Summary
نحن تصف طريقة جديدة لإجراء النسخ المتماثل الحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة سلسلة (PCR). هو تسخير الحمل الحراري للمكوك الكواشف مستمر بين تغيير طبيعة ، الصلب ، وشروط التمديد من خلال الحفاظ على معارضة السطوح من المفاعل في درجة حرارة ثابتة. هذا التصميم البسيط لجعل الوعود بطبيعتها السريع PCR أكثر سهولة.
Abstract
العديد من المقايسات البيولوجيا الجزيئية تعتمد في بعض الطريق على تفاعل البلمرة سلسلة (PCR) لتضخيم الحمض النووي المستهدف an تمييع البداية عينة لمستوى تركيز اكتشافها. إلا أن تصميم الأجهزة التقليدية thermocycling PCR ، ومقرها في الغالب على كتل ضخمة تسخين حرارة المعدن الذي ينظمه سخانات الحرارية ، يحد بشدة من تحقيق سرعة رد الفعل 1. مطلوب أيضا الطاقة الكهربائية الكبيرة للحرارة بشكل متكرر وتبريد خليط كاشف ، مما يحد من القدرة على نشر هذه الصكوك في شكل المحمولة.
وقد برزت الحراري الحراري كنهج بديل thermocycling الواعدة التي لديها القدرة على التغلب على هذه القيود 2-9. التدفقات هي حدوث الحمل الحراري اليومية في مجموعة متنوعة من الإعدادات التي تتراوح بين الغلاف الجوي للأرض ، والمحيطات ، والداخلية ، والمصابيح الملونة والمزخرفة الحمم. وبدأت حركة السوائل في بنفس الطريقة في كل حالة : عدم استقرار الطفو مدفوعة تنشأ عندما يتعرض يقتصر حجم السائل إلى التدرج في درجة الحرارة المكانية. هذه الظواهر نفسها تقدم وسيلة جذابة لأداء thermocycling PCR. من خلال تطبيق التدرج في درجة الحرارة ثابتة عبر هندسة المفاعل صمم بشكل مناسب ، يمكن إنشاء تدفق الدورة الدموية المستمرة التي ستنقل PCR الكواشف مرارا عبر المناطق حرارة المرتبطة تغيير طبيعة ، الصلب ، ومراحل تمديد التفاعل (الشكل 1). ولذلك يمكن أن يفجرها Thermocycling بطريقة شبه متساوي من خلال عقد ببساطة سطحين معارضة في درجات حرارة ثابتة ، والقضاء تماما على الحاجة لتسخين وتبريد مرارا الصك.
واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه تصميم thermocyclers الحمل الحراري هو الحاجة إلى التحكم بدقة في سرعة التوزيع المكاني ودرجة الحرارة داخل المفاعل لضمان أن تكون الكواشف احتلال المناطق بالتتابع درجة الحرارة الصحيحة لفترة كافية من الوقت 10،11. نحن هنا وصف نتائج الجهود التي نبذلها لتحقيق كامل 3 - D السرعة ودرجة الحرارة في التوزيعات الميكروسكيل thermocyclers الحملية 12. بشكل غير متوقع ، اكتشفنا مجموعة فرعية من مسارات تدفق المعقدة التي تبدو مواتية للغاية لPCR نتيجة لمزيج من التآزر (1) التبادل المستمر بين مسارات تدفق الذي يوفر فرصة لتعزيز الكواشف العينة إلى مجموعة كاملة من التشكيلات درجة الحرارة المثلى ، و ( 2) قضى وقتا في زيادة درجة حرارة المنطقة على تمديد معدل الحد خطوة من PCR. السريع للغاية مرات تضخيم الحمض النووي (تحت 10 دقيقة) قابلة للتحقيق في مفاعلات مصممة لتوليد هذه التدفقات.
Protocol
1. التصميم الأساسي للThermocycler حمل حراري
- وقد شيدت لدينا جهاز بسيط يتكون من thermocycling الحمل الحراري للتبادل "خراطيش" رد فعل من البلاستيك الغرفة التي تقع بين صفائح الألمنيوم اللذين درجات حرارة يتم التحكم فيها بشكل مستقل 7 (الشكل 2).
- هي جزء لا يتجزأ الآبار مفاعل اسطواني بواسطة صفائف بالقطع من الثقوب في كتل البولي ، مع مجموعات مختلفة من القطر الثقب ورقة سمك البلاستيك المستخدمة لتحقيق نسب المطلوب (الطول / القطر = ح / د). تعتبر هندستها مفاعل اثنين مختلفة في النتائج المقدمة هنا : ح / د = 9 : ح = 15.9 ملم ، د = 1.75 مم ، 38،2 حجم ميكرولتر ؛ ح / د = 3 : ح = 6.02 ملم ، د = 1.98 مم ، 18.5 ميكرولتر وحدة التخزين.
