Summary
Aynı anda birden fazla iyon kanalları aracılığıyla mevcut akı ölçüm teknik engeller ve transmembran akım daha sonra seçici hangi bölümünü her kanal tipi nedeniyle. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu yöntem belirli frekans bileşenleri kullanarak tek tek kanal türleri IV eğrisi oluşturmak için bir yol sunar.
Abstract
GİRİŞ: Halen, aynı anda birden fazla iyon kanalı türleri ölçmek ve her kanal tipi atfedilebilecek parçaya ölçülen akım ayrıştırmak için kurulan yöntemleri vardır. Bu çalışmada, yüksek gerilim kelepçe deneyler sırasında ölçülen kararlı durum geçerli genliği ile korele belirli frekanslarda empedans spektroskopi tanımlamak için kullanılır nasıl olabilir göstermektedir. Bu yöntem, belirli frekanslarda gerilim adım protokolü içeren bir gürültü fonksiyonu ekleyerek içerir. Sunulan çalışmada, bir model hücre yüksek korelasyon hiçbir iyon kanalları mevcut gürültü fonksiyonu kendisi herhangi bir yüksek korelasyon tanıtmak olmadığını gerilim kelepçe devresi tarafından tanıtıldı ve olduğunu göstermek için kullanılır. Bu doğrulama tekniği iyon kanalları içeren preparatlar uygulanabilir önce gereklidir. Sunulan protokolün amacı, bir gürültü fonksiyonu tek bir iyon kanal tipi frekans tepkisini karakterize nasıl göstermek için. Belirli frekansları tek bir kanal tipi tespit edildikten sonra, onlar, kararlı hal akımı gerilim (IV) eğrisi üretmek için kullanılabilir. Daha sonra yüksek bir kanal türü ile ilişkilidir ve minimal diğer kanal türleri ile korele Frekanslar, eş zamanlı olarak ölçülür birden fazla kanal türleri geçerli katkısını tahmin etmek de kullanılıyor olabilir.
YÖNTEM: Gerilim kelepçe ölçümleri, standart bir gerilim adım protokolü (-150 ile +50 mV, 5mV adım) kullanarak bir model hücre yapıldı. 1-15 kHz frekansları (sıfır tepe genlikleri: 50 veya 100mV) eşit büyüklükleri içeren Gürültü fonksiyonları gerilim her adım içine yerleştirildi. Çıkış sinyali Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) gerçek bir bileşeni olan ve her adımı potansiyelini için gürültü olmadan hesaplanmıştır. Her frekansın bir fonksiyonu olarak gerilim adım büyüklüğü ilgili gerilimler geçerli genliği ile orantılı idi.
SONUÇ VE ÖNERİLER: gürültü olmaması (kontrol), DC bileşeni dışındaki tüm frekansları büyüklükleri korelasyon zayıf (| R | <0.5) IV eğrisi ile, tüm ölçümlerde korelasyon katsayısı 0,999 'den büyük bir DC bileşeni oysa. Bireysel frekansları ve IV eğrisi arasındaki korelasyon kaliteli bir gürültü fonksiyonu gerilim adım protokolü eklendiğinde bir değişiklik olmadı. Aynı şekilde, gürültü fonksiyonunun genliği artan bir ilişki artırmak vermedi. Kontrol ölçümleri tek başına gerilim kelepçe devre 0 Hz üstünde frekansları son derece kararlı durum IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neden olmadığını göstermektedir. Aynı şekilde, gürültü fonksiyon varlığı ölçümleri, gürültü fonksiyonu, hiçbir iyon kanalları zaman herhangi bir 0 Hz üstünde frekansları kararlı durum IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neden olmadığını göstermektedir. Bu doğrulama yöntemi artık genlikleri özellikle bu kanal tipi ile korelasyon tespit frekansları amacı ile tek bir iyon kanal tipi içeren preparatlar uygulanabilir.
