белка ионного канала. Трансфицированных Затем клетки высевали на покровные стекла и инкубировали при 37 ° С в течение нескольких часов, что позволяет жесткой привязанности ячейки покровные и мембранных restabilization. Клетки могут быть записаны вскоре после металлизации, или может быть передано до 28 ° C для дальнейшей инкубации. Мы считаем, что начальная инкубации при температуре 28 ° C, после трансфекции, но до обшивки, имеет ключевое значение для эффективной экспрессии гетерологичных ионные каналы, которые обычно не экспрессируют также на плазматической мембране. Положительно трансфекции, культивируемых клетках определяются совместно выразили EGFP или EGFP выразил от bicistronic вектор (например, pIRES2-EGFP), содержащий рекомбинантный ионного канала кДНК чуть выше по течению от внутренних рибосомы сайт въезд и EGFP кодирующей последовательности. Всего-клеточные патч зажим записи требует специального оборудования, а также разработке полированных электродов записи и Г-образные электроды почву из боросиликатного стекла. Доставка лекарств для изучения фармакологии ионных каналов может быть достигнуто непосредственно micropipetting наркотиков в записи блюдо, или с помощью microperfusion или самотеком системы, которые производят непрерывный потоки наркотиков решение по записал клеток.
Protocol
1. Культуре клеток
- Человека эмбриональных почек 293T клеток (НЕК-293T, Invitrogen) выращивают в приверженцем монослоев в вентилируемые 25 см 2 колбы (тканевая культура лечение; Cellstar; Greiner Bio-One), содержащий 6 мл модифицированных орлы Дульбеко Средняя (DMEM; Sigma Aldrich) с добавлением 10 % об. / эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Sigma Aldrich), 1% пируват натрия и 250 мкг / мл пенициллина / стрептомицина при 37 ° C с 5% CO 2).
Клетки инкубировали в СО 2 инкубаторы (5% CO 2) установлен либо 37 ° C или 28 ° C. Вся работа с клетками происходит в ламинарном боксе. - Клетки, как правило, разделить два раза в неделю, от ~ 90% слияния, в разведении 1:08 по понедельникам, и 1:12 по четвергам. (См. рисунок 1 для изображения НЕК-293T посеянных клеток на разных плотностей)
- Для расщепления, СМИ удаляется из колбы клеток путем аспирации, и клетки отделяются путем применения 1 мл трипсина (Sigma Aldrich) раствор нагревают до 37 ° С до перевернутой колбу. Колбу затем переворачивают и осторожно потряс руками, что решение трипсина движется над прилагается клетки в несколько раз. Трипсин затем быстро удаляются стремление и 250 мкл трипсин micropipetted в колбу которая вновь потрясли двигаться трипсина решение по ячейкам.
- Колбы затем инкубировали в СО 2-инкубаторе установлен в 37 ° С в течение 3-5 минут, а пипетка используется для приостановки клеток в 4 мл теплой дополнен DMEM. Неполное трипсинизации и подвески вызовет скопления клеток и может привести к клеткам расти вверх, а не в предназначенный монослоя. Over-трипсинизации может привести к повреждению клеток.
- Для раскола 1:8, добавить 500 мкл взвешенных клетки добавляются новые колбу 5.5mL из DMEM, ибо 1:12 раскола (см. Рисунок 1), 333μL клеток добавляются новые колбу 5.7mL из DMEM . Колбы осторожно перемешивают затем перевели в 37 ° С инкубатор. Во время 3-4 часа инкубации при 37 ° С после расщепления, клетки осадка и придерживаться колбу. Клетки сначала осмотреться, но будет сглаживаться и расширений (псевдоподии) с прочной привязанности (рис. 1).
Клетки должны расти в приверженцем монослоя в предсказуемым образом. Если рост клеток и появление атипичных или быть непоследовательным, плохая техника или загрязнения (бактерии / микоплазмы) должны быть рассмотрены. Ключ к успешному культуры ткани является последовательность.
