Summary
שיטה אמינה היעילה ביותר
Abstract
בביטוי במבחנה אלקטרו הקלטה של מתח מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב האדם תאים בתרבית כליה עובריים (HEK-293T) היא אסטרטגיית המחקר נמצא בכל מקום. HEK-293T התאים חייב להיות מצופה על coverslips זכוכית בצפיפות מספיק נמוך כדי שהם לא נמצאים במגע זה עם זה על מנת לאפשר הקלטה אלקטרו ללא תופעות בלבול כתוצאה ממגע עם תאים סמוכים. ערוצי transfected צריך גם לבטא עם יעילות גבוהה על קרום התא עבור כל הקלטה תאים תיקון מהדק של זרמים לגילוי מעל רמות הרעש. תעלות יונים Heterologous לעיתים קרובות דורשים תקופות דגירה ארוך 28 מעלות צלזיוס לאחר transfection על מנת להשיג ביטוי הולם קרום, אבל יש להגדיל את ההפסדים של הידבקות התא coverslip ויציבות הממברנה בטמפרטורה זו. כדי לעקוף בעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה מותאם transfect צלחת HEK-293T תאים. שיטה זו דורשת כי התאים להיות transfected בבית confluency גבוה יחסית, מודגרות ב 28 ° C לפרקי הדגירה שלאחר transfection כדי לאפשר ביטוי נאות ערוץ יון חלבון. תאים transfected הם מצופה ומשם coverslips זכוכית מודגרות ב 37 ° C למשך מספר שעות, המאפשרת התקשרות תא נוקשה coverslips ו restabilization הממברנה. תאים ניתן להקליט זמן קצר לאחר ציפוי, או ניתן להעביר 28 מעלות צלזיוס במשך הדגירה נוספת. אנו מוצאים כי הדגירה הראשונית ב 28 ° C, לאחר transfection אבל לפני ציפוי, הוא המפתח לביטוי יעיל של תעלות יונים Heterologous שבדרך כלל אינם מבטאים היטב את הממברנה הפלסמטית. Transfected חיובי, תאים בתרבית מזוהים שיתוף הביע eGFP או eGFP הביע מן וקטור bicistronic (למשל pIRES2-EGFP) המכיל את ערוץ יון רקומביננטי cDNA רק נגד הזרם של אתר כניסה פנימי הריבוזום ואת רצף eGFP קידוד. Whole-cell מהדק הקלטה התיקון דורש ציוד מיוחד, בתוספת crafting של אלקטרודות הקלטה מלוטשת בצורת אלקטרודות לקרקע ממשטח הזכוכית בורוסיליקט. משלוח סמים כדי ללמוד את פרמקולוגיה של תעלות יונים יכולה להיות מושגת על ידי ישירות micropipetting סמים לתוך צלחת ההקלטה, או באמצעות microperfusion או זרימת הכבידה מערכות המייצרות זרמים רצוף של פתרון התרופה על תאים מוקלט.
Protocol
1. תא תרבות
- אדם העובר 293T הכליה תאים (HEK-293T, Invitrogen) מגדלים monolayers חסיד של פרקו 2 צלוחיות 25cm (בתרבית רקמה מטופלים; Cellstar; גריינר ביו אחד) המכיל 6mL של השתנה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM: Sigma Aldrich) בתוספת 10 v / v% בסרום שור העובר (FBS: Sigma Aldrich), pyruvate נתרן 1%, ו - 250 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO 2).
תאים מודגרת ב-CO 2 חממות (5% CO 2) מוגדר או 37 ° C או 28 ° C. כל עבודה עם תאים נעשית ברדס זרימה למינרית. - תאים מחולקים בדרך כלל אחת לשבועיים, מ ~ 90% confluency, בדילול 01:08 בימי שני, 01:12 בימי חמישי. (ראה תרשים 1 עבור תמונות של HEK-293T מצופה בתאים בצפיפויות שונות)
- עבור פיצול, מדיה יוסר צלוחיות של תאים על ידי שאיפה, ותאי מנותקים על ידי יישום פתרון של 1mL (Sigma Aldrich) טריפסין מחומם ל 37 ° C עד הבקבוק הפוכה. בקבוק היא הפוכה לאחר מכן והתנדנד בעדינות ביד כך שהפתרון טריפסין נע על פני תאים מצורף מספר פעמים. טריפסין הוא אז הסיר במהירות על ידי שאיפה ו 250 μL של טריפסין הוא micropipetted לתוך הבקבוק וזה התנדנד שוב להעביר את פתרון טריפסין על התאים.