- يسخن السطح السفلي من المفاعل باستخدام كتلة الألومنيوم التي تحتوي على سخانات خرطوشة ربطه مع تحكم في درجة الحرارة microprocesser مدفوعة.
- ويتم تنظيم درجة الحرارة على سطح المفاعل العلوي باستخدام كتلة الألومنيوم متصلة إعادة تدوير مياه الاستحمام.
- يشد التجمع بأكمله معا باستخدام المسامير النايلون للحد من التوصيل الحراري بين الكتل المعارضة الألومنيوم.
2. إعداد والتحميل من خليط التفاعل PCR
- نموذجي 100 ميكرولتر خليط التفاعل يحتوي على 10 ميكرولتر من محلول العازلة 10X ، 6 ميكرولتر من 25 ملم MgCl 2 ، 10 ميكرولتر من dNTPs (2 مم لكل منهما) ، 41.2 ميكرولتر من المياه DI ، 10 ميكرولتر من β - أكتين التحقيق ، و 10 ميكرولتر من β أكتين - التمهيدي إلى الأمام ، و 10 ميكرولتر من التمهيدي عكس β - أكتين ، 2 ميكرولتر من الحمض النووي البشري قالب الجينومية (10 نانوغرام / ميكرولتر) و 0.8 ميكرولتر من الحمض النووي بوليميريز KOD (2.5 وحدة / ميكرولتر).
- قبل تحميل الكواشف ، وختم السطح السفلي من الغرفة PCR باستخدام ورقة رقيقة من الألومنيوم الشريط.
- شطف الآبار مفاعل بمحلول 10 ملغ / مل من الزلال مائي المصل البقري تليها أمطار - X مكافحة الضباب.
- الكواشف ماصة في آبار المفاعل باستخدام ماصة نصائح طويلة الجل التحميل وختم الشريط مع السطح العلوي تفلون FEP.
3. تشغيل الرد في Thermocycler حمل حراري
- قبل البدء في رد الفعل ، وكتل الألومنيوم على حد سواء لتسخين درجات الحرارة المرغوبة السطح العلوي والسفلي.
- شطيرة المفاعل بلاستيكية محملة PCR الكواشف بين الكتل التدفئة الألمنيوم ، ومشبك بسرعة التجمع معا باستخدام المسامير النايلون.
- بعد رد الفعل قد شرع في الوقت المطلوب ، وإيقاف سخانات ومكان خفض (الساخنة) سطح الجهاز على رأس كتلة معدنية مبردة لتبرد بسرعة وأنه وقف تدفق الحمل الحراري.
- إزالة مفاعل البلاستيك والمنتجات ماصة للخروج من الآبار (باستخدام تحميل طويلة الجل نصائح) لتحليلها لاحقا.
4. تحليل أداء جل الكهربائي
- إعداد 2 ٪ بالوزن agarose هلام عن طريق تسخين 10 غراما من agarose مع 500 مل من 1X العازلة على صفيحة ساخنة التحريك حتى يصبح الحل واضح.
- تحميل agarose هلام في درج الصب وإدراج المشط. السماح لمجموعة هلام 30 دقيقة ~.
- إزالة المشط وإضافة 1X TAE العازلة حتى غمرت الجل.
- Fluorescently تحتوي على عينات من الحمض النووي الملون 2 ميكرولتر 100X SYBR الحل الأول الخضراء ، 2 ميكرولتر عينة من الحمض النووي ، 2 ميكرولتر تحميل صبغ برتقالي 6X ، و 4 العازلة تاي ميكرولتر.
- إضافة إلى عينات من الحمض النووي لتشغيل الآبار والانفصال في 60 V لل1 ساعة مع الحمض النووي غليان 100 علامة التحجيم سلم.
- إزالة صورة هلام وتحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للحصول على النتيجة.