2. Трансфекция НЕК-293T с рекомбинантным ионный канал кДНК
- Здесь кДНК из разных каналов иона клонировали в pIRES2-EGFP плазмиды (BD Biosciences Clontech), который позволяет для идентификации положительно трансфекции клеток с помощью расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) флуоресценции. EGFP производится в трансфекции клеток из той же стенограмме, как клонированные вставки кДНК, путем перевода начато на внутренний сайт рибосомы запись только ниже по течению от вставки кДНК и вверх по течению от EGFP кодирующей последовательности (рис. 2). См. рисунок 3 для изображений флуоресцентных НЕК-293T, положительно трансфицированных кальциевых каналов подразделений в pIRES2-EGFP конструкций.
- До трансфекции, полностью сливающийся колбу делится 1:04 в новую колбу и ячейки могут приложить при 37 ° C в CO 2 инкубаторе в течение 3-4 часов (см. рисунок 1).
- После клетки соединены, стандартные фосфата кальция трансфекции стратегии (Cold Spring Harbor протоколы) используется для введения конструкции содержащие ионных каналов и аксессуаров кДНК субъединицы в клетки HEK. Как правило, в общей сложности 12μg ДНК в 600 мкл трансфекции решение ISE использоваться в колбу / трансфекции.
- После трансфекции решение пипеткой по ячейкам каплям, колбу помещают в 37 ° C инкубаторе в течение ночи.
- После трансфекции клетки тщательно промывают три раза теплой СМИ или фосфатным буферным раствором (4-5 мл) с помощью пипетки промывочного раствора в перевернутую колбу, а затем постепенно превращается колбу в вертикальном положении и качалки колбу так, чтобы промывочного раствора перемещается по клеток. Если это не сделано аккуратно клетки могут detatch и немногие останутся после трех этапов стирки. Мытье повторяют еще два раза, то 6 мл среды добавляют в колбу и она инкубировали при 37 ° С в течение 2 часов, затем перевели в 28 ° C инкубатора.
- Успешная трансфекция pIRES2-EGFP конструкций может быть подтверждено 1 до 3 дней после трансфекции с использованием epifluorescence микроскопом. Клетки, которые светятся зеленым при воздействии ультрафиолета положительно-трансфекции и должны выразить гетерологичных ионного канала и EGFP белков.
3. Покрытие трансфицированных HEK293T клеток в подготовке к записи электрофизиологических
п "> Различные ионные каналы выражают с разной эффективности на клеточной мембране клеток HEK, и как таковой, остальная часть этого протокола требует некоторой оптимизации, чтобы максимизировать поверхности канала выражение позволяет для успешного электрофизиологические записи. Экспрессия гетерологичных ионные каналы в клетках HEK, Особенно тех, от не-млекопитающих источников, может представлять некоторые трудности в том числе (1) больших размеров белка требуется длительное время для перевода и локализации в плазматической мембраной (2) отсутствие или различия складывания и целеуказания мотивы на канале белка необходимо в млекопитающих клеточная линия (3) различия в частотах кодонов от вида к виду. Все эти факторы в совокупности могут привести к требованию в течение долгого времени инкубации при температуре 28 ° C, что обеспечивает эффективное экспрессии белка и поверхностной локализации без клеточного деления (что было бы разбавлять из гетерологичных кДНК и белков). К сожалению, инкубация в течение длительного времени при 28 ° С приводит к отрыву клеток и низкой стабильностью мембраны решений электрофизиологические записи сложно. Мы решили изменить обычные стратегии трансфекции (обзор в Томас и смарт-2005) с целью минимизации инкубации при 28 ° C до записи и максимизировать поверхность выражения. Наш метод требует, чтобы клетки быть трансфекции, инкубировали в течение 3-7 дней при температуре 28 ° C, то клетки отделяются от трипсинизации и replated на покровные и инкубировали при 37 ° С, который restabilizes мембран и позволяет сильную привязанность клеток на покровных. Клетки затем может быть записан сразу же, или может быть инкубировали в течение дополнительного времени при 28 ° C. Мы находим replating клеток на покровных на этом позднем этапе В наш метод абсолютно необходим для производства покровных с большим числом каналов выражения, отдельные прилагается клеток.Приведем две альтернативные стратегии, тот, который мы предпочитаем использовать для ионных каналов и ионных комплексов канала, которые не содержат большого внеклеточных доменов, которые могут быть уязвимы для трипсина пищеварения (например, Cav3 напряжения закрытого кальциевых каналов; Senatore и Спаффорд 2010), и один которые мы используем для ионных каналов, которые содержат большое внеклеточных доменов (например, L-типа напряжения закрытого кальциевых каналов и их подразделения аксессуаров;. Senatore и др. 2010).