- צלוחיות מודגרת אז CO 2 באינקובטור מוגדר 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות, פיפטה משמשת להשעות את התאים 4mL של DMEM בתוספת חמה. Trypsinization ההשעיה הושלמה ויגרמו גושים של תאים יכול לגרום לתאים לגדול כלפי מעלה ולא monolayer המיועד. Over-trypsinization עלול לגרום נזק לתאים.
- לשבריר 01:08, להוסיף 500μL של תאים תלויה מתווספים בבקבוק חדש המכיל 5.5mL של DMEM; לשבריר 01:12 (ראה תרשים 1), 333μL של תאים מתווספים בבקבוק חדש המכיל 5.7mL של DMEM . צלוחיות הם מעורבבים בעדינות הועבר לאחר מכן 37 ° C חממה. במהלך הדגירה 3-4H ב 37 מעלות צלזיוס לאחר פיצול, התאים יהיו משקעים לדבוק הבקבוק. תאים בתחילה נראה עגול אלא משתטחות בעלי סיומות (pseudopodia) עם קובץ מצורף מוצק (איור 1).
תאים צריכים לגדול monolayer חסיד בצורה צפויה. צמיחת תאים והמראה צריך להיות לא טיפוסית או לא עקבי, טכניקה לקויה או זיהומים (חיידקים / mycoplasma) צריך להיחשב. המפתח בתרבית רקמה מוצלח הוא עקביות.
2. Transfection של HEK-293T עם רקומביננטי cDNAs ערוץ יון
- כאן, cDNAs מן תעלות יונים שונים משובטים לתוך pIRES2-EGFP פלסמיד (BD Biosciences Clontech), המאפשרת זיהוי של תאים transfected חיובי באמצעות פלואורסצנציה משופרת ירוק ניאון חלבון (eGFP). EGFP מיוצר בתאי transfected מתוך תמליל זהה להכניס את משובטים cDNA, דרך התרגום יזמו באתר כניסה פנימי הריבוזום רק במורד להכניס את cDNA לבין הזרם של רצף eGFP קידוד (איור 2). ראה איור 3 עבור תמונות של פלורסנט HEK-293T, transfected חיובית עם ערוץ יחידות משנה סידן pIRES2-EGFP בונה.
- לפני transfection, בקבוק ומחוברות לגמרי מפוצלת 01:04 לתוך בקבוק חדש, התאים מותר לצרף בשעה 37 ° C ב-CO 2 באינקובטור במשך 3-4 שעות (ראה איור 1).
- אחרי תאים מחוברים, סידן תקן פוספט transfection אסטרטגיה (Cold Spring Harbor פרוטוקולים) משמש כדי להציג את בונה המכיל ערוץ יונים למקטע cDNAs אביזר לתוך התאים HEK. בדרך כלל, סך של 12μg של ה-DNA של 600 μL פתרון transfection ISE משמש לכל בקבוק / transfection.
- לאחר פתרון transfection הוא pipetted על תאים ירידה חכמה, הבקבוק מושם לתוך 37 ° C החממה במשך הלילה.
- בעקבות transfection, תאים נשטפים בזהירות שלוש פעמים עם התקשורת חם או פוספט שנאגרו מלוחים (4-5 מ"ל) על ידי pipetting הפתרון לשטוף לתוך בקבוק הפוך, ואז לאט לאט הופך את הבקבוק זקוף נדנדה את הבקבוק כך שהפתרון לשטוף מהלכים על תאים. אם זה לא נעשה בזהירות התאים יכול detatch ומעטים יישאר אחרי שלושה צעדים לשטוף. לשטוף חוזרים פעמיים נוספות, ולאחר מכן 6 מ"ל של התקשורת מתווספים הבקבוק וזה מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, הועבר לאחר מכן 28 ° C חממה.
- Transfection מוצלח של pIRES2-EGFP בונה ניתן לאשר 1-3 ימים לאחר transfection באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. תאים לזרוח ירוק בעת חשיפה לאור UV הן בחיוב-transfected וצריך לבטא את ערוץ יון Heterologous וחלבונים eGFP.
