Summary
Wir beschreiben eine neuartige Methode zur DNA-Replikation über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchführen. Thermische Konvektion ist die kontinuierliche Shuttle Reagenzien zwischen Denaturierung, Annealing und Extension Bedingungen durch die Aufrechterhaltung gegenüberliegenden Oberflächen des Reaktors bei konstanter Temperatur genutzt. Dieses an sich einfache Design verspricht, um eine schnelle PCR mehr zugänglich.
Abstract
Viele molekularbiologische Tests hängen in irgendeiner Weise auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um eine zunächst verdünnt Ziel-DNA-Probe, um eine nachweisbare Konzentration zu verstärken. Aber auch das Design der konventionellen PCR Thermocycling Hardware, vor allem auf massive Metall Heizblöcke, deren Temperatur durch thermoelektrische Heizungen geregelt, schränkt die erreichbare Reaktionsgeschwindigkeit 1. Erhebliche elektrische Energie wird auch benötigt, um wieder heizen und kühlen die Reagenz-Mischung, mit denen die Fähigkeit, diese Instrumente in ein portables Format bereitgestellt werden.
Thermische Konvektion ist als eine vielversprechende Alternative Thermocycling Ansatz, der das Potenzial, diese Einschränkungen zu überwinden 2-9 entstanden. Konvektive Strömungen sind an der Tagesordnung in eine Vielfalt von Einstellungen von der Erdatmosphäre, die Ozeane, und Interieur, dekorative und bunte Lavalampen. Fluid-Bewegung ist in der gleichen Weise in jedem Fall eingeleitet: einen Auftrieb getrieben Instabilität entsteht, wenn eine beschränkte Volumen der Flüssigkeit, um eine räumliche Temperaturgradienten ausgesetzt ist. Die gleichen Phänomene bieten eine attraktive Möglichkeit, PCR Thermocycling durchzuführen. Durch Anlegen eines statischen Temperaturgradient über eine entsprechend ausgebildete Reaktorgeometrie, kann eine kontinuierliche Zirkulationsströmung festgestellt, dass wird wiederholt Transport PCR Reagenzien durch Temperaturzonen mit der Denaturierung, Annealing und Ausbaustufen der Reaktion (Abbildung 1) in Verbindung gebracht werden. Thermocycling kann daher in einer pseudo-isotherme Weise durch einfaches hält zwei gegenüberliegenden Flächen zu festen Temperaturen betätigt werden, vollständig entfällt die Notwendigkeit, immer wieder heizen und kühlen das Gerät.
Eine der größten Herausforderungen für Design konvektiven Thermocycler ist die Notwendigkeit zur präzisen Steuerung der räumlichen Geschwindigkeits-und Temperaturverteilung innerhalb des Reaktors zu gewährleisten, dass die Reagenzien nacheinander besetzen die richtigen Temperaturzonen für einen ausreichenden Zeitraum 10,11. Hier beschreiben wir Ergebnisse unserer Bemühungen um die volle 3-D Geschwindigkeit und Temperatur-Verteilungen in mikroskaligen konvektiven Thermocycler 12-Sonde. Unerwarteterweise haben wir eine Teilmenge der komplexen Strömungstrajektorien, die sehr günstig sind für die PCR durch eine synergistische Kombination von (1) kontinuierlicher Austausch zwischen Fließwege, dass eine erweiterte Möglichkeit bietet für Reagenzien das gesamte Spektrum der optimalen Temperatur-Profile Probe zu entdecken, und ( 2) erhöhten Zeitaufwand in der Verlängerung Temperaturzone der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der PCR. Extrem schnelle DNA-Vervielfältigung Zeiten (unter 10 min) sind erreichbar in Reaktoren entwickelt, um diese Ströme zu erzeugen.
Protocol
1. Basic Design der Convective Thermocycler
- Wir haben eine einfache konvektive Thermocycling Gerät, bestehend aus auswechselbaren Kunststoff Reaktionskammer "Patronen", die zwischen zwei Aluminiumplatten, deren Temperaturen unabhängig 7 gesteuert (Abbildung 2) eingeklemmt aufgebaut sind.