Protocol
1. Gürültü Fonksiyon ve Giriş Sinyali hazırlayın
- Istenilen frekans bileşenleri içeren bir gürültü işlev oluşturun. Bu frekans alanında istenilen frekans bileşenleri açıklayan ve daha sonra ters hızlı Fourier dönüşümü hesaplanması yapılabilir. Bu çalışmada, 1 - 15 kHz kullanılmıştır. Tüm Fourier dönüşümleri ve bu çalışmada açıklanan ters Fourier dönüşümleri Matlab'ın FFT ve IFFT fonksiyonları kullanılarak hesaplandı.
- Uygun gürültü fonksiyonunun genliği Ölçeği. Bu çalışmada gürültü fonksiyonu sıfır gürültü fonksiyonunun genlik zirve için 50 veya 100 mV olduğu gibi yaygınlaştırılmıştır.
- Kullanılan kazanım yazılım için uygun yöntemler kullanılarak bir uyarıcı dosya oluşturun. Clampex 8 için ilk önce uygun bir başlık ile bir metin dosyası oluşturun. Başlığın altında, tek bir süpürme için ilk sütunda zaman artışlarla yerleştirin. Zaman artışlarla ölçümlerinde kullanılan örnekleme aralığı aynı zamansal aralık olmalıdır. Gerilim adım protokolü her süpürme için her zaman bir adım istenen tam gerilim yerleştirin. Bu gürültü fonksiyonu içermelidir.
2. Gerilim Kelepçe Ölçümleri gerçekleştirin
- , Daha önce oluşturulan uyaran dosya ile uyumlu satın yazılım içinde bir ölçüm protokolü oluşturun. Clampex, kullanıcı mevcut protokolü ile bir uyarıcı dosya ilişkilendirmek için izin veren bir menü var.
- Ölçüm ekipmanı hücreli bir model (ya da biyolojik) takın.
- Planlandığı gibi deney yapın. Kontrol amaçları için, herhangi bir gürültü fonksiyonları içermez periyodik ölçümler dahil ettiğinizden emin olun.
3. Mesaj Deney Analizi
- Bireysel bir kayıt için IV eğrisi hesaplayın. Kayıt gürültü fonksiyonu uygulanan kararlı hal ise, IV eğrisi zamansal gürültü fonksiyonu aralığının dışında kayıt kararlı bir duruma kısmını kullanarak oluşturulabilir. Kayıt kararlı durum değilse, gürültü işlevi IV eğrisi hesaplama engel olabilir, gürültü fonksiyonu olmadan ikinci bir kayıt yapılmalıdır.
- Hızlı Fourier dönüşümü gürültü fonksiyonu eklenmiş kayıt kısmı gerilim bir kayıt her adım için hesaplar. Amxn m FFT frekansları sayısı matris, ve n her bir gerilim adım için Fourier dönüşümü birleştirin gerilim adımları sayıdır. Bu yapılandırmada, matris her satır, tek bir frekans genlik deneyde tüm gerilim adımları temsil eder.
- Her frekans için (yani Yukarıdaki matris her satır) 3.1 oluşturulan IV eğrisi ile satır korelasyon korelasyon katsayısı kaydedin.
- IV eğrisi ile son derece ilişkilidir frekansları görselleştirmek için korelasyon katsayısı vs frekans çizilir. DC bileşeni FFT ilk frekansı içinde yer olduğundan, bu frekans için korelasyon katsayısı her zaman> 0.99 olmalıdır.