3. ציפוי transfected תאים HEK293T לקראת הקלטה אלקטרו
nt "> יון שונים ערוצי להביע עם יעילות שונים קרום התא של תאים HEK, וככזה, את שארית פרוטוקול זה דורש אופטימיזציה על מנת למקסם את פני ערוץ ביטוי המאפשר הקלטה אלקטרו מוצלח. הביטוי של תעלות יונים בתאי Heterologous HEK, במיוחד של אלה שאינם יונקים מן המקורות, עשויה להציג כמה אתגרים כולל (1) בגדלים גדולים הדורשים חלבון פעמים רב כדי שיתרגמו את הממברנה פלזמה (2) היעדר או השוני של קיפול מיקוד מוטיבים על החלבון ערוץ הכרחי יונקים שורת תאים (3) הבדלי התדרים השימוש קודון ממין למין. כל הגורמים הללו יחד יכול לגרום דרישה על פי דגירה ארוך 28 מעלות צלזיוס, המבטיח ביטוי חלבון יעיל לוקליזציה משטח ללא חלוקת התא (אשר ידלל את cDNAs Heterologous וחלבונים). למרבה הצער, הדגירה לזמן ממושך על 28 מעלות צלזיוס מוביל ניתוק התא יציבות הממברנה עני שהופך הקלטה אלקטרו קשה. החלטנו לשנות אסטרטגיות transfection קונבנציונאלי (הנסקרת ב תומאס Smart 2005) על מנת למזער הדגירה בשעה 28 ° C לפני ההקלטה כדי למקסם את הביטוי על פני השטח. השיטה שלנו דורש כי תאים להיות transfected, מודגרות לתקופה של 3-7 ימים לכל 28 ° C, אז התאים מנותקים ידי trypsinization ו replated על coverslips וטופחו על 37 ° C אשר restabilizes ממברנות ומאפשר התקשרות חזקה של תאים על coverslips. תאים הם מסוגלים אז תירשם מיד, או יכול להיות מודגרות לתקופות נוספות של פעם ב 28 ° C. אנו מוצאים את replating של תאים על coverslips בשלב מאוחר יותר בשיטה שלנו להיות חיוני לייצור coverslips עם מספרים גבוהים להביע ערוצים, תאים מצורף נפרד.אנו מציגים שתי אסטרטגיות חלופיות, אחת שאנו מעדיפים להשתמש עבור תעלות יונים ומתחמים ערוץ יון שאינם מכילים תחומים תאיים גדולים שעלולים להיות פגיעים העיכול טריפסין (למשל Cav3 מתח מגודרת ערוצי סידן; Senatore ו Spafford 2010), ואחד כי אנחנו משתמשים עבור תעלות יונים כי מכילים תחומים תאיים גדולים (למשל, L-סוג מתח מגודרת ערוצי סידן יחידות משנה אביזר שלהם;. Senatore, et al 2010).
- תאים מודגרת על 28 מעלות צלזיוס במשך 2-6 ימים כדי למנוע את חלוקת התאים על מנת לאפשר הצטברות של חלבון המתורגם. הפעם הדגירה צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל ערוץ יון, שכן הביטוי משטח תלוי בגורמים פנימיים המכתיבים איך mRNA המתהווה של ערוצים רצפים פוליפפטיד אינטראקציה עם מכונות translational ואת מסלול הפרשה, בהתאמה.
- לפני ציפוי, coverslips זכוכית עגול (מעגלי מספר 1-0.13 ל 0.17mm עבה; גודל: 12 מ"מ, פישר סיינטיפיק קנדה, אוטווה, אונטריו) הם מצופים פולי-L-ליזין (Sigma) כמו הוראות יצרן לכל.
- התקשורת מוסרת על ידי שאיפה מתאי transfected, ו 1 מ"ל של 37 ° C טריפסין פתרון (Sigma) הוא micropipetted לתוך בקבוק הפוך (בצד התא למעלה). בקבוק אז היא הפוכה בעדינות למצב זקוף כדי לאפשר טריפסין לדרוס את התאים, ואת הבקבוק הוא מחדש הפוכה טריפסין הוסר על ידי שאיפה. 250 μL של טריפסין חם הוא הוסיף אז ישירות על התאים את הבקבוק הוא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות, עד detatch התאים.
- בינתיים, פולי-L-ליזין מצופה coverslips ממוקמות לתוך הכלים תרבות 6mm (3-8 לכל מנה) ו 5 מ"ל של התקשורת בתרבות חם מתווסף כל מנה.