- Клетки инкубировали при 28 ° С в течение 2-6 дней, чтобы предотвратить деление клеток и создать условия для накопления переведены белка. Это инкубационный период должен быть определен эмпирически для каждого ионного канала, так как поверхность выражение зависит от внутренних факторов, которые диктуют, как каналов зарождающейся мРНК и полипептидных последовательностей взаимодействовать с поступательным машин и секреторный путь, соответственно.
- До покрытия, круглые покровные стекла (Круги № 1 - от 0,13 до 0.17mm толстый; Размер: 12 мм, Fisher Scientific, Канады, Оттава, Онтарио) покрыты поли-L-лизин (Sigma) в качестве инструкций за производителя.
- Медиа удаляется от стремления трансфекции клеток, и 1 мл 37 ° С раствора трипсина (Sigma) является micropipetted в перевернутом колбу (клетка вверх). Колбу затем аккуратно перевернутый в вертикальное положение, чтобы трипсина бегать по клеткам, и колбы затем снова переворачивают и трипсина удалены аспирации. 250 мкл теплого трипсина затем добавляется непосредственно на клетки и колбу инкубировали при 37 ° С в течение 3-5 минут, пока detatch клеток.
- Между тем, поли-L-лизин покрытием покровные помещаются в 6 мм блюда культуры (3-8 за блюдо) и 5 мл теплой питательных сред добавляется к каждому блюду.
- Трипсином клетки ресуспендировали с 4 мл теплой питательных сред с помощью пипетки вверх и вниз, ~ 6 раз, затем 250-500 мкл из ресуспендировали клетки micropipetted в культуру блюд, содержащих покровные. До того клеток, кончика микропипетки используется для надавите на покровные, чтобы гарантировать, что они на дне тарелки.
- Затем клетки инкубировали при 37 ° С в течение 3 часов, чтобы позволить им соблюдать покровные стекла, а затем они переводятся на 28 ° C. В этот момент клетки готовы к электрофизиологические записи, который идеально сделано с отдельным подключением клетки (Рис.3 иллюстрирует трансфицированных клеток до и после покрытия на покровные). Оставив клетки слишком долго при температуре 37 ° С приведет к клеточному делению.
- Подготовка клеток, экспрессирующих каналов / канал комплексы с большим внеклеточных доменов осуществляется таким же образом, как указано выше, за исключением того, покровные инкубируют при 28 ° С в течение дополнительных 2-4 дня до электрофизиологические записи осуществляется. Это позволяет обеспечить повторное накопление каналов / канал сomplexes на клеточной мембране после трипсинизации.
4. Электрофизиологические записи рекомбинантных каналов в НЕК-293T клетки
Несколько всеобъемлющего ресурсы, которые описывают общие понятия, основные электрофизиологические записи (например, Огден и Стэнфилд 1987; Molleman 2003).
4,1 электрофизиологии установки
Типичный электрофизиологии установки (рис. 4) включает в себя усилитель (например, Axopatch 200B или 700B Multiclamp усилителя; Axon Instruments, Юнион-Сити, Калифорния), компьютер оснащен DIGIDATA 1440A аналого-цифровой преобразователь интерфейса в сочетании с pClamp10.1 программное обеспечение (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния), моторизованные, две пипетки манипуляторы (MPC-385-2, Саттер Instrument Company), epifluorescence микроскоп (Axiovert 40 CFL, Zeiss Канада, Торонто, Онтарио) и перфузии системы (рис. 4 и 5 ). Колебания ограничены монтажа оборудования на TMC 63-500 серии виброизоляции таблице (технический Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Бродячие электрических помех ограничивается использованием 40 "высокий тип II клетка Фарадея (TMC), окружающие электрические оборудования, смонтированного на стол виброизоляции. Электронные системы управления (например, компьютера и монитора, усилитель, аналого-цифровой преобразователь, моторизованные манипулятора и Valvelink перфузии система управления) устанавливаются за пределами клетки Фарадея, чтобы свободно стоящих металла электрической стойки (Hammond Manufacturing, Guelph Онтарио). Все электрооборудование основывается на медь распределителя и подключенных к Medical Grade Изоляция Tranformer (1800Вт, Tripp Lite UL60601-1), который обеспечивает линия изоляции, соответствует земле и подавления выбросов напряжения.