- Zylindrischen Reaktor Brunnen sind durch Bearbeitung Arrays von Löchern in Polycarbonat-Blöcke, mit verschiedenen Kombinationen von Durchmesser und Kunststoff Blechdicke eingesetzt, um die gewünschte Seitenverhältnis (Höhe / Durchmesser = h / d) zu erreichen eingebettet. Zwei verschiedene Reaktor Geometrien sind in der hier vorgestellten Ergebnisse betrachtet: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 ul-Volumen; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 ul Volumen.
- Die untere Fläche des Reaktors erhitzt wird mit einem Aluminium-Block mit Heizpatronen Schnittstelle mit einer Mikroprozessorsteuerung angetrieben Temperaturregler.
- Die Temperatur an der Reaktor-Oberfläche reguliert wird mit einem Aluminium-Block verbunden mit einem umlaufenden Wasserbad.
- Der gesamte Aufbau wird zusammen mit Nylon-Schrauben, um die Wärmeleitung zwischen den gegnerischen Blöcken Aluminium Grenze geklemmt.
2. Vorbereitung und Laden des PCR-Reaktionsgemisches
- Eine typische 100 ul Reaktionsgemisch enthält 10 uL 10x Puffer, 6 &mgr; l 25 mM MgCl 2, 10 ul dNTPs (2 mM), 41,2 ul VE-Wasser, 10 l β-Aktin-Sonde, 10 l β -Aktin Vorwärtsprimer, 10 l β-Aktin-Reverse-Primer, 2 ul der humanen genomischen DNA-Template (10 ng / mL) und 0,8 ul der KOD-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten / ul).
- Vor dem Einlegen der Reagenzien, Dichtung der unteren Fläche der PCR-Kammer mit einer dünnen Aluminiumfolie.
- Spülen Sie den Reaktor Brunnen mit einer 10 mg / mL wässrige Lösung von Rinderserumalbumin durch Regen-X Anti-Fog gefolgt.
- Pipette Reagenzien in den Reaktor Brunnen mit langen Gel-loading Pipettenspitzen und Abdichtung der Oberfläche mit FEP Teflon tape.
3. Ausführen der Reaktion in der Convective Thermocycler
- Vor Beginn der Reaktion, Vorwärmen sowohl Aluminium-Blöcken, um die gewünschte Ober-und Unterseite Temperaturen.
- Sandwich der Kunststoff-Reaktor mit PCR-Reagenzien zwischen den Aluminium Heizblöcke geladen, schnell und klemmen die Montage zusammen mit Nylon-Schrauben.
- Nach der Reaktion für die gewünschte Zeit fortgeschritten ist, schalten Sie die Heizung und setzen Sie den unteren (hot) Oberfläche des Gerätes auf einem gekühlten Metallblock schnell abkühlen und stoppen Sie die konvektive Strömung.
- Entfernen Sie die Kunststoff-Reaktor und Pipette die Produkte aus dem Brunnen (mit dem langen Gelbeladung Tipps) für die spätere Analyse.
4. Performing-Gel-Elektrophorese-Analyse
- Bereiten Sie eine 2 Gew.% Agarosegel durch Erhitzen von 10 g Agarose mit 500 ml 1x Puffer auf einer Heizplatte unter Rühren, bis die Lösung klar wird.
- Laden Sie das Agarosegel in die Gelträger und den Kamm einsetzen. Lassen Sie das Gel-Set für ~ 30 min.
- Entfernen Sie den Kamm und fügen 1x TAE-Puffer, bis das Gel getaucht.
- Fluoreszierend gefärbten DNA-Proben enthalten 2 ul 100x SYBR Green I-Lösung, 2 ul DNA-Probe, 2 ul 6x orange Loading Dye und 4 ul TAE-Puffer.
- Fügen Sie die DNA-Proben in die Vertiefungen und führen Sie die Trennung bei 60 V für 1 h mit einer 100 bp DNA-Leiter Sizing-Marker.