- תאים Trypsinized הם resuspended עם 4mL של התקשורת בתרבות חם ידי pipetting למעלה ולמטה ~ 6 פעמים, ואז 250-500μL של תאים resuspended הם micropipetted לתוך הכלים תרבות המכילה coverslips. לפני תוספת של תאים, קצה micropipette משמש לדחוף כלפי מטה על coverslips כדי להבטיח כי הם בחלק התחתון של המנה.
- התאים מודגרת אז 37 מעלות 3hrs לאפשר להם לדבוק coverslips, ולאחר מכן הם מועברים 28 ° C. בשלב זה, התאים מוכנים להקלטה אלקטרו, אשר נעשית באופן אידיאלי עם תאים נפרדים המצורפת (Fig.3 ממחיש תאים transfected לפני ואחרי ציפוי על coverslips). השארת תאים יותר מדי זמן על 37 מעלות צלזיוס תגרום חלוקת התא.
- הכנת התאים לבטא ערוצים / מתחמי ערוץ עם דומיינים תאיים גדולים מתבצעת באופן דומה, כמצוין לעיל, למעט העובדה coverslips מודגרת ב 28 מעלות צלזיוס למשך 2-4 ימים נוספים לפני ההקלטה אלקטרו מתבצעת. זה מאפשר הצטברות מחודשת של ערוצים / ערוץ גomplexes על קרום התא לאחר trypsinization.
4. הקלטה של ערוצי אלקטרו רקומביננטי ב HEK-293T תאים
משאבים מקיף קיימות מספר המתארים את מושגים כלליים הבסיסית הקלטה אלקטרו (למשל אוגדן וסטנפילד 1987; Molleman 2003).
4.1 Electrophysiology לבוש
טיפוסי electrophysiology לבוש (איור 4) כולל מגבר (למשל Axopatch 200B או 700B Multiclamp מגבר; מכשירים אקסון, יוניון סיטי, קליפורניה), מחשב PC מצויד בממשק 1440A-to-Analog ממיר דיגיטלי Digidata בשיתוף עם pClamp10.1 תוכנה (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, קליפורניה), ממונע, פיפטה המניפולטורים כפול (MPC-385-2, החברה סאטר Instrument), מיקרוסקופ epifluorescence (Axiovert 40 CFL, Zeiss קנדה, טורונטו, אונטריו) ומערכות טפטוף (איורים 4 ו -5 ). תנודות מוגבלים על ידי הרכבה את הציוד על שולחן 63-500 TMC רטט בידוד סדרה (טכני ייצור Corporation, פיבודי. MA). רעש חשמלי תועים מוגבל באמצעות 40 "גבוה Type II פאראדיי קייג' (TMC) סביב ציוד חשמלי רכוב על השולחן בידוד רעידות. מערכות בקרה אלקטרונית (כגון מחשב & לפקח, מגבר,-to-Analog ממיר דיגיטלי, מניפולטור ממונע מערכת בקרת Valvelink זלוף) מורכבים מחוץ לכלוב פאראדיי מתלה שעמד חופשי מתכת חשמל (המונד ייצור, Guelph אונטריו). כל ציוד חשמלי מעוגנת למפיץ נחושת פקוק לתוך בידוד רפואי כיתה Tranformer (1800W, Tripp Lite UL60601-1) אשר מספק בידוד קו, קרקע עקבית דיכוי פרץ.
4.2 תיקון pipettes
צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי עם נימה (OD אורך 1.5mm, 0.86mm OD 15 ס"מ,; BF150-86-15; החברה סאטר Instrument) הם בחצי ונוסף Flaming / בראון micropipette פולר דגם P-97 (חברת סאטר Instrument) . תוכנית פיפטה, חולץ מותאם באופן עקבי לייצר pipettes עם התנגדויות בין 2 ל 5MΩ מן האלקטרודה לאדמה (לאחר ליטוש אש; Fig.6) pipettes הם בנפרד אש מלוטש כדי להחליק את פני השטח קצה פיפטה המאפשר חותמות חזק נגד קרום התא ( מיקרו Forge MF-830; Narishige, יפן; איור 6). Micropipettes הם רכובים על headstage עם בעל מיוחדים (1-HL-U; התקנים מולקולריים, בסאניווייל קליפורניה).
