خلاصة من المنحنى الرابع ايون القناة باستخدام مكونات التردد

Summary

هناك عقبات تقنية لقياس التدفق الحالي من خلال قنوات متعددة في وقت واحد أيون ، والمميزين في وقت لاحق ما جزءا من التيار عبر الغشاء ومن المقرر أن لكل نوع القناة. لتلبية هذه الحاجة ، وهذا الأسلوب يمثل وسيلة لتوليد المنحنى الرابع من أنواع قناة منفردة باستخدام مكونات تردد معين.

Abstract

مقدمة : في الوقت الحاضر ، لا توجد وسائل متعددة لقياس أنشئت أنواع القناة الايونية في وقت واحد ، وتتحلل إلى أجزاء قياس الحالية التي تعزى إلى كل نوع القناة. هذه الدراسة توضح كيف يمكن استخدام التحليل الطيفي لتحديد مقاومة الترددات المحددة التي ترتبط إلى حد كبير مع اتساع حالة مستقرة خلال التجارب الحالية قياس الجهد المشبك. الأسلوب ينطوي على إدراج وظيفة الضوضاء التي تحتوي على ترددات محددة في بروتوكول خطوة الجهد. في العمل المقدم ، يتم استخدام خلية نموذج لإثبات أن يتم إدخال أي الارتباطات عالية من قبل الدوائر المشبك الجهد ، كما أن وظيفة الضوضاء في حد ذاته لا يدخل أي الارتباطات عالية عند أي قنوات ايون موجودة. هذا ضروري قبل التحقق من صحة ويمكن تطبيق هذه التقنية لالمستحضرات المحتوية على القنوات الأيونية. الغرض من هذه المقدمة هو بروتوكول لشرح كيفية توصيف استجابة تردد من نوع أيون قناة واحدة إلى وظيفة الضوضاء. مرة واحدة وقد تم التعرف على ترددات محددة في نوع قناة منفردة ، ويمكن استخدامها لإنتاج الحالة الراهنة الجهد المستمر (الرابع) المنحنى. ثم قد الترددات العالية التي ترتبط مع نوع قناة واحدة وربط الحد الأدنى مع أنواع قناة أخرى يمكن استخدامها لتقدير المساهمة الحالية لأنواع متعددة تقاس قناة في وقت واحد.

الطريقة : أجريت قياسات المشبك الجهد على خلية باستخدام نموذج خطوة الجهد معيار البروتوكول (-150 إلى +50 بالسيارات ، 5mV الخطوات). أدرجت في كل خطوة الجهد : الوظائف التي تحتوي على مقادير متساوية من الضوضاء من الترددات كيلوهرتز 15/01 (50 أو 100mV الصفر إلى سعة الذروة). تم حساب المكون الحقيقي لتحويل فورييه السريع (FFT) من إشارة الخرج مع وبدون ضجيج المحتملة لكل خطوة. ويرتبط حجم كل تردد بوصفها وظيفة من الخطوة الجهد مع السعة الحالية في الفولتية المقابلة.

النتائج والاستنتاجات : في غياب الضوضاء (السيطرة) ، وتراوحت شدتها بين جميع الترددات باستثناء عنصر العاصمة ارتباطا ضعيفا (| R | <0.5) مع منحنى الرابع ، في حين أن عنصر العاصمة كان معامل الارتباط أكبر من 0.999 في جميع القياسات. لم نوعية العلاقة بين الفرد والترددات المنحنى الرابع لم تتغير عندما أضيفت وظيفة الضجيج على البروتوكول خطوة الجهد. وبالمثل ، وزيادة السعة وظيفة الضوضاء كما لا يزيد من الارتباط. قياسات التحكم تثبت أن الدوائر المشبك الجهد في حد ذاته لا يسبب أي ترددات فوق 0 هرتز إلى حد كبير مع ربط منحنى الرابع ثابتة للدولة. وبالمثل ، والقياسات في وجود وظيفة الضوضاء تدل على أن وظيفة الضجيج لا يسبب أي ترددات فوق 0 هرتز إلى ربط مع المنحنى الرابع المطرد للدولة إذا لم تكن هناك قنوات ايون موجودة. على أساس هذا التحقق ، ويمكن الآن طريقة يمكن تطبيقها على المستحضرات التي تحتوي على قناة واحدة نوع أيون بقصد تحديد الترددات التي سعة ربط هذا النوع تحديدا مع القناة.