4,2 пипетки Patch
Боросиликатное стеклянные капилляры с нити (диаметром 1,5 мм, диаметр 0.86mm, 15см длины; BF150-86-15; Саттер Instrument Company) разрезают пополам и вставляется в Flaming / коричневый микропипетки Puller Модель P-97 (Саттер Instrument Company) . Пипетка-съемник Программа оптимизирована для последовательного создания пипетки с сопротивлениями от 2 до 5MΩ от электрода к земле (после пожара полировки; рис.6) Пипетки индивидуально огонь отполирована до гладкой поверхности кончиком пипетки, которая позволяет уплотнения против клеточных мембран ( Micro Forge MF-830; Narishige, Япония; рис. 6). Микропипетки установлены на headstage со специализированным держателем (1-HL-U; Molecular Devices, Саннивейл Калифорния).
4,3 электродов Земля
Боросиликатного стеклянные трубки используется, чтобы сделать патч пипетки также используется для изготовления электродов. 15 см трубы разрезать на 3 части. С 2 с острым концом щипцов, трубы проходят в пламени горелки Бунзена, пока стекло становится податливым и трубы можно гнуть на "L" или "хоккейной клюшки" форму с 90 ° углом. В то время как стеклянные трубки, еще горячие, один конец сразу же погружается в горячую 3M CsCl и 1,5% агарозном решение, которое втягивается в трубку под действием капиллярных сил. Как только электрод полностью заполнены раствором, его помещают в стакан с холодной водой. После того как все электроды заполнены, они индивидуально протирать Kimwipes для удаления лишних агарозном извне и погружены в раствор 3M CsCl. Для электрофизиологические записи, электродов сравнения проводятся в Микроэлектродные Держатель Half-Cells (держатель 90 F гранул 1,5 мм; # MEH3RF15, Всемирный точных приборов Inc, Сарасота Флорида), заполненной решение 3M CsCl. (См. Рисунок 7 для иллюстрации боковом электроде в ванне раствор)
4,4 решениями электрофизиологии записи
Различные виды напряжения закрытого ионных каналов требуют разных решений записи в зависимости от ионной проницаемости / селективность. Для напряжения закрытого кальциевых каналов, клетки, как правило, купаются во внешних растворы, содержащие либо бария или кальция в различных концентрациях. Например, электрофизиологические записи беспозвоночных Cav3 напряжения закрытого кальциевых каналов (LCav3) могут быть выполнены с использованием внешнего раствора, содержащего 5 мМ CaCl 2, 166mM тетраэтиламмония (TEA-Cl), 10 мМ HEPES с рН до 7,4 с TEA-OH. Патч пипетки наполнены внутренним решением 125мм CsCl, 10мм EGTA, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 4 мм MgATP, 0.3мм Трис-ГТФ, и 10 мМ HEPES с рН 7,2 (Senatore и Спаффорд, 2010). Беспозвоночных L-типа напряжения закрытого кальциевых каналов (LCav1) могут быть записаны с помощью внешних раствор, содержащий барий, как носителей заряда (15 мм BaCl2, 1мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, 40 ЧАЙ-Cl, 72.5mM CsCl, 10 мМ глюкозы, с рН до 7,2 с TEA-OH) и внутренний раствор, содержащий 108 Cs-метансульфонат, 4мм MgCl 2, 9 мм EGTA, 9мм HEPES, рН до 7,2 с CsOH (Senatore и др.., 2010).
4,5 Всего Запись сотовый
- Покровное содержащие трансфекции клеток (выражение гетерологичных ионных каналов или ионных комплексов канал) передается 35 пластиковых чашки Петри, содержащей ~ 3 мл внешних решение для записи. Объем записи решение должно быть измерен точно при выполнении наркотиков эксперименты, в которых известные количества наркотиков, которые будут добавлены к блюду с микропипетки. Электрофизиологические записи, как правило, делается при комнатной температуре, хотя исследователь, возможно, пожелают изменить эту температуру в зависимости от эксперимента.