4.3 קרקע אלקטרודות
צינורות זכוכית בורוסיליקט המשמש לייצור טפטפות תיקון משמשים גם כדי להפוך אלקטרודות התייחסות. הצינורות הארוכים הם 15 ס"מ וחותכים 3 חתיכות. עם 2 דק שקצהו מלקחיים, הצינורות מוחזקים להבה מבער בונזן עד כוס הופך נזיל ואת צינורות יכול להיות כפוף ל "L" או "מקל הוקי" הצורה עם זווית 90o. בעוד צינורות זכוכית עדיין חם, קצה אחד הוא שקוע מיד חם 3M CsCl ו -1.5% agarose פתרון אשר נשאבים לתוך הצינור על ידי פעולה נימי. פעם אלקטרודה השוואתית מלא לחלוטין עם פתרון, היא ממוקמת בכוס מים קרים. אחרי כל האלקטרודות התייחסות מלאים, הם מחה בנפרד עם Kimwipes להסיר agarose תוספת מבחוץ שקועות פתרון 3M CsCl. להקלטת אלקטרו, האלקטרודות התייחסות מוחזקים מחזיק microelectrode-Half תאים (מחזיק 90 F גלולה 1.5mm; # MEH3RF15; העולם Precision מכשירים בע"מ, סרסוטה בפלורידה) מלא פתרון CsCl 3M. (ראה איור 7 להמחשה של אלקטרודה בתמיסת הקרקע אמבטיה)
4.4 Electrophysiology פתרונות הקלטה
סוגים שונים של מתח מגודרת תעלות יונים דורשות פתרונות הקלטה שונים בהתאם חדירות סלקטיביות יון /. עבור מתח מגודרת ערוצי סידן, התאים הם רחצו בדרך כלל פתרונות חיצוני המכיל או בריום או סידן בריכוזים שונים. לדוגמה, הקלטה של ערוץ אלקטרו חוליות מתח מגודרת Cav3 סידן (LCav3) ניתן לבצע באמצעות פתרון חיצוני המכיל CaCl 5mm 2, 166mM tetraethylammonium (תה Cl), HEPES 10mm עם pH 7.4 המותאמת עם TEA-OH. Pipettes תיקון מלאים פתרון פנימי של 125mm CsCl, 10mm EGTA, 2mm CaCl 2, 1mm MgCl 2, 4 מ"מ MgATP, 0.3mm טריס-GTP ו HEPES 10mm עם pH של 7.2 (Senatore ו Spafford, 2010). חוליות L-סוג מתח מגודרת תעלות סידן (LCav1) ניתן להקליט באמצעות פתרון חיצוני המכיל בריום כנשא את המטען (15mm BaCl2, 1mm MgCl 2, HEPES 10mm, 40mm תה Cl, 72.5mM CsCl, גלוקוז 10mm, עם ה-pH המותאמת 7.2 עם TEA-OH) ו פתרון פנימית המכילה 108mM Cs-methanesulfonate, 4mm MgCl 2, 9 מ"מ EGTA, HEPES 9mm, pH 7.2 המותאמת עם CsOH (Senatore ואח'. 2010).
4.5 תא שלמים הקלטה
- Coverslip המכיל תאים transfected (להביע תעלות יונים Heterologous או מתחמי ערוץ יון) מועבר צלחת פטרי 35mm פלסטיק המכיל ~ 3mL של פתרון הקלטה חיצוני. היקף פתרון הקלטה יש למדוד במדויק בעת ביצוע ניסויים שבהם כמויות התרופה הידועה של התרופה יש להוסיף צלחת עם micropipette. הקלטות אלקטרו נעשים בדרך כלל בטמפרטורת החדר, אם כי החוקר ייתכן שתרצה לשנות את הטמפרטורה בהתאם הניסוי.
- תאים הם דמיינו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence ו מבודד, באופן חיובי, transfected, התא הירוק חסיד מרוכז באמצע שדה הראייה.
- פיפטה התיקון הוא הוריד את הפתרון אמבטיה באמצעות micromanipulator, אשר משלים את מעגל בין האלקטרודה ב פיפטה את התיקון ואת אלקטרודה השוואתית. במצב אמבטיה, התוכנה pClamp10.1 גורם מגבר ליצור קטן צעדים מתח חוזרת פיפטה בין לבין אלקטרודה השוואתית, ומציג את התוצאה הנוכחית כמו עקבות גל מרובע (איור 8 א). עקבות גל מרובע חייב להיות מאופס בעזרת פיפטה לקזז על המגבר לפני תיקון בתא. ההתנגדות פיפטה נמדדת תוכנה pClamp10.1, ואת צריכה להיות בתוך 2-5MΩ.
