Summary
애벌레 zebrafish는 척수 모터 신경 세포 및 대상 골격근에서 동시 패치 클램프 녹음을 허용하는 최초의 척추 모델 시스템을 나타냅니다. 이 동영상은 segmental 캡 모터 신경 세포와 목표 근육 세포뿐 아니라 각 세포 유형에서 레코딩을위한 방법론을 식별하는 데 사용되는 미세한 방법을 보여줍니다.
Abstract
애벌레 zebrafish는 척수 모터 신경 세포와 근육 대상에서 동시 패치 클램프 녹음을 허용하는 최초의 척추 모델 시스템을 나타냅니다. 이 두 세포 유형과 시각 형태 및 위치에 기초하여 단일 segmental 캡 모터 신경 세포를 구별하는 능력에 접근의 직접적인 결과이다. 이 동영상은 캡 모터 신경 세포와 목표 근육 세포뿐 아니라 각 세포 유형에서 레코딩을위한 방법론을 식별하는 데 사용되는 미세한 방법을 보여줍니다. 캡 모터 신경 세포 유형의 식별은 염료의 작성에 의해 또는 행동 잠재력 파형과 셀 입력 저항으로 biophysical 기능에 의해 확인됩니다. 일시간 여러 다른 대상 근육 세포에서 장기적인 레코딩을 허용에 대한 일상적으로 마지막으로 모터 신경 세포의 녹음. 모터 신경 세포의 발사 패턴을 통해 컨트롤 신경근육학 교차점에서 시냅스 전달의 주파수 의존의 측정이 가능합니다. 대형 quantal 크기 및 전체 셀 전압 클램프가 제공하는 낮은 잡음 때문에, 하나의 이벤트가 모든 근육에서 해결하실 수 있습니다. 이 기능은 릴리스 속성, 소포 재활용뿐만 아니라 우울증과 신경 촉진 등의 기본적인 시냅스 속성의 연구를 수 있습니다. 모터 뉴런은 보통 세포 전극에 의해 자극된 상태네 궁극적 생체내 준비 이클립스 이전 신경근육학 모델 시스템이 제공하는 장점은 연구와 근육이 전체 세포 패치 클램프에 비해 너무 큽니다. zebrafish 준비는 유전자 변형 라인, morpholino의 최저, 약리 개입 및 생체내 이미징에 포함하는 방법의 다양한 electrophysiological 분석을 결합 의무가 있습니다. 이러한 접근 방식은, zebrafish의 돌연변이 라인에 의해 제공 신경근육학 질병 모델의 증가와 결합, 인간 신경근육학 질환의 새로운 이해 문을 엽니다.
Protocol
1. 이점 레코딩을위한 물고기의 준비
- 이전 절차를 시작하기 위해 포함 5 가지 주요 솔루션을 준비 : 목욕 솔루션, Tricaine (MS222), 포름 아미드, 신경 세포 내부 솔루션과 근육 내부 솔루션과 함께 목욕 솔루션 목욕 솔루션입니다.
- 다음 72-96시간 세에서 Tricaine 욕조 솔루션의 장소 사이에 하나의 애벌레 zebrafish를 수집합니다. 마취에 노출 1 분 이내에 물고기 연락에 응답하지 않습니다.
- 플라스틱 접시 위에 생선을 놓고, stereomicroscope를 사용하여, 더블 에지 면도날로 목을 베다.
- sylgard와 코팅과 목욕 솔루션 가득한 유리 녹음 챔버에 생선을 전송합니다. notochord 통해 electrolytically 날카롭게 텅스텐 핀을 삽입하여 각 끝에 고정.
- 좋은 포셉 한 켤레에 대한 적절한 그립을 제공할 것입니다 핀과 함께 물고기의 주동이의 끝 근처에 피부 플랩을 만듭니다. 좋은 포셉 한 쌍의와 주동이의 핀 근처 재밌하여 overlying 피부를 제거합니다. 서서히 꼬리 방향으로 껍질 피부를 제거합니다.
- 녹음에 방해가있을 근육의 수축을 차단하는 3~5분에 대한 포름 아미드 욕조 솔루션 3 MLS와 생선을 취급. 일반 목욕 솔루션 5 번 씻으십시오. 부드럽게 텅스텐 핀의 측면과 scrapping하여 5-6 세그먼트를 통해 근육의 표면 층의 일부를 제거합니다.
