Summary
Biz, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile DNA replikasyonu gerçekleştirmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Termal konveksiyon sabit sıcaklıkta reaktör yüzeyler karşı koruyarak, denatüre, tavlama ve kullandırım koşullarının arasında sürekli mekik reaktifleri koşulmuştur. Bu doğal olarak basit tasarımı, hızlı PCR daha erişilebilir hale getirmek için vaat ediyor.
Abstract
Birçok moleküler biyoloji deneyleri, başlangıçta seyreltik bir hedef DNA saptanabilir bir konsantrasyon seviyesini yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir şekilde bağlıdır. Ancak geleneksel PCR thermocycling donanım tasarımı, ağırlıklı olarak, sıcaklık termoelektrik ısıtıcılar tarafından düzenlenir ciddi ulaşılabilir reaksiyon hızı 1 sınırlar büyük metal ısıtma blokları dayanmaktadır . Önemli ölçüde elektrik gücü, aynı zamanda taşınabilir bir formatta bu araçları dağıtmak için yeteneğini sınırlayan reaktif karışımı tekrar tekrar ısıtmak ve soğutmak için gereklidir.
Termal konveksiyon bu sınırlamaları aşmak için 2-9 potansiyeline sahiptir, gelecek vaat eden bir alternatif thermocycling bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır . Konvektif akımları Dünya'nın atmosfer, okyanuslar, ve iç, dekoratif ve renkli lav lambaları arasında değişen ayarları çeşitli bir dizi gündelik bir olay. Akışkan hareket her iki durumda da aynı şekilde başlatılır: kaldırma kuvveti tahrikli bir istikrarsızlık, sınırlı bir sıvı hacmi mekansal bir sıcaklık gradyanı maruz kaldığında ortaya çıkar. Bu aynı olgunun PCR thermocycling gerçekleştirmek için çekici bir biçimde sunuyoruz. Uygun olarak tasarlanan bir reaktörde, geometri boyunca statik bir sıcaklık gradyanı uygulayarak, sürekli bir dolaşım akışı, denatüre tavlama ve reaksiyon (Şekil 1) uzantısı aşamaları ile ilgili sıcaklık bölgeleri boyunca tekrar tekrar PCR taşıyacak kurulabilir. Thermocycling nedenle cihazın tekrar tekrar ısıtmak ve soğutmak için tamamen ihtiyacını ortadan kaldırarak, sadece sabit sıcaklıklarda iki karşıt yüzey tutarak bir pseudo-izotermal şekilde harekete olabilir.
Konvektif thermocyclers tasarımı karşı karşıya kaldığı temel güçlüklerden biri, tam reaktifler sırayla 10,11 zaman yeterli bir süre için doğru sıcaklık bölgeleri işgal sağlamak için reaktör içinde mekansal hız ve sıcaklık dağılımları kontrol etmek için ihtiyaç vardır . Burada tam 3-D hız ve sıcaklık dağılımları microscale konvektif thermocyclers 12 prob çabalarımız sonuçlarını açıklar. Beklenmedik bir şekilde, karmaşık akış yörüngeleri reaktifler optimum sıcaklık profillerinin tam kapsamlı örnek için geliştirilmiş bir fırsat sağladığı akış yolları arasında (1) sürekli döviz sinerjik bir kombinasyonu nedeniyle PCR için son derece elverişli bir alt kümesi keşfedilen ve ( 2) artan zamanlı PCR adım sınırlayıcı uzantısı sıcaklık bölgesi içindeki oranı geçirdi. Son derece hızlı DNA amplifikasyonu kez (10 dk altında) bu akışları oluşturmak için tasarlanmış reaktörlerde ulaşılabilir.
Protocol
1. Konvektif thermocycler Temel Tasarım
- Biz sıcaklıklarda bağımsız (Şekil 2) 7 kontrol edilir iki alüminyum levhalar arasında sıkışmış değiştirilebilir plastik reaksiyon odasında "kartuşlar" oluşan basit bir konvektif thermocycling cihazı inşa ettik.
- Silindirik reaktör kuyu, delik çapı ve istenilen boy oranları (yükseklik / çap = h / d) elde etmek için kullanılan plastik levha kalınlığı farklı kombinasyonları ile polikarbonat blokları delik işleme dizileri gömülür . İki farklı reaktör geometrileri Burada sunulan sonuçlar dikkate alınır: h / d = 9: h = 15.9 mm, d = 1.75 mm, 38.2 mcL hacim; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1.98 mm, 18,5 mcL hacmi.