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Temsilcisi voltaj kelepçe ölçümleri olmadan (Şekil 1A) ve gerilim adım protokolü içine yerleştirilir (Şekil 1B) bir gürültü fonksiyonu ile bir model hücre için gösterilmiştir. IV eğrisi modeli hücre (Şekil 1C) hesaplandı. Her süpürme, Şekil 1 kayıtları, FFT gürültü fonksiyonu takılı olduğu zaman diliminde (Şekil 1A, 1B kırmızı kutuya bakın) üzerinden hesaplanmıştır. Şekil 2A ve 2B sırasıyla Şekil 1A ve 1B gösterilen kayıtları için hesaplanan FFTs göstermektedir. DC bileşeni (kırmızı vurgulanmıştır) görsel inceleme üzerine, IV eğrisinin şekli taklit etmek için görünür. Gürültü fonksiyonu olmadan, DC yukarıdaki tüm frekansları genlikleri sıfır (Şekil 2A) yakın olduğu görülmektedir. Gürültü fonksiyonu takıldığında, 1 ve 15 kHz frekansları arasında görsel fark genlikleri (Şekil 2B). Şekil 3 IV eğrisi karşı gerilim adımları aralığında ayrı frekans genlikleri ilişkilendirme sonucu gösterir. Şekil 3A-C, deney, kontrol koşulları (gürültü fonksiyonu) altında ve sırasıyla 50 ve 100 mV gürültü genlikleri ile yapıldı korelasyon katsayıları gösterir. Bildirim, tüm durumlarda DC bileşeni IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neredeyse mükemmel bir şekilde görünür. Gerçekten de, tüm kayıtlar için, bu frekans için korelasyon katsayısı 0.99 (R = 0,9996 ± 1E-5, ortalama ± standart sapma) daha fazlaydı. Şekil 3A (kontrol koşulları) baktığınızda, amplitüdünün IV eğrisi ile ilişkilidir DC bileşeni dışında herhangi bir frekansları vardır. Özellikle, bu frekansları hiçbiri 0.5 daha yüksek korelasyon katsayıları var. Düşük genlik gürültü fonksiyonu (50 mV) takılması üzerine, bu aynı frekansları hala korelasyon katsayıları 0.5 'den daha az oldu. Için korelasyon katsayılarıgürültü genlik 100 mV arttı se frekansları da 0.5 'den büyük haline vermedi.
Şekil 1. Model Hücre Kayıtlar: Gerilim kelepçe kayıtları olmadan (1A) ve gerilim adım protokolü (1B) bir gürültü fonksiyonu ile bir model hücre için gösterilmiştir. Her süpürme ilk ve son 20 ms için, potansiyel tutma potansiyeli (0 mV) tutuldu. Her gerilim adım 80 ms uzun ve gürültü fonksiyonu adım başladıktan sonra 40 ms yerleştirildi. 30 ms gürültü fonksiyonu bir süre vardı ve 1 ile 15 kHz arasındaki frekansları içeren. Gerilim, fro, 5 mV artışlarla -150 ile +50 mV adım oldu. Model hücre için bir IV eğrisi de (1C) gösterilir. Kayıtları okumak için daha kolay hale getirmek için, sadece her beşinci süpürme 1A ve 1B dahil edildi, ancak tüm tarama 1C dahil edildi.
Şekil 2 Kayıtların FFT: FFT gürültü fonksiyonu (kırmızı kutu Rakamlar 1A, 1B ile sınırlı alan) eklenecek her süpürme 30 ms kısmı için hesaplanan oldu. Şekil 2A ve 2B FFTs sırasıyla gürültü fonksiyonu olmadan ve hesaplanan göstermektedir. Bir kez daha, netlik, her beşinci süpürme sadece FFT resimde dahil, ancak tüm tarama gelecek hesaplamaları kullanılmıştır.
Şekil 3 IV Frekans Korelasyonlar: bir kayıt IV eğrisi ve gerilim adımları aralığında bireysel frekansları genliği arasındaki korelasyon sonuçları gösterilir. Rakamlar 1A - 1C sırasıyla kontrol şartlar altında 0 - 20 kHz frekansları, ve 50 veya 100 mV gürültü fonksiyonlarının varlığı korelasyon katsayısı, göstermektedir.
Şekil 4 IV Eğrisi Yeniden Oluşturma: IV eğrisi modeli hücre (Şekil 1C olarak aynı) ve iki frekans büyüklüğü üst üste edildi. Ilk frekans DC bileşen (R = 0.995), ve düşük korelasyon (R = 0,3212) ile ikinci, rastgele seçilmiş bir frekans oldu. IV eğrisi yaklaşık olarak aynı genlik frekans genlikleri ölçekli edildi.