Protocol

1. تعد الدالة والضوضاء إشارة الإدخال

1. إنشاء دالة الضوضاء التي تحتوي على عناصر الترددات المطلوبة. ويمكن القيام بذلك عن طريق تصف مكونات التردد المطلوب في المجال تردد ومن ثم حساب تحويل فورييه العكسية السريعة. في هذه الدراسة ، 1 -- كان يستخدم 15 كيلو هرتز. وحسبت جميع تحويلات فورييه وتحويل فورييه العكسية وصفها في هذه الدراسة باستخدام FFT مطلب وظائف IFFT.
2. مقياس السعة وظيفة الضوضاء بشكل مناسب. في هذه الدراسة تم تحجيمها وظيفة مثل هذه الضوضاء التي الصفر إلى ذروة سعة الدالة ضجيج بلغ 50 أو 100 فولت.
3. إنشاء ملف التحفيز باستخدام الأساليب المناسبة لاقتناء البرمجيات المستخدمة. لClampex 8 ، أولا إنشاء ملف نصي مع رأس المناسبة. دون رأس ، تضاف الزيادات الوقت لحملة واحدة في العمود الأول. ينبغي للزيادات الوقت نفسه يكون التباعد الزمني الفاصل كما أخذ العينات المستخدمة في القياسات. لكل اكتساح في البروتوكول خطوة الجهد إدراج الفولتية بالضبط المطلوب في كل خطوة الوقت. وينبغي أن تشمل هذه الدالة الضوضاء.

2. إجراء قياسات الجهد المشبك

1. إنشاء بروتوكول القياس ضمن برنامج الاستحواذ والتي تتوافق مع ملف التحفيز ولدت من قبل. في Clampex ، هناك القائمة التي تسمح للمستخدم لربط ملف التحفيز مع البروتوكول الحالي.
2. إرفاق نموذج (أو البيولوجية) الخلية إلى معدات القياس.
3. تنفيذ التجربة كما كان مقررا. لأغراض المراقبة ، للتأكد من القياسات الدورية التي لا تتضمن أية وظائف الضوضاء.

3. آخر تجربة التحليل

1. حساب منحنى الرابع لتسجيل الفردية. إذا كان التسجيل هو في حالة مستقرة عند تطبيق الدالة ضجيج ، يمكن إنشاء منحنى رابعا استخدام جزء من حالة مستقرة تسجيل مؤقتا خارج نطاق الدالة الضوضاء. إذا لم يكن في تسجيل حالة مستقرة ، وظيفة الضوضاء قد تتداخل مع حساب منحنى الرابع ، لذلك ينبغي أن يتم تسجيل وظيفة ثانية دون ضجيج الحالي.
2. لكل خطوة الجهد في تسجيل حساب تحويل فورييه سريع لجزء من التسجيل ، حيث تم إدراج الدالة الضوضاء. الجمع بين تحويل فورييه لكل خطوة الجهد في مصفوفة amxn ، حيث m هو عدد من الترددات في الاتحاد الفرنسي للتنس ، و n هو عدد من الخطوات الجهد. في هذا التكوين ، كل صف من المصفوفة يمثل اتساع وتيرة واحدة في جميع مراحل الجهد في التجربة.
3. لكل تردد (أي كل صف في المصفوفة أعلاه) ربط الصفوف مع منحنى ولدت في الرابع وسجل 3.1 معامل الارتباط.
4. مؤامرة ضد معامل الارتباط لتصور تردد الترددات العالية التي تترابط مع المنحنى الرابع. منذ يرد المكون داخل العاصمة وتيرة الأول من الاتحاد الفرنسي للتنس ، ينبغي أن معامل الارتباط لهذا التردد يكون دائما> 0.99.

4. ممثل النتائج :