- Клетки визуализироваться через epifluorescence микроскопа и изолированные, положительно трансфецированных, приверженец зеленого ячейка с центром в середине поля зрения.
- Патч пипетки опускают в ванну решения с использованием микроманипулятора, что завершает цепь между электродом в патч пипетки и электрода сравнения. Если в ванной режиме pClamp10.1 программное обеспечение причины усилителем для создания небольших повторяющихся ступеней напряжения между пипеткой и электрода сравнения и отображает результирующий ток в виде квадрата следа волны (рис. 8А). Эта площадь следа волны должны быть обнулены использованием пипетки смещение на усилителе до исправления клетки. Сопротивления пипетки измеряется pClamp10.1 программного обеспечения, и должно быть в пределах 2-5MΩ.
- Если в ванной режиме, пипетки вводят в непосредственной близости от клетки, которые могут быть представлены в виде резких колебаний на площади следа волны, то небольшое количество всасывания применяется для исправления пипетки для формирования gigaohm уплотнение между пипеткой и мембраны (вызывает полное плоской линией квадратных следа волны; рис 8B).
- Программа затем перешел на патч режиме, и пипетку емкостью (видны как крошечные всплески тока на передний и задний края плоской текущей следа; рис 8B) компенсируется с компенсацией емкостного пипетки на усилителе.
- Небольшой, но резкий количество всасывания применяется к разрыву мембраны в патч и позволяет доступ электрода внутрь клетки. Успешное разрыв мембраны обозначается появлением больших емкостных переходных и на переднем и заднем фронтах текущей следа волны (рис. 8в). После прорыва было достигнуто, программа переключается в режим камеры и целый компенсации мощности клетка настроена на усилитель, чтобы удалить емкостных переходных процессов. Существует задержка в несколько минут, чтобы дать для уравновешивания внутриклеточных решение для записи в ячейку до записи.
- Напряжение команды генерируются и данные получены с помощью компьютера, оснащенного DIGIDATA 1440A аналого-цифровой преобразователь интерфейса в сочетании с pClamp10.1 программного обеспечения. Уникальные протоколов зажим напряжения пишутся для каждого эксперимента, и они используются для записи ионного тока канала от трансфекции клеток. Рисунок 9 иллюстрирует кальция токов записан с НЕК-293T ячейки выражения беспозвоночных LCav3 напряжения закрытого кальциевых каналов. Клетка была проведена в напряжении-110mV, а также дополнительных depolarisations между-70mV и +20 мВ были приняты, чтобы выявить внутреннюю токами кальция.
- Записанные токов фильтруются в 10 кГц при помощи низкочастотного фильтра Бесселя и оцифрованные на частоте дискретизации 2 кГц. Только записи с минимальной утечкой (<10%) используются для анализа, и в автономном режиме утечки вычитание осуществляется с помощью Clampfit 10,1 программного обеспечения.
4,6 наркотиками исследования записан клетки
Препараты могут быть непосредственно пипеткой в блюдо не регистрируются. Концентрация препаратов может быть вычислена, если объемы наркотиков добавил и объем ванны решения известны. Дорогие или ограниченного количества наркотиков может также быть добавлены microperfusion из нескольких баррель многообразии полиимида перфузии карандаш с 250 микрон съемный наконечник, используя либо восемь каналов Smartsquirt давление перфузии микро системы (AutoMate Scientific) или система самотеком действовали через тефлоновую клапанов и Valvelink8 контроллеры клапана (AutoMate Научно; см. Рисунок 5 для установки перфузии системы). Расход от microperfusion системы установлена на уровне 0,1 мл в минуту в потоке выхода перфузии карандаш 400 микрон из записанных клетки. Расстояние от кончика перфузии карандаш от кончика электрода записи должны быть согласованы с патч для исправления; На рисунке 10 показана предложил видны на расстоянии 40-кратном увеличении. Адекватная расхода обеспечивают насыщения перфузии записал клетки. Прежде чем препарат эксперимент проводится с использованием microperfusion, клетки уравновешенную microperfusion контрольного раствора ванны в непрерывном потоке. Минимальная прерывания потока избегать во время эксперимента, быстрое переключение из-под контроля ванна, наркотиков или моющего раствора. Всасывающая установлен на краю записи блюдо может быть использовано то переполнении удалить решений, с помощью ручного всасывания с помощью шприца или с помощью перистальтического насоса устройство (например, MINISTAR Миниатюрные DC Перистальтический насос, инструменты Всемирного Precision). Необходимо соблюдать осторожность так как чрезвычайно быстрый перфузии вызывает поперечные силы, которые могут изменить кальция ток (Пэн и соавт. 2005), может смыть ячейки записывается, и истощает наркотиками резервуар слишком быстро.