- Entfernen Sie das Gel, es fotografieren und unter UV-Licht, um das Ergebnis zu erhalten.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Optimale Gestaltung der konvektiven Thermocycler beinhaltet die Auswahl der richtigen Reaktorgeometrie, dass eine Zirkulationsströmung transportieren kann Reagenzien durch die wichtigsten Temperaturen in den PCR-Prozess beteiligten generieren wird. Die geometrischen Parameter, die in den zylindrischen Reaktoren als hier variiert werden kann, sind die Höhe (h) und Durchmesser (d), oder äquivalent das Seitenverhältnis (h / d). Wir haben die 3-D Strömungsfelder in konvektiven PCR Reaktoren über eine Reihe von verschiedenen Bildformaten mit Computational Fluid Dynamics (CFD) untersucht und festgestellt, dass unerwartet komplexe Muster entstehen können. Noch wichtiger ist, hat unsere Analyse eine Teilmenge dieser komplexen Strömungsfelder, die erheblich beschleunigen die Reaktion 12 aufgedeckt.
Diese geometrischen Auswirkungen können eindeutig durch einen Vergleich der Strömungsfelder in Reaktoren bei hohen und niedrigen Seitenverhältnisse zu sehen. In den hohen Seitenverhältnis Fall (h / d = 9; ein großer, magerer Zylinder), sind fließend Elemente entlang Trajektorien Tracing-Pfade, die im Wesentlichen Schleifen geschlossen advehiert, und sie sind locked-in, um die gleichen Wege für lange Zeiträume verfolgen Zeit (Abbildung 3a). Folglich gibt es wenig Gelegenheit für den Austausch zwischen fniedrigen Flugbahnen, die Reagenzien aussetzen, um die optimale Abfolge der thermischen Bedingungen für die PCR (oszillierend zwischen den Glüh-und Denaturierung Extremen am Reaktor der Ober-und Unterseite) und der viel größeren Ensemble von restlichen Bahnen, die nicht zu einer Verstärkung beitragen (näher an der Mitte lokalisierten des Reaktors).
Das Strömungsfeld ist ganz anders in einem kleineren Bildformat (h / d = 3; einen kürzeren, breiteren Zylinder), immer chaotisch in dem Sinne, dass das flüssige Element Bahnen nicht mehr folgen geschlossene Pfade (Abbildung 3b). So, obwohl Reagenzien zu einem komplexeren Temperaturprofil ausgesetzt sind, sind fließend Elemente in der Lage, eine viel breitere Palette von Trajektorien zu erkunden, so dass mehrere der Reagenzvolumen hat eine Chance, um eine optimale thermische Profile Erfahrung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass counterintuitively während einzelne Strömungstrajektorien bei h / d = 9 zu sein scheint günstiger für die PCR durch die Produktion Temperaturprofile, "Look" ähnlich wie in einem herkömmlichen Thermocycler, die chaotische Natur des Strömungsfeldes bei h / Arbeitnehmer d = 3 letztlich dominiert auf globaler Ebene durch die Förderung verstärkter Austausch, so dass Reagenzien nicht eingeklemmt werden in ungünstigen Trajektorien für sehr lange.
Um diese Hypothese zu prüfen und festzustellen, welche Reaktorgeometrie günstiger für die PCR war, haben wir beide zu PCR-Replikation von einem 295 bp Ziel mit der β-Aktin-Gen aus einer humanen genomischen DNA-Template zugeordnet wird. Bemerkenswert ist, dass wir routinemäßig erreicht Verstärkung der richtigen Ziel-Produkt in nur 10 min bei h / d = 3 (Abbildung 4a), während die gleiche Reaktion benötigt mindestens 20 min vor nachweisbare Produkte h / d beobachtet = 9 (Abbildung 4b) . Die Reaktion Spezifität ist auch viel größer bei h / d = 3, wo ein einziges PCR-Produkt erhalten wird, während mehrere unspezifische Produkte zu h erzeugt / d = 9, wo das Strömungsfeld Fallen Fluidelemente in ungünstigen thermischen Trajektorien für längere Zeit.