وتظهر القياسات ممثل الشبك الجهد لخلية نموذجية دون (الشكل 1A) ومع (الشكل 1B) وظيفة الضجيج إدراجها في البروتوكول خطوة الجهد. وحسبت أيضا منحنى الرابع نموذج للخلية (الشكل 1C). لكل الاجتياح ، في التسجيلات من الشكل 1 ، وكان الاتحاد الفرنسي للتنس على حساب الإطار الزمني حيث تم إدراج الدالة الضوضاء (انظر مربع أحمر في أرقام 1A ، 1B). الأرقام 2A و 2B تظهر FFTs يحسب للتسجيلات تظهر في الشكل و1A 1B ، على التوالي. بناء على الفحص البصري ، المكون العاصمة (أبرزت باللون الأحمر) ويبدو أن تحاكي شكل المنحنى الرابع. من دون ضجيج وظيفة ، وجميع ترددات فوق العاصمة ويبدو أن سعة قريبة من الصفر (الشكل 2A). عند إدراج الدالة الضوضاء ، الترددات بين 1 و 15 كيلو هرتز وسعة ملحوظ بصريا (الشكل 2B). ويبين الشكل 3 نتيجة ربط سعة التردد الفردية عبر سلسلة من الخطوات ضد الجهد المنحنى الرابع. الشكل 3A - C يبين معاملات الارتباط عندما تم إجراء التجربة في ظل ظروف التحكم (أي وظيفة الضجيج) ، وضجيج مع سعة 50 و 100 فولت ، على التوالي. لاحظ في جميع الحالات ، يبدو عنصر لربط العاصمة تماما تقريبا مع المنحنى الرابع. في الواقع ، بالنسبة لجميع التسجيلات ، وكان معامل الارتباط لهذا التردد أكبر من 0.99 (R = 0.9996 ± 1E - 5 ، يعني ± الانحراف المعياري). عندما ننظر في الشكل 3A (شروط السيطرة) ، لا توجد ترددات بجانب المكون العاصمة الذي يرتبط بشكل كبير مع اتساع المنحنى الرابع. على وجه التحديد ، فإن أيا من هذه الترددات ومعاملات الارتباط أكبر من 0.5. الإدراج على وظيفة أدنى ضجيج السعة (50 فولت) ، وهذه الترددات نفسها كانت لا تزال أقل من معاملات الارتباط 0.5. معاملات الارتباط لالترددات ذاتها كما لم تصبح أكبر من 0.5 عندما تمت زيادة السعة إلى 100 الضوضاء بالسيارات.

. الشكل النموذجي للخلية تسجيلات 1 : تظهر التسجيلات المشبك الجهد لخلية نموذجية دون (1A) ومع (1B) وظيفة الضجيج تضمينها في بروتوكول الجهد الخطوة. لأول 20 مللي ثانية والأخير من كل اكتساح ، بقي المحتملة في إمكانية عقد (0 بالسيارات). وكان كل خطوة الجهد 80 مللي طويل ، وأضيفت وظيفة الضوضاء 40 مللي ثانية بعد بداية الخطوة. وكان الضجيج وظيفة مدة 30 مللي ثانية والترددات الواردة بين 1 و 15 كيلو هرتز. وقد كثفت الجهد جيئة وذهابا ، -150 إلى +50 بالسيارات في 5 زيادات بالسيارات. ويظهر أيضا منحنى الرابع نموذج للخلية (1C). تسجيلات لجعل أسهل في القراءة ، أدرج فقط كل اكتساح الخامس في 1A 1B و، ولكن تم إدراج جميع الاحتلالات في 1C.

الشكل 2 FFT التسجيلات : تم احتساب FFT لجزء من كل 30 مللي اكتساح حيث الوظيفة الضجيج هو أن إدراج (المنطقة المحصورة بين مربع أحمر في أرقام 1A ، 1B). الأرقام 2A و 2B تظهر FFTs دون احتساب وظيفة مع الضجيج ، على التوالي. مرة أخرى ، من أجل الوضوح ، يتم تضمين فقط من كل FFT الاجتياح الخامس في الشكل ، ولكن تم استخدام كل الاحتلالات في حسابات المستقبل.

وأظهرت نتائج الارتباط بين المنحنى الرابع من تسجيل وسعة الترددات الفردية عبر مجموعة من الخطوات الجهد : الرقم التردد الرابع 3 إرتباطات. الأرقام 1A -- 1C تظهر معامل الارتباط للترددات 0-20 كيلو هرتز في ظل ظروف السيطرة ، وبحضور 50 أو 100 وظائف الضوضاء بالسيارات ، على التوالي.

الشكل 4 إعادة إنشاء منحنى رابعا : تم مضافين منحنى الرابع نموذج للخلية (نفس الشكل 1C) وحجم اثنين من الترددات. وكان تردد لأول مرة عنصر العاصمة (R = 0.995) ، والثانية كانت تردد اختيارها عشوائيا مع ارتباط منخفضة (R = 0.3212). وتحجيم سعة التردد في السعة تقريبا نفس المنحنى الرابع.