- במצב אמבטיה, פיפטה המובא לתוך בסמיכות של התא, אשר ניתן דמיינו כמו תנודות המהירה לאתר את גל מרובע, אז כמות זעירה של יניקה מוחל על פיפטה את התיקון כדי ליצור חותם gigaohm בין פיפטה ו הממברנה (סיבות קו שטוח מלאה של עקבות גל מרובע; 8B איור).
- התוכנית מופעלת אז למצב התיקון, ואת קיבול פיפטה (נראה כמו blips זעיר הנוכחית בשולי מובילים ונגררים של עקבות הנוכחי שטוח; 8B באיור) היא פיצה עם פיצוי הקיבול פיפטה על המגבר.
- כמות קטנה אך חדה של יניקה מוחל על קרע את הממברנה של התיקון ולאפשר גישה של האלקטרודה לחלק הפנימי של התא. קרע בקרום מוצלח הוא הצביע על ידי הופעתו של הארעיים קיבולי גדול גם על מובילים ונגררים הקצוות של לאתר את הגל הנוכחי (איור 8C). לאחר לפרוץ הושג, התוכנית מופעלת למצב התא פיצוי כל קיבולת תא מותאם על המגבר כדי להסיר את הארעיים קיבולי. יש עיכוב של כמה דקות, כדי לאפשר איזון של פתרון ההקלטה תאיים לתוך התא לפני ההקלטה.
- פקודות מתח נוצרות ונתונים נרכש באמצעות מחשב המצויד בממשק 1440A-to-Analog ממיר דיגיטלי Digidata בשילוב עם תוכנת pClamp10.1. ייחודי מהדק פרוטוקולים מתח נכתבים עבור כל ניסוי, ואלה משמשים שיא זרמים ערוץ יון מתאי transfected. איור 9 מציג זרמי סידן נרשמה מתא HEK-293T המבטא את חוליות LCav3 מתח מגודרת תעלות סידן. התא התקיים מתח של 110mV-ו depolarisations מצטבר בין-70mV לבין 20 mV נלקחו לעורר זרמי סידן פנימה.
- זרמים הוקלט מסוננות על 10 קילוהרץ באמצעות בסל נמוך לעבור סינון דיגיטציה בתדר דגימה של kHz 2. הקלטות רק עם דליפה מינימלית (<10%) משמשים לניתוח, לא מקוון דליפה חיסור מתבצעת באמצעות תוכנת Clampfit 10.1.
4.6 והתרופות מחקרים בתאי נרשם
תרופות ניתן pipetted ישירות לתוך צלחת מוקלט. ריכוז של תרופות ניתן לחשב אם נפח של התרופה הוסיף נפח של פתרון אמבטיה ידועים. כמויות יקר או מצומצם של התרופה יכול להיות גם הוסיף ידי microperfusion מ סעפת רב חבית polyimide עיפרון זלוף עם טיפ 250 מיקרון נשלף, או באמצעות ערוץ eight Smartsquirt לחץ מיקרו זלוף מערכת (להפוך מדעי) או זרימת הכבידה המופעל באמצעות מערכת שסתומים טפלון ו Valvelink8 בקרי שסתום (להפוך מדעיים, ראה איור 5 עבור setups המערכת זלוף). שיעורי זרימה ממערכות microperfusion נקבעים על 0.1mL לדקה בזרם היציאה עיפרון זלוף 400 מיקרון מהתא מוקלט. המרחק של קצה העיפרון זלוף מקצה האלקטרודה ההקלטה צריכה להיות עקבית התיקון תיקון; איור 10 ממחיש מרחק הציע הנראה בהגדלה של 40X. ספיקות הולם לספק זלוף להרוות של התא מוקלט. לפני ניסוי התרופה מתבצע באמצעות microperfusion, תאים equilibrated עם microperfusion פתרון אמבטיה לשלוט בזרם מתמשך. הפרעה מזערית של הנחל הוא נמנע במהלך הניסוי על ידי מעבר מהיר של אמבטיה מלאה, תרופה או פתרון לשטוף. יניקה רכוב בקצה צלחת ההקלטה ניתן להשתמש to להסיר את העודפים של פתרונות, באמצעות שאיבה ידני עם מזרק או באמצעות מכשיר המשאבה peristaltic מונע (למשל MINISTAR מיניאטורות DC Pump peristaltic, מכשירים העולם Precision). יש להקפיד מאז זלוף מהירה מאוד מעוררת כוחות גזירה שעשויים לשנות את זרם סידן (פנג et al. 2005), עשוי לשטוף את התא מוקלט, וגם מכלה את מאגר תרופות מהר מדי.