Discussion
Daha sonra ne kadar mevcut her bir kanal tipi atfedilen olmalıdır belirlenmesi amacı ile aynı anda birden fazla iyon kanalı türleri ölçme halen araştırmacıların teknik engeller vardır. Bu sınırlama nedeniyle, iyon kanalları genellikle voltaj, akım, ve aksiyon potansiyel kelepçe gibi teknikler kullanarak tek tek okudu. Bireysel kanal tipleri, heterolog ifade sistemleri sıklıkla kullanılır incelemek için 1 2 kardiyomiyositler gibi dokusundan izole edilen hücreler , çalışırken başka yollarla çeşitli iyon kanalları engellemek için kullanılması gerekir. Örneğin, sodyum kanalları yavaş bir depolarizan gerilim rampası inaktive olabilir, 3 içe giderilmesi potasyum kanalları ekstrasellüler BaCl2 ile bloke edilebilir, 4 ve kalsiyum kanalları verapamil kullanılarak bloke edilebilir. 5
Kısmen bu sınırlama üstesinden kullanılan bir yöntem, ölçüm uygun bir ajan ile seçici bir kanal tipi engelleme sonra tekrar, aynı anda iki kanal türleri arasında mevcut akı ölçmek. Iki ölçüm Çıkarma sonra bloke edildi kanal tipi mevcut atfedilebilir miktarını tahmin etmek için kullanılır. 6 Bununla birlikte, bu tekniğin iki önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, kimyasal maddeler, seçici olarak her bir iyon kanalı engelleyebilirsiniz belirlenmiştir ve yaygın olarak kullanılan bazı ilaçlar, diğer kanal tipleri ile non-spesifik etkileşimlere sahip değil 5,7 İkincisi, bu tekniğin bir kanal başka bir modüle olup olmadığını belirlenecek olamaz kanal. Örneğin, sağ ventrikül yüksek Kır 2.1 ifade iletim hızı deprese böyle NAV 1.5 ve Kır 2.1 heterojen ifade kobay ventriküller gösterildiği olmuştur ve bu iki kanal arasında sinerjik bir ilişki var olduğu ileri sürülmektedir. Halen 8 , bu doğrulanmış olamaz.
Bu çalışmada, biz bu empedans spektroskopi, eş zamanlı olarak ölçülür birden fazla iyon kanalı türleri çalışmak için yararlı bir araç olabileceğini düşündürmektedir. Sunulan yöntem akımları aynı anda iki kanal ölçülen türlerinden ayırt etmek için kullanılan olmamıştı rağmen, empedans spektroskopi iyon kanalı fonksiyonu diğer yönlerini bir dizi çalışma olmuştur. Goodman ve Sanat akım pensi protokolleri bir hücre farklı frekanslara ayarlamak için modifiye ve transmembran potansiyel salınımlar içe giderilmesi K + kanal ve Ca 2 + kanal arasında bir etkileşim nedeniyle olabilir ki kaplumbağa işitsel saç hücreleri kullanarak gösterdi. 9 Han ve Frazier empedans geniş bir frekans aralığında (100 Hz - 5 MHz) üzerinden tek bir hücrenin ölçülebilir gösterdi ve K + veya Ca 2 + kanalları bloke edildi basit bir araç olabilir empedans artış gözlenmiştir yüksek kapasiteli ilaç ekranlarında kanal blok tespit 10 Hayashi ve Fishman içe giderilmesi K + kanal 11 Diğer gruplar farklı kanal türleri gerilim kelepçe protokol tek bir frekans yerleştirilir ve kinetik özelliklerini incelemek için karmaşık iletkenlik gösterdi bazı frekanslarda değil, diğerleri için beklenen yanıt gözlenen frekans tepkisi ile anlaştı. 12,13 Millonas ve Hanck bazı frekanslar beklenen yanıt Markov modeli birden fazla hız sabitleri varlığı vermedi nedenle önerilen bu gibi 12 Çalışmaları diğerleri gibi, hem iyonik akımlar empedans spektroskopi kullanarak, iyon kanalları ölçülen teorik frekans tepkisi ile aynı fikirde değilim durumlarda olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada yöntemin amacı bağımsız membran elektrik devresi dayandığı varsayımları geçerli genliği ile korele frekanslarını tespit etmek çünkü bu çalışmada bir endişe değil. Furtheremore geçerli genliği, onları içine takılan herhangi bir gürültü işlevleri olmayan kayıtları bölümlerini hesaplanır. Diğer çalışmaların sayısı da çok sayıda iyon kanalları mevcut modeller kendi hız sabitleri ile çok sayıda iletken ve tel olmayan devletlerin sergileyen 14,15,16 Thompson ve ark KcsA kanal seçiciliği filtresi Na için farklı bağlanma yerleri olduğunu gösterdi +, Li +, ve K +, ve seçicilik filtresi ile bir iyon hamle olarak başka bir bağlayıcı sitesi hareketli enerjik maliyetleri kanal tercihen, gözenek ile K + iyonları yürütmek kılan ne.. 17 Bu çalışmada biz bir dizi takılı bir gerilim adım