5. ممثل النتائج :
التصميم الأمثل للthermocyclers الحمل الحراري ينطوي على اختيار هندسة المفاعل الصحيح من شأنها أن تولد تدفق الدورة الدموية قادرة على نقل الحرارة من خلال الكواشف الرئيسية المشاركة في عملية الاسترداد. معلمات الهندسية التي يمكن أن تختلف في المفاعلات اسطوانية نظر هنا هي ارتفاع (ح) وقطر (د) أو مكافئ نسبة الارتفاع (ح / د). لقد اكتشفنا حقول تدفق 3 - D الحمل الحراري داخل المفاعلات PCR على مجموعة من نسب مختلفة باستخدام ديناميات السوائل الحسابية (CFD) ، ووجد أن الأنماط المعقدة بشكل غير متوقع يمكن أن تنشأ. الأهم من ذلك ، فقد كشف تحليل لدينا مجموعة فرعية من هذه المجالات المعقدة التي تتدفق بشكل ملحوظ تسريع رد فعل 12.
يمكن أن تكون هذه التأثيرات الهندسية اليها بوضوح من خلال المقارنة بين حقول التدفق في المفاعلات النووية في الجانب نسب العالية والمنخفضة. في حالة ارتفاع نسبة الجانب (ح / د = 9 ؛ طويل القامة ، نحيل أسطوانات) ، هي عناصر advected السوائل على طول مسارات تتبع المسارات التي هي خارج مقفلين الحلقات ، وأنها تخوض في لمتابعة مسارات نفسه لفترات طويلة من الوقت (3A الشكل). وبالتالي ، هناك فرصة ضئيلة للتبادل بين وانخفاض المسارات التي تعرض الكواشف للتسلسل الذي الأمثل لظروف حرارية لPCR (تتأرجح بين الصلب وتغيير طبيعة المتطرفة على السطوح المفاعل العلوي والسفلي) وفرقة أكبر بكثير من المسارات المتبقية التي لا تساهم في تضخيم (مترجم أقرب إلى مركز للمفاعل).
مجال تدفق يختلف كثيرا في الجانب نسبة أصغر (ح / د = 3 ؛ أقصر وأوسع أسطوانات) ، لتصبح أكثر فوضوية بمعنى أن مسارات العنصر السائل لم تعد تتبع مسارات مغلقة (الشكل 3B). وبالتالي ، على الرغم من تعرض الكواشف إلى درجة الحرارة ملف أكثر تعقيدا ، وعناصر السائل قادرا على استكشاف طائفة أوسع بكثير من المسارات بحيث أن أكثر من حجم كاشف له الفرصة لتجربة التشكيلات الحراري الأمثل. هذه النتائج تشير إلى أنه في حين أن counterintuitively مسارات تدفق الفردية في ح / د = 9 قد يبدو أكثر ملاءمة لمحات عن طريق انتاج PCR درجة الحرارة التي "تبدو" مماثلة لتلك المستخدمة في thermocycler التقليدية ، والطبيعة الفوضوية للتدفق في مجال ح / د = 3 تسيطر في النهاية على نطاق عالمي من خلال تعزيز التبادل المعزز الكواشف بحيث لا تصبح المحاصرين في مسارات غير المواتية لفترة طويلة جدا.
لاختبار هذه الفرضية وتحديد هندسة المفاعل كان أكثر ملاءمة للPCR ، استخدمنا كل منهما لتنفيذ النسخ المتماثل PCR من 295 هدفا غليان الجينات المرتبطة β - أكتين من قالب الحمض النووي الجينوم البشري. بشكل ملحوظ ، حققنا بشكل روتيني التضخيم للمنتج الهدف الصحيح في 10 دقيقة فقط في ح / د = 3 (الشكل 4A) ، في حين لوحظت نفس رد الفعل المطلوب على الأقل 20 دقيقة قبل اكتشافها في المنتجات ح / د = 9 (الشكل 4B) . خصوصية رد فعل هو أيضا أكبر بكثير في ح / د = 3 ، حيث يتم الحصول على منتج PCR واحدة ، بينما يتم إنشاؤها منتجات متعددة في وقت غير محدد ح / د = 9 حيث الفخاخ مجال تدفق السوائل في مسارات العناصر الحرارية السلبية لفترات طويلة من الزمن.
الشكل 1. تمسك الحمل الحراري في غرفة اسطوانية الشكل الذي الأسطح العلوية والسفلية في درجات حرارة ثابتة مختلفة. إذا كانت درجة الحرارة على السطح السفلي هو أعلى مما كانت عليه في الجزء العلوي ، وإنشاء معامل الكثافة الرأسي داخل السائل المغلقة التي هي قادرة على توليد نمط تدفق الدورة الدموية. مع الاختيار الصحيح لمعلمات الهندسية (الارتفاع وح د القطر) ، يمكن تسخير هذا المجال لتحفيز تدفق الحمل الحراري PCR thermocycling عند manintained الأسطح العلوية والسفلية بالقرب من الصلب وتغيير طبيعة درجات الحرارة ، على التوالي (خطورة الأفعال الهبوط عموديا).