Pipeting ישירות לתוך צלחת מול מערכות זלוף
| ישיר pipetting | זלוף מיקרו מערכת | זרימת הכבידה זלוף מערכת | |
| התרופה נפח הדרושים | מתון | נמוך | גבוה |
| מיומנות טכנית | נמוך | בינוני | בינוני |
| עלות ציוד | נמוך | משמעותי | משמעותי |
| שעה יומית להתקנה ניקוי | אף אחד | 20 + דקות | 20 + דקות |
| זיהום של ציוד | אף אחד | כן | כן |
| פתרון בעיות | קל | מורכב | מורכב |
| התרופה מובטחת בצלחת | כן | לא | לא |
| לאבד תא עם תוספת תרופות | כן | כן | כן |
| לצמצם במידה ניכרת את קונצרט כלשהו בסמים. על ידי שטיפה | קשה | פשוט | פשוט |
| קלות עושה עקומת המינון מרובים תגובה | פחות אופטימלי | פשוט | פשוט |
| שחזור של התוצאות | בסדר - תלוי במיקום של pippeting | טוב | טוב |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היכולת להקליט כל תא זרמים באמצעות פרוטוקולים תיאר ופתרונות מציין כי transfection היה מוצלח וכי הרצוי מתח מגודרת תעלות יונים או ערוץ מתחמי יון נמצאים עם כמויות משמעותיות על קרום התא. התאים צריכה להיות transfected חיובי (כלומר פלואורסצנטי ירוק), אך לא זרמים לצריבה, זמן נוסף על 28 מעלות צלזיוס ייתכן שתידרש כדי לאפשר לחלבון ערוץ להיות ארוז כראוי מוכנס לתוך קרום התא. שים לב דגירה ממושכת בגיל 28 ° C גורם לתאי להתנתק coverslips, ואת הקרומים לערער לצבור פסולת תאים מתים, מה שהופך מהדק הקלטה תיקון יותר מאתגר. כל הזמנים הציע בפרוטוקול זה מוטבו ערוצי מסוים שלנו. ערוצים נוספים יחידות משנה שלהם עשויים לדרוש פעמים הדגירה ארוך או קצר, ופרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם נוספת במידת הצורך. עבור ערוצי מסוימות יעילות transfection עני (כלומר תאים פלורסנט פחות עוצמת הקרינה נמוכה יותר לכל תא) מייצרת תוצאות טובות יותר, תאים transfected ביעילות ניאון מאוד. האם התאים להיות פלורסנט אבל לא זרמים לצריבה, נקודות תקלות לשקול כוללים: חוסר חלבון אביזר (ים); פסולים ערבוב של ריאגנטים transfection; תת אופטימלית פתרונות הקלטה וכן מוטציה / רקומבינציה של הערוץ או ערוץ למקטע בונה cDNA ייצור לא תקין מקופל או לא להביע את הערוצים.
איור 1: האדם עובריים לתאי כליה 293T (HEK-293T) מגדלים monolayers חסיד ב 37oC באינקובטורים CO2 (CO2 5%) ב צלוחיות 25cm2 פרקו 90% confluency ולפצל בשעה 1:12, 01:08 ו - 01:04 דילולים. תאים מחולקים בדרך כלל אחת לשבועיים, החל confluency ~ 90%. כדי להבטיח דומה ~ 90% confluency על פיצול, פיצול תאים בדילול 01:08 בימי שני, 01:12 בימי חמישי. לפני transfection, בקבוק ומחוברות לגמרי מפוצלת 01:04 לתוך בקבוק חדש, התאים מותר לצרף ב 37oC בתוך חממה CO2 במשך 3-4 שעות.
איור 2: אסטרטגיה לביטוי Heterologous של תעלות יונים של HEK-293T (משמאל) cDNAs יון ערוץ הם משובטים לתוך האתר שיבוט מרובים של pIRES2-EGFP פלסמיד.. (מימין) transfection של מבנים אלה לתוך תאים HEK תוצאות בייצור של מולקולות mRNA המכיל את ערוץ יון קידוד רצף (אדום) רק נגד הזרם של אתר הריבוזום פנימי כניסה (IRES, כחול) את רצף eGFP קידוד (ירוק). תעלות יונים מתורגמים ו דילג על קרום התא באמצעות מיון, מערכת endomembrane, בעוד eGFP מתורגם ושמר בציטופלסמה.