protokol frekansları (gürültü fonksiyonu) ve genliği çok genel geçerli genliği ile korele frekanslar için baktı. Güçlü kanıtlar öne sunulan bu yana birden fazla hız sabitleri, ayırıcı yoluyla iyonların iletim bir rol oynayabilirt kanalları, bu oran sabitleri ile ilişkili frekansları giriş belirli frekanslarda rezonansa ya da son derece geçerli genliği, aksi halde olmazdı ile korele neden olabilir. Bu çalışmada gösterilmiştir tekniği, genellikle gerilim kelepçe devresi ve satın alma ekipmanları test etmek için kullanılan bir paralel RC devresi, bir model hücresi, yapılır. DC dışında herhangi bir frekanslar mevcut büyüklüğü ile ilişkili olacağını ve bu verileri gösterilir. Ayrıca gürültü fonksiyonunun yanı sıra, herhangi bir frekansları son derece geçerli genliği ile korele neden olmadığını göstermektedir. Bu iki bulgu, ölçüm cihazları ve gürültü fonksiyonu, herhangi bir frekanslar geçerli genliği ile ilişkilendirmek için neden kendileri olmadığını gösteriyor, çünkü kritik öneme sahiptir. Gelecekteki çalışmalar iyon kanalları içeren membranlar kullanarak ölçümler yaparken, kullanılan kanal bağlı olarak, seçicilik filtresi ya da muhtemelen gözenek hız sabitleri karşılık frekansları kanal frekans cevabı etkisi ve frekanslar, yüksek hangi etkilemez, bu bekleniyor geçerli genliği ya da düşük korelasyon.
Bu yöntem iyon kanalları çalışmak için yeni bir teknik olduğu için, gelecek çalışmaları takip yönde bir dizi vardır. İlk olarak, teknik belirli izole kanallarının frekans tepkisi karakterize etmek için kullanılmalıdır. Ek iş, aynı zamanda mevcut genlikleri frekans genlikleri kalibre etmek için yapılması gerekiyor. Birden fazla kanal ayrı ayrı karakterize sonra, birden fazla kanal türleri aynı anda ölçülmelidir. Bu teknik, aynı zamanda aksiyon potansiyeli kelepçe, kelepçe akımı, ve alan stimülasyonu çalışmaları kullanmak için adapte olabilir. Bu yeni bir teknik olmasına rağmen, daha önce mümkün değildi elektrofizyolojik ölçümler yapmak ve iyon kanalları fizyolojik rolü içine değerli yeni anlayışlar sağlamak için güçlü bir yol ne olabilir gösterir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Dr. Poelzing verilen Sağlık hibe sayısı R21-HL094828-01 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
References
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties. Neuron. 8, 663-676 (1992).
- Abriel, H. Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel. Circ Res. 88, 740-745 (2001).
- Giles, W. R., Imaizumi, Y. Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells. J Physiol. 405, 123-145 (1988).
- Lee, K. S., Tsien, R. W. Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells. Nature. 302, 790-794 (1983).
- Ozdemir, S. Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block. Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).
- Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels. Circ Res. 84, 989-998 (1999).
- Veeraraghavan, R., Poelzing, S. Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge. Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).
- Goodman, M., Art, J. Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells. Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).
- Han, A., Frazier, A. B. Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy. Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).
- Hayashi, H., Fishman, H. Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane. Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).
- Millonas, M. M., Hanck, D. A. Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating. Biophys. J. 74, 210-229 (1998).
- Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel. Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).
- Sale, H. Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome. Circ Res. 103, 81-95 (2008).
- Blatz, A. L., Magleby, K. L. Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle. J Physiol. 378, 141-174 (1986).
- Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones. The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).
- Thompson, A. N. Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).