Abbildung 1. Thermische Konvektion in einer zylindrischen Kammer, deren Ober-und Unterseite befinden sich in verschiedenen festen Temperaturen gehalten. Wenn die Temperatur an der Unterseite höher ist als an der Spitze, ist eine vertikale Dichtegradienten innerhalb des eingeschlossenen Flüssigkeit, geeignet zur Erzeugung einer Zirkulationsströmung Muster ist etabliert. Mit der richtigen Wahl der geometrischen Parameter (Höhe h und Durchmesser d), kann die Konvektionsströmung Bereich genutzt werden, um PCR Thermocycling betätigen, wenn die Ober-und Unterseite in der Nähe Glüh-und Denaturierung Temperaturen, bzw. (Schwerkraft wirkt senkrecht nach unten) sind manintained werden.
Abbildung 2. (A) Die wichtigsten Komponenten einer Konvektionsströmung PCR Thermocyclers. Ein Reaktor Kartusche besteht aus einem Polycarbonat-Block mit einer Reihe von zylindrischen Kammern. Der Block wird zwischen einer oberen Platte zur Verbindung mit einem zirkulierenden Wasserbad und einer Bodenplatte Einbeziehung embedded Heizungen angeschlossen werden eingeklemmt. (B) Die PCR-Reagenzien beladen und versiegelt im Inneren des Reaktors Patrone, nach der das Gerät montiert wird, um die Reaktion durchzuführen. Nach der Fertigstellung können die procucts leicht pipettiert werden aus für die spätere Analyse.
Abbildung 3. Computersimulationen von 3-D Konvektionsströmung Felder in zylindrischen Reaktoren mit Temperaturen von 53 und 96 ° C erzeugt an der Ober-und Unterseite verhängt, jeweils. Die Ergebnisse werden auf Seitenverhältnisse von (a) gezeigt h / d = 9 (38,2 ul Reaktorvolumen) und (b) h / d = 3 (18,5 ul Reaktorvolumen). Eine repräsentative Trajektorie durch eine flüssige Element Reise durch die 3D-Strömungsfeld gefolgt ist gezeigt, die zusammen mit Ober-und Seitenansicht Projektionen der Weg nach links, die entsprechende Kurve der Temperatur-Zeit-im Anschluss an eine flüssige Element ist an der rechten Seite angezeigt. Die thermische Profil bei h / d = 9 erscheint nahe dem eines herkömmlichen Thermocycler, aber die chaotischen Feld h / d = 3 ist counterintuitively günstiger für PCR.
Abbildung 4. DNA-Replikation Ergebnisse in den Reaktor Geometrien in Abbildung 3 (Ober-und Unterseite wurden bei 53 und 96 ° C gehalten, bzw.) gezeigt erhalten. (A) PCR ist sehr besorgt h / d = 3 beschleunigt, da offensichtlich durch starke Produkte sichtbar nach nur 10 min Reaktionszeit (M: 100 bp Leiter, Spuren 1-4: Produkte aus Reaktionen parallel in 4 verschiedenen zylindrischen Kammern). (B h / d = 9 durchgeführt benötigt mindestens 20 min vor dem sichtbaren Produkten beobachtet werden, und mehrere Bänder sind offensichtlich zeigt die Replikation von nicht-spezifische Ziel-DNA neben dem gewünschten Produkt (M: 100 bp Leiter, Spuren 1-2: Produkte aus Reaktionen parallel in 2 verschiedenen zylindrischen Kammern).
Discussion
Das Wechselspiel zwischen Fluss und chemische Reaktion kann dramatisch verändern unter dem Einfluss der chaotischen Advektion. Aber diese komplexen Strömungs-Staaten sind schwierig zu untersuchen, insbesondere in realistischen Geometrien, wo 3D-Effekte wichtig werden. Rayleigh-Benard-Konvektion in h / d> 1 bietet nicht nur eine bequeme Plattform, um diese Phänomene zu erforschen, deren Anwendung auf PCR durchführen ermöglicht auch die Kopplung zwischen Strömung und chemischen Reaktionen untersucht werden. Diese einzigartige Fähigkeit macht es möglich, optimale Strömung Staaten, in denen chaotische Effekte handeln (counterintuitively) die Rate der DNA-Replikation zu beschleunigen, um zu wählen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken danken T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, und B. Wallek an Lynntech, Inc. für die technische Unterstützung und viele hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der US National Science Foundation (NSF) unter dem Förderkennzeichen CBET-0933688 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | |
| Aluminum tape | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | ||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
References
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