- 전기 노이즈를 차폐하는 패러데이 케이지에 수직 현미경으로 생선을 전송합니다. 현미경은 오래 4X 거리에 40x 목적과 0.5의 확대 노력, 고정 무대를 갖추고 있습니다. 현미경은 높은 전력에 따라 신경 및 근육 사이의 준비를 이동하기 위해 전동 XY 번역 무대에 장착할 수 있습니다. 미분 간섭 대비 광학의 사용은 뉴런을 시각화하는 데 도움이됩니다.
- 0.5 X 줌에서 overlying 근육을 제거하고 척수를 노출하기 위해 넓은 구멍 15 미크론 피펫을 사용합니다. 부정적인 압력이 3 CC 일회용 주사기와 근육 세포를 통해 적용됩니다 하나씩 제거됩니다. 이 절차는 골격근의 5-6 등의 세그먼트에 대해 반복됩니다. 같은 넓은 구멍 피펫도 대상 빠른 골격 근육을 얻기 위해 복부 근육의 상위 두 레이어를 제거하는 데 사용됩니다.
- 이것은 이점 레코딩을위한 준비를 완료하고 현미경 줌 약 1.6x로 증가합니다.
2. 이점 캡 모터 신경 세포의 레코딩 및 대상 근육 세포
- 청소 세그먼트는 캡 뉴런의 위치를 스캔합니다. 척수의 각 헤미 세그먼트는 하나의 대형, 10 미크론의 직경, 캡 모터 신경 세포가 포함되어 있습니다. 이 티어드롭 모양 소마는 segmental 경계의 꼬리 가장 끝 부분에서 척수 두라 아래에 피상적으로 위치하고 있습니다. 캡 신경 세포는 녹음 선택하고 인접 꼬리 부분에서 복부 대상 근육은 무결성을 확인하는 검사입니다.
- 두 패치 전극 녹음, 신경 세포 하나는 근육에 대한 잠깐 위치하고 있습니다. 상부 전극은 힘든 척추 두라 있으며, 약 2 미크론의 팁 오프닝의 침투에 대한 얕은 테이퍼가 있습니다. 낮은 전극은 골격근의 낮은 저항 전압 클램프 녹음 험한 테이퍼가
- 척추 두라에 침투 약 30 도의 각도에 신경 전극을 위치에 대한 하나를 선택 캡 신경 세포에 주동이의 반 세그먼트. 약 60mm의 수은의 부드러운 지속적으로 긍정적인 압력을 적용하는 동안 축 드라이브 조작하는 사람을 사용하여 전극 사전. 전극이 두라을 통해 나누기로 캡틴 신경 세포는 초점의 구획 정리가 필요 전극에서 재관류에 의해 갑작스런 수 있습니다.
- 전극이 접촉하면 총액 신경 소마 긍정적인 압력이 출시와 gigaohm의 인감 즉각적인 형성에 일반적으로 결과입니다. 그러나, 봉인이 양식에 실패 경우에, 그것은 부드러운 부정적인 압력을 적용하는 데 필요한됩니다. 인감 형성 후, 전극 전위는 - 80mV로 조정하고 부정적인 압력의 응용 프로그램은 세포막을 파열이다. 캡 신경 세포가 140-180 메가 ohms의 입력 저항 및 행동 잠재력 해당 overshoots 40 millivolts이 특징입니다. 이것은 실천 가능성이 elicited 때까지 현재의 클램프 아래 depolarizing 단계를 점진적으로 증가 주사에 의해 테스트됩니다.
- 다음 현미경은 높은 전력에서 XY 전동 번역기를 사용하여 복부 근육에 이전됩니다. 빠른 근육 세포는 대상 필드에서 선택됩니다.
- 근육 전극이 출시되면, gigaohm 도장을 형성하고 긍정적인 압력을 받고 대상 근육 세포, 방향 고급입니다. 전극 전위는 나트륨 채널을 inactivate로 -50 millivolts 조정하고 부드러운 형편에서 세포막이 파열됩니다. 100-200 메가 ohms으로 저항하고 큰 용량성 과도 신호 항목의 갑작스런 등장에 놓습니다.