איור 3:. Transfection וביטוי של Heterologous ערוץ cDNAs יון ב HEK-293T תאים, ציפוי של תאים על coverslips הקלטה אלקטרו (א) (פאנלים למעלה) HEK-293T תאים מודגרות ב 28 C, ארבעה ימים לאחר transfection עם LCav3 סידן ערוצי טיפח את וקטור pIRES2-CMV EGFP יונקים הביטוי. (לוחות תחתון) התאים מעל trypsinized ו מצופה על coverslips זכוכית מבודדת הקלטה אלקטרו. הפרעה דיפרנציאלי ניגודיות מיקרוסקופיה (DIC).
איור 4:. תלבושת אופיינית אלקטרו הקלטה הגדרת רכיבים אלקטרו מעטה הקלטה כוללים מגבר (A), מחשב אישי (PC), Digidata 1440A-to-Analog ממיר דיגיטלי ממשק (C), ממונע, המניפולטורים פיפטה כפול (PM), מיקרוסקופ epifluorescence (M), מערכות זלוף (P), רטט 63-500 TMC סדרה שולחן בידוד (VT), 40 גבוה Type II פאראדיי קייג' (FC), ואת שעמד חופשי 19 מתכת, מתקן חשמלי (R).
איור 5: מערכות זלוף (א) מערכת זרימת הכבידה המופעל באמצעות שסתומים טפלון Valvelink8 בקרי.. (ב) שמונה Smartsquirt ערוץ הלחץ זלוף מיקרו מערכת. Multi-חבית עצה סעפת של המערכת או זלוף הוא רכוב על מניפולטור ממונע.
איור 6:. מלוטש, pipettes תיקון שמוצג בהגדלה (מימין) 10x (משמאל) 40X תיקון pipettes נוצרו מתוך צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי עם נימה אש מלוטש כדי להחליק את קצה משטחים פיפטה. תוכנית פיפטה, חולץ היה מותאם כדי ליצור pipettes שנתן קריאה של 2-5MΩ ב electrophysiology שלנו הגדרת.
2314fig7.jpg "alt =" דמות 7 "/>
. איור 7: אלקטרודה קרקע ו pipettes תיקון בצלחת הקלטה תיקון פיפטה (מימין) הקרקע אלקטרודה (משמאל; חץ לבן) בפתרון ההקלטה.
איור 8:. PClamp10.1 צילומי מסך הממחישות את שלבי ביצוע התיקון (א ') עקבות גל כיכר נצפו במצב אמבטיה. (ב) חותם Gigaohm במצב תיקון מוביל השטחת להתחקות אחר גל מרובע עם קיבול פיפטה נראה כמו blips זעיר הנוכחית בשולי מובילים ונגררים של עקבות הנוכחית שטוח. (ג) לאחר פריצת דרך במצב התא, הארעיים קיבולי גדול נתפסים.
איור 9:. תוצאות Electrophysiology (משמאל) פנימה לצריבה מתח מגודרת זרמי סידן מציין transfection ביטוי מוצלח של תעלות יונים Heterologous (למשל LCav3). (מימין) תאים Untransfected אין זרמים לצריבה. תאים היו נתונים בפרוטוקול הרביעי המציין כי התוכנה להחזיק את התא ב-110mV ואז צעד אל 70mV עבור 250msec ואז בחזרה אל-110mV מחזיק פוטנציאליים. כל פעם צעד גדלה ב 10mV כך השלבים וכו 'ל-70mV,-60mV עד השלב האחרון הוא 20 mV. התוצאות עבור חסרי חוליות T-סוג (Cav3) homologue מתח מגודרת סידן ערוץ מ ל stagnalis כינה LCav3.
איור 10: הסדר של אלקטרודות ועיפרון microperfusion פתרון הקלטה (א) pipettes תיקון מבנה מן הכוס בורוסיליקט (מימין) polyimide רב חבית קצה סעפת עבור זלוף התרופה (משמאל).. אלקטרודה קרקע (חזרה) של זכוכית בורוסיליקט מלא 3M CsCl ו -1.5% פתרון agarose כפוף כמו מקל הוקי שנערך מחזיק microelectrode חצי תאים. (ב) להציג 40X דרך מיקרוסקופ של קצה זלוף עיפרון microelectrode ההקלטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק דיסקברי ההפעלה JDS של מדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC) של קנדה, NSERC אלכסנדר גרהם בל קנדה מלגות לתארים מתקדמים (דוקטורט) (א 'Senatore) וקרן לב ושבץ, גרנט -In-Aid NA # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