Discussion

هناك عقبات تقنية تمنع في الوقت الحاضر الباحثون من قياس أنواع متعددة في وقت واحد مع قناة أيون النية في وقت لاحق لتحديد مدى الحالية ينبغي أن ينسب إلى كل نوع القناة. وبسبب هذا القيد ، وعادة ما يتم دراسة القنوات الأيونية فردي باستخدام تقنيات مثل المشبك المحتملة الجهد ، والحالية ، والعمل من ¹ إلى دراسة أنواع القنوات الفردية ، وغالبا ما تستخدم غيروي نظم التعبير. ² عند العمل مع الخلايا المعزولة من الأنسجة ، مثل العضلية ، يجب استخدام وسائل أخرى لمنع القنوات الأيونية المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون المعطل قنوات الصوديوم بواسطة منحدر بطيء depolarizing الجهد ، يمكن أن يكون قد تم حظره الداخل ³ قنوات البوتاسيوم مع تصحيح BaCl2 خارج الخلية ، ⁽⁴⁾ ويمكن حظر استخدام قنوات الكالسيوم فيراباميل ⁵

أسلوب واحد يستخدم هذا جزئيا يتغلب على هذا القيد هو قياس التدفق الحالي من خلال أنواع قناتين في وقت واحد ، ثم كرر بعد حظر انتقائي قياس نوع واحد مع وكيل قناة مناسبة. ويمكن بعد ذلك الطرح من القياسين أن تستخدم لتقدير كمية الحالية تعزى إلى نوع القناة التي تم حظرها. ⁶ ومع ذلك ، هناك نوعان من القيود الرئيسية لهذه التقنية. أولا ، لم يتم تحديد العوامل الكيميائية التي يمكن أن تسد بشكل انتقائي كل قناة أيون ، وبعض الأدوية المستخدمة على نطاق واسع وغير محدد أنواع التفاعلات مع قناة أخرى. ^5،7 ثانية ، فإنه لا يمكن تحديد ما إذا كان هذا الأسلوب من قناة واحدة هي عن طريق التضمين أخرى القناة. على سبيل المثال ، فقد تبين التعبير غير متجانسة من NAV 1.5 و 2.1 في البطينين قير خنزير غينيا ، وقيل أن وجود علاقة التآزر القائم بين القناتين ، مثل أن ارتفاع 2.1 قير التعبير في البطين الأيمن يخفض سرعة التوصيل. ⁸ في الوقت الحاضر ، لا يمكن أن يكون هذا التحقق.