- 테스트하려면실천 가능성이 elicited 때까지 이점 녹화, 모터 신경 전류가 점진적으로 큰 주사에 의해 depolarized 있습니다. 이 시점에서 endplate 전류는 근육에 elicited해야합니다. 실패없이 endplate 전류 1 헤르츠 결과를 motorneuron의 지속적인 자극. 자극 주파수 100 헤르츠로 증가로 endplate 흐름은 진폭의 변동 자극을 10 초 이내에 기능을 고갈을 받고있다.
3. 대표 결과
일반적으로 신경 세포의 녹화는 최대 한 시간 동안 안정하지만 근육 세포는 같은 직렬 저항의 증가로 반영 저하. 이 문제가 발생하면 실험 중 종료 또는 다른 근육 세포는 패치가 고정되어 있습니다. 모든 녹음 한 시간 이내에 완료해야합니다.
그림 1. motorneuron 작업의 가능성 (AP, TOP)과 전류 관련된 근육 endplate (EPC, 하단)의 레코딩. 캡 신경 세포에 대한 행동 잠재력은 오버 슈트 40 뮤직 비디오와 EPC는 1 밀리초 이하 일정한 시간 지수 시간 코스를 따라 300 μsec과 부패 이내 상승해야한다.
| 이름 | 조리법 |
| 바스 솔루션 (MM)을 | 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 포도당, 10 나 - HEPES, pH를 7.8 |
| Tricaine 욕조 솔루션 | 0.02 % tricaine을 포함 바스 솔루션 |
| 포름 아미드 욕조 솔루션 | 2M 포름 아미드를 포함하는 바스 솔루션 |
| 신경 세포 내부 솔루션 (MM)을 | 115 K - 글루 콘 산, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES 5 K - EGTA, 4 MG - ATP, pH를 7.2 |
| 근육 내부 솔루션 (MM)을 | 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, 산도 7.4 |
표 1. 솔루션을 제공합니다.
Discussion
우리는 주로 고주파 자극하는 동안 소포 자료 및 재활용의 과정을 연구 zebrafish 이점 레코딩 (웬과 브렘, 2005)를 사용하고 있습니다. 이 과정은 주요 구성 요소는 시냅스에 의한 포인트 돌연변이로 생긴 전형적인 시냅스 전달이 궁극적으로 운동성의 돌연변이에 방해됩니다. 예를 들어, postsynaptic 수용체 집계 (오노 외., 2001, 2002, 2004)와 presynaptic 송신기의 합성 (왕 외., 2008) 취소 조정 수영의 결과를 방해 변이. 이점 녹음 따라서 행동, 유전학 및 생리학을 연결하는 기능 결함의 원인을 정확히 파악할 수있는 정보를 제공합니다. 이제 더 사려 분별이있는 발기인을 사용하여 캡 모터 뉴런에 과도 표현에 의해 시냅스 전송을 기본 프로세스를 해부하다 수 있어야한다. 이런 방식으로 지배적인 부정적 또는 변이된 유전자가 특별히 이러한 뉴런의 표현과 모두 행동 및 electrophysiological 결과는 결정 수 있습니다. 전체 세포 구성에 의해 제공되는 추가적인 장점은 잠재적으로 이러한 clostridial 독소와 칼슘 버퍼로 소포 재활용을 변경할 수 에이전트와 캡 소마의 투석 수 있습니다. 소마와 근육 사이의 짧은 거리로 인해 보급이 레코딩의 시간 프레임 내에 잘 발생한다. 이 준비의 가능성은 도청으로 시작했습니다. 시냅스의 연령과 표면 위치에있는 물고기의 투명성은 또한 광학 도구의 사용 (; Fetcho와 히가시 2004 Fetcho와 오말리, 1997)을 용이하게합니다. 우리는 FM 염료와 같은 Synaptophluorin (리튬 외., 2003)로 유전자 지표를 사용하여 생활 생선에 엔도와 exocytosis의 측정에서 매우 성공적으로되었습니다. 또한, 형광 복합 독소가 활어 (아이 바네즈 - 탈론 외., 2004)의 이미징을위한 시냅스 단백질을 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 준비의 단순 감안할 때 그것은 미래의 학습에 큰 약속을 보유하고 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
NIH (NS - 18205)에 의해 재정 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| 0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems | 715000 | |
| Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning | The thickness of application will affect the DIC optics |
References
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
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