الشكل 2 (أ) المكونات الرئيسية لتدفق PCR thermocyler الحمل الحراري. خرطوشة المفاعل يتكون من كتلة البولي يحتوي على مجموعة من غرف أسطوانية. وتأتي كتلة بين الصفيحة العلوية صممت لتكون متصلا حمام مائي تعميم وإدماج أسفل لوحة سخانات المضمنة. (ب) يتم تحميل PCR الكواشف ومختومة داخل المفاعل خرطوشة ، وبعد ذلك يتم تجميع الجهاز لتنفيذ رد فعل. عند الانتهاء ، يمكن procucts pipetted بسهولة لتحليلها لاحقا.
الشكل 3. المحاكاة الحاسوبية من 3 - D حقول تدفق الحمل الحراري المتولدة داخل مفاعلات أسطوانية مع درجات حرارة تتراوح بين 53 و 96 درجة مئوية المفروضة على الأسطح العلوية والسفلية ، على التوالي. وتظهر النتائج على نسب من (أ) ح / د = 9 (38.2 حجم المفاعل ميكرولتر) و (ب) ح / د = 3 (18.5 حجم المفاعل ميكرولتر). ويرد مسار ممثل تليها عنصر السائل السفر من خلال حقل تدفق 3D على يسار جنبا إلى جنب مع توقعات العرض من أعلى ، وجانب من الطريق ، ويظهر المؤامرة المقابلة لدرجات الحرارة مقابل الزمنية التالية عنصرا السوائل في اليمين. ملف الحرارية في 9 = ح / د تبدو قريبة لتلك التي من thermocycler التقليدية ، ولكن الفوضى في مجال تدفق 3 = ح / د هو أكثر ملاءمة للcounterintuitively PCR.
الشكل 4. نتائج تكرار الحمض النووي التي تم الحصول عليها في هندستها المفاعل هو مبين في الشكل 3 (العلوي والسفلي والحفاظ على السطوح في 53 و 96 درجة مئوية ، على التوالي). (أ) تسارع بشكل كبير في PCR 3 = ح / د ، كما يتضح من منتجات مرئية قوية بعد 10 دقيقة فقط من زمن التفاعل (M : 100 شركة بريتيش بتروليوم وسلم ، والممرات 1-4 : المنتجات من ردود فعل موازية في 4 غرف أسطوانية مختلفة). (ب ح / د يتطلب على الأقل 20 دقيقة قبل أن يتم وحظ منتجات مرئية ، وشرائح متعددة واضحة تشير إلى النسخ المتماثل من الحمض النووي المستهدف غير محددة بالإضافة إلى المنتج المطلوب (M : 100 شركة بريتيش بتروليوم وسلم ، الممرات 1-2 : المنتجات من ردود فعل موازية في غرف 2 اسطوانية مختلفة).
Discussion
لا يمكن للتفاعل بين التدفق والتفاعل الكيميائي تتغير بشكل كبير تحت تأثير التأفق الفوضى. لكن هذه الدول تدفق المعقدة تشكل تحديا للدراسة ، ولا سيما في هندستها واقعية حيث الآثار 3D تصبح مهمة. رايليغ - بينارد الحراري في ح / د> 1 ليس فقط يوفر منصة ملائمة لاستكشاف هذه الظواهر ، وتطبيقها لتنفيذ PCR كما يمكن اقتران بين التفاعلات الكيميائية وتدفق للبحث. هذه القدرة الفريدة تجعل من الممكن لتحديد الدول التدفق الأمثل حيث الفوضى آثار الفعل (counterintuitively) لتسريع وتيرة تكرار الحمض النووي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر بامتنان T. Ragucci ، واتكينز B. ، S. ونغ ، وباء في Wallek Lynntech ، وشركة للحصول على المساعدة الفنية ومناقشات مفيدة كثيرة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (NSF) في إطار منحة CBET - 0933688.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | |
| Aluminum tape | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | ||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
References
- Spitzack, K. D., Ugaz, V. M. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. Methods in Molecular Biology. Minteer, S. D. , Humana Press. Vol. 321 (2005).
- Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell. Science. 298, 793-793 (2002).
- Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. Exponential DNA replication by laminar convection. Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).
- Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling. Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).
- Wheeler, E. K. Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler. Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).
- Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems. Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).
- Ugaz, V. M., Krishnan, M. Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling. Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).
- Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system. Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).
- Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model. Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).
- Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. Coupled flow and reaction during natural convection PCR. Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).
- Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring. , Forthcoming (2010).