في هذه الدراسة ، فإننا نقترح أن التحليل الطيفي مقاومة قد تكون أداة مفيدة لدراسة أنواع متعددة القناة الايونية يقاس في نفس الوقت. لم يكن أبدا على الرغم من الطريقة المستخدمة لتقديم نستشف من أنواع التيارات القناة الثانية يقاس في نفس الوقت ، تم استخدام التحليل الطيفي للمقاومة الدراسة عددا من الجوانب الأخرى من وظيفة القناة الايونية. وأظهرت غودمان والفن باستخدام خلايا الشعر السمعي السلاحف التي يمكن تعديلها بروتوكولات المشبك الحالية لضبط خلية لترددات مختلفة ، والتذبذبات في إمكانات عبر الغشاء هو نتيجة لتفاعل بين الداخل تصحيح قناة ⁺ K وقناة ⁺ كا ^2. تظاهر ⁹ هان وفرايزر التي يمكن قياسها مقاومة في خلية واحدة على نطاق واسع من الترددات (100 هرتز إلى 5 ميجاهيرتز) ، والزيادة في مقاومة عندما لاحظ K ⁺ أو كا ^{2 +} سدت قنوات يمكن أن تكون وسيلة بسيطة ل اكتشاف كتلة في قناة عالية الإنتاجية شاشات المخدرات. فيشمان ¹⁰ هاياشي واستخدمت تصرف معقدة لدراسة الخصائص الحركية لتصحيح الداخل قناة ⁺ K ¹¹ مجموعات أخرى أدرجت وتيرة واحدة في بروتوكول المشبك الجهد من أنواع مختلفة ، والقناة أظهرت أن وافقت لاحظ تردد الاستجابة مع الاستجابة المتوقعة لبعض الترددات ولكن ليس غيرها. ^12،13 Millonas Hanck واقترح بعض الترددات السبب لم ينتج رد الفعل المتوقع هو وجود ثوابت معدل متعددة في نموذج ماركوف ^(12). مثل هذه الدراسات ، فضلا عن غيرهم ، أثبتت أن هناك حالات عندما التيارات الأيونية تقاس من القنوات الأيونية أثناء استخدام التحليل الطيفي مقاومة لا نتفق مع استجابة التردد النظري. هذا ليس مصدر قلق في هذه الدراسة ، لأن الغرض من هذا الأسلوب في هذه الدراسة هو تحديد الترددات التي ترتبط مع السعة الحالية مستقل من الافتراضات الكامنة وراء غشاء الدائرة الكهربائية. Furtheremore ، يتم حساب السعة الحالية من أجزاء من التسجيلات التي لا تملك أية وظائف الضوضاء إدخالها عليها. وهناك عدد من الدراسات الأخرى أيضا النماذج الحالية للمعرض العديد من القنوات الأيونية إجراء العديد من المنظمات غير التوصيل وجميع الدول مع ثوابته معدل الخاصة. ^14،15،16 طومسون وآخرون أظهرت أن فلتر الانتقائية للقناة KcsA ومواقع الربط مختلفة لنا ⁺ لي + و K ⁺ ، وتكاليف حيوية في الانتقال من موقع واحد ملزم لآخر كما تتحرك ايون من خلال تصفية الانتقائية هو ما يجعل قناة سلوك تفضيلي K ⁺ الأيونات من خلال المسام والخمسين. ⁽¹⁷⁾ وفي هذه الورقة أدرجنا مجموعة من الترددات (وظيفة الضجيج) في البروتوكول خطوة الجهد وبحثت عن الترددات التي ترتبط السعة العالية السعة مع التيار العام. منذ أن قدمت أدلة قوية تشير ثوابت معدل متعددة تلعب دورا في توصيل الأيونات من خلال differenقد ر القنوات ، وإدخال ترددات المرتبطة بهذه الثوابت معدل ترددات معينة لسبب أو ربط صداها عاليا مع السعة الحالية ، والتي لن يكون على خلاف ذلك. يتم تنفيذ هذا الأسلوب أثبت في هذه الدراسة على خلية النموذج ، الذي هو مواز RC الدوائر التي تستخدم عادة لاختبار الدوائر المشبك الجهد والمعدات الاستحواذ. وليس من المتوقع أن أي الترددات الى جانب العاصمة وترتبط مع حجم الحالية ، وهذا هو مبين في البيانات المتوفرة لدينا. علينا أن نبين أن إضافة وظيفة الضجيج لم يسبب أي الترددات العالية لربط مع السعة الحالية. هذه النتائج الحاسمة هما لأنها تظهر أن معدات القياس وظيفة الضجيج لا في حد ذاتها سببا لربط أي الترددات مع السعة الحالية. الدراسات المستقبلية عند إجراء قياسات باستخدام الأغشية تحتوي على القنوات الأيونية ، ومن المتوقع أنه ، اعتمادا على القناة المستخدمة ، والترددات التي تتوافق مع ثوابت المعدل في تصفية انتقائية أو ربما المسام وسوف تؤثر على استجابة التردد للقناة والتي تؤثر على ترددات عالية و أو ارتباط منخفضة مع السعة الحالية.

لأن هذا الأسلوب هو أسلوب جديد لدراسة القنوات الأيونية ، وهناك عدد من الاتجاهات ويمكن متابعة الدراسات المستقبلية. أولا ، ينبغي أن تستخدم هذه التقنية لوصف استجابة التردد لقنوات محددة معزولة. عمل إضافي يحتاج أيضا إلى أن يتم لمعايرة سعة التردد على سعة الحالية. مرة واحدة وتتميز قنوات متعددة بشكل فردي ، يجب أن تقاس أنواع متعددة في نفس الوقت قناة. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه التقنية لاستخدامها في عمل محتمل المشبك ، المشبك الحالية ، وتحفيز الدراسات الميدانية. في حين أن هذا هو أسلوب جديد ، فإنه يظهر ما يمكن أن يكون وسيلة قوية لجعل القياسات الكهربية التي كانت في السابق غير ممكن ، وتقديم رؤى جديدة قيمة في دور الفسيولوجية للقنوات أيون.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matlab	Mathworks	n/a	Natick, MA
Clampex 8	Molecular Devices	Clampex 8	Sunnyvale, CA
Integrating Patch Clamp Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200	Sunnyvale, CA
Headstage	Molecular Devices	CV202	Sunnyvale, CA
16-Bit Data Acquisition System	Molecular Devices	Digidata 1322A	Sunnyvale, CA
Model Cell	Molecular Devices	Patch 1 Model Cell	Sunnyvale, CA