Непосредственно pipeting в блюдо против перфузии системы
| Прямая пипетирования | Микро системы перфузии | Самотеком перфузии системы | |
| Том наркотиков необходимо | Умеренный | Низкий | Высокий |
| Техническое мастерство | Низкий | Среда | Среда |
| Стоимость оборудования | Низкий | Значительный | Значительный |
| Ежедневное время для настройки и очистки | Ни один | 20 + минут | 20 + минут |
| Загрязнение оборудования | Ни один | Да | Да |
| Поиск неисправностей | Легко | Комплекс | Комплекс |
| Гарантированная препарата в блюдо | Да | Нет | Нет |
| Потерять ячейки с наркоманией | Да | Да | Да |
| Значительное снижение потребления наркотиков конц. промывкой | Трудный | Простой | Простой |
| Простота ведения нескольких кривой ответа дозы | Менее оптимальные | Простой | Простой |
| Воспроизводимость результатов | ОК - в зависимости от расположения pippeting | Хорошо | Хорошо |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возможность записи цельноклеточная токов использованием описанных протоколов и решений показывает, что трансфекция прошла успешно и желаемое напряжения закрытого ионных каналов или комплексы ионного канала присутствуют в значительных количествах в клеточной мембране. Если клетки положительно трансфекции (т.е. флуоресцентный зеленый), но не имеют записываемых токи, дополнительное время на 28 ° C могут потребоваться для обеспечения канала белка должны быть соответствующим образом упакованы и вставляется в клеточной мембране. Обратите внимание, что длительной инкубации при 28 ° C заставляет клетки отделяются от покровных и мембран дестабилизировать и накапливать мусор из мертвых клеток, делая записи патч зажим более сложным. Все раз предложил в этом протоколе были оптимизированы для нашего конкретного канала. Другие каналы и их подразделений может потребоваться больше или меньше время инкубации, и наш протокол может быть уточнена по мере необходимости. Для некоторых каналов низкой эффективности трансфекции (то есть меньше флуоресцентные клетки и нижних интенсивности флуоресценции на ячейку) дает лучшие результаты, чем эффективность трансфекции, высоко флуоресцентных клеток. Должны быть клетки флуоресцентной но не иметь записываемых токов, устранение неполадок пунктов, чтобы рассмотреть, включают: отсутствие аксессуаров белка (ов); неправильное смешение реагентов трансфекции; неоптимальных решений записи; и мутации / рекомбинации канал или канал субъединицы кДНК конструкций производит неправильно сложенном или не выразив каналов.
Рисунок 1: Человеческие эмбриональные клетки почек 293T (НЕК-293T) выращивают в приверженцем монослоев при 37 ° С в СО2 инкубаторы (5% CO2) в вентилируемых 25cm2 колбы до 90% слияния и раскола в 1:12, 1:8 и 1:4 разведений. Клетки, как правило, разделить два раза в неделю, от ~ 90% слияния. Чтобы обеспечить подобный ~ 90% слияния на раскол, клетки делятся в разведении 1:08 по понедельникам, и 1:12 по четвергам. До трансфекции, полностью сливающийся колбу делится 1:04 в новую колбу и ячейки могут приложить при 37 ° С в СО2-инкубатора в течение 3-4 часов.
Рисунок 2: Стратегии для экспрессии гетерологичных ионных каналов в НЕК-293T (слева) кДНК ионный канал клонировали в сайт множественного клонирования pIRES2-EGFP плазмиды.. (Правый) Трансфекция эти конструкции в HEK клеток приводит к производству мРНК молекул, содержащих ионные каналы кодирующей последовательности (красный) чуть выше по течению от внутреннего сайта вступления рибосомы (IRES, синий) и EGFP кодирующей последовательности (зеленый). Ионные каналы транслируются и курсировали к клеточной мембране с помощью ER и endomembrane системы, а EGFP переводится и сохраняется в цитоплазме.
Рисунок 3:. Трансфекции и экспрессии гетерологичных ионного канала кДНК в НЕК-293T клеток, а покрытие из клеток на покровных для электрофизиологических записи () (верхние панели) НЕК-293T клетки инкубировали при 28 С, через четыре дня после трансфекции LCav3 кальциевых каналов таила в pIRES2-EGFP млекопитающих вектор экспрессии ЦМВ. (Нижняя панель) выше клетки трипсином и высевали на покровные стекла, изолированные для электрофизиологических записи. Дифференциальная интерференционного контраста микроскопии (DIC).
Рисунок 4:. Типичных электрофизиологических установки установки записи Электрофизиологические компоненты установки записи включают усилитель (), персональный компьютер (ПК), DIGIDATA 1440A аналого-цифровой преобразователь интерфейса (C), моторизованные, две пипетки манипуляторы (ТЧ), epifluorescence микроскоп (М), перфузия систем (P), TMC 63-500 серии виброизоляции таблице (VT), 40 высокий тип II клетка Фарадея (FC), а также свободно стоящих 19 металлов, электрических стойку (R).
Рисунок 5: перфузии систем (А) система самотеком управлять с помощью тефлоновой клапанов и Valvelink8 контроллеров.. (B) восемь каналов Smartsquirt давления микро системы перфузии. Multi-Баррель Многообразие Совет либо перфузии система смонтирована на моторном манипулятора.
Рисунок 6:. Polished, патч пипетки показан на 10x (слева) и 40x (справа) увеличение Патч пипетки были получены из боросиликатного стекла капилляров с нитью и пожарной отполирована до гладкой поверхности пипетки. Пипетка-съемник программа была оптимизирована для создания пипетки, который дал чтение 2-5MΩ в нашей электрофизиологии настройки.
2314fig7.jpg "ALT =" рисунок 7 "/>
. Рисунок 7: электрод заземления и патч пипетки в записи блюдо Патч пипетки (справа) и боковой электрод (слева, белая стрелка) в записи решения.
Рисунок 8:. PClamp10.1 скриншоты иллюстрирующий шаги создания патча () площади следа волны наблюдается, когда в ванне режиме. (B) Gigaohm уплотнение в патче моды приводит к уплощение квадратных следа волны с пипеткой емкостью видны как крошечные всплески тока на переднем и заднем краях плоской текущей следа. (C) После прорыва и в то время как в клеточных режиме больших емкостных переходных видел.
Рисунок 9:. Электрофизиологии результаты (слева) Записываемые внутреннего напряжения закрытого токи кальция указывает на успешное трансфекции и экспрессии гетерологичных ионных каналов (например, LCav3). (Правый) Untransfected камерах нет записываемых токов. Клетки подвергались протокол IV, которая определяет, что программное обеспечение провести камере-110mV, а затем шаг до 70mV для 250msec затем обратно вниз до 110mV проведения потенциал. Каждый раз, когда шаг увеличивается на 10 мВ, так что шаги к 70mV,-60mV и т.д., пока последний шаг до +20 мВ. Результаты для беспозвоночных Т-типа (Cav3) напряжения закрытого кальциевых каналов гомолог из L. stagnalis называют LCav3.
Рисунок 10: Расположение электродов и microperfusion карандашом в записи решения () Патч пипетки изготовлен из боросиликатного стекла (справа) и полиимида нескольких баррель многообразии наконечник для наркотиков перфузии (слева).. Боковой электрод (назад) из боросиликатного стакан, наполненный 3M CsCl и 1,5% агарозном решение согнуты, как хоккейная клюшка состоялась в Микроэлектродные Держатель Half-Cells. (B) 40x вид через микроскоп кончик карандаша и перфузии записи микроэлектрода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Discovery Операционная к JDS от естествознания и техники исследовательского совета (NSERC) Канады, NSERC Александр Грэхем Белл Канада Высшее стипендии (докторской) (А. Senatore) и сердца и инсульта фонда, грант -В-Aid Н. А. # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