- Reaktörün alt yüzeyi microprocesser odaklı bir sıcaklık kontrolörü ile arabirim kartuş ısıtıcıları içeren bir alüminyum blok kullanılarak ısıtılır.
- Reaktörün üst yüzeyinde sıcaklık sirkülasyon su banyosuna bağlı bir alüminyum blok kullanılarak düzenlenir.
- Tüm montaj karşı alüminyum bloklar arasındaki ısı iletkenliği sınırlamak için naylon vidaları kullanarak birlikte kelepçelenir.
2. PCR Reaksiyon karışımı hazırlanması ve yükleme
- 100 mcL tipik bir reaksiyon karışımının 10x tampon çözelti, 25 mM 6 mcL 10 mcL içeren MgCl 2, dNTP 10 mcL (2 mM her), DI su, β-aktin prob mcL 10, 10 mcL β 41.2 mcL -aktin ileri astar, 10 mcL β-aktin ters astar, 2 mcL insan genomik DNA (10 ng / ml) ve KOD DNA polimeraz (2.5 adet / ml) 0.8 mcL.
- Reaktifler yüklemeden önce, ince bir alüminyum bant sayfasını kullanarak PCR odasının alt yüzeyi mühür.
- Yağmur X anti-Fog takip bovine serum albumin, 10 mg / mL sulu çözelti ile reaktör kuyu durulayın.
- Pipet uzun jel yükleme pipet uçları kullanarak reaktör kuyu içine reaktifler ve FEP Teflon bant ile üst yüzeyi mühür.
3. Konvektif PCR Reaksiyon Koşu
- Istenilen alt ve üst yüzey sıcaklıkları reaksiyon, ön ısıtma alüminyum bloklar hem başlamadan önce.
- Sandviç plastik reaktör alüminyum ısıtma blokları arasındaki PCR yüklü ve hızlı bir şekilde naylon cıvatalar ile birlikte montaj kelepçe.
- Sonra reaksiyon istenilen zaman ilerledi, ısıtıcılar kapatın ve hızla soğutulur ve konvektif akışını durdurmak için soğuk bir metal blok üst cihazın alt (sıcak) yüzey yer.
- Plastik reaktör çıkarın ve bir sonraki analiz için kuyulardan (uzun jel yükleme ipuçlarını kullanarak) ürünler pipetle.
4. Jel Elektroforez Analizi yapılması
- Çözüm açık hale gelinceye kadar karıştırarak sıcak bir plaka üzerinde 1x tampon 500 mL 10 g agaroz ısıtma, 2 ağırlıkça% agaroz jel hazırlayın.
- Agaroz jel döküm tepsisine yerleştirin ve tarak eklemek. ~ 30 dakika için jel seti alalım.
- Tarak çıkarın ve jel batık kadar 1x TAE tamponu ekleyin.
- Floresan boyanan DNA örnekleri 2 mcL 100x SYBR Green I çözümü, 2 mcL DNA örneği, 2 mcL 6x Portakal Yükleniyor Boya ve 4 mcL TAE tampon içerir.
- DNA örnekleri kuyuların içine ekleyin ve 1 saat 60 V 100 bp DNA merdiveni boyutlandırma işaretleyici ile ayrılması çalıştırmak.
- Jel çıkarın ve bir sonuç elde etmek için UV ışık altında fotoğraf.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Konvektif thermocyclers optimal tasarım reaktifler PCR sürecinde görev alan kilit sıcaklıklarda yoluyla taşıma kapasitesine sahip bir dolaşım akışı oluşturmak doğru reaktör geometri seçilmesi gerekir. Burada kabul edilen silindirik reaktörlerde çeşitli olabilir geometrik parametreleri yüksekliği (h) ve çapı (d) veya eşdeğeri, en boy oranı (h / d). Biz, içinde bir dizi hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) kullanarak farklı boy oranları üzerinde PCR reaktörler konvektif 3-D akış alanları araştırdı ve beklenmedik bir şekilde karmaşık desenler ortaya çıkabilir bulundu. Daha da önemlisi, bizim analiz ölçüde reaksiyon 12 hızlandırmak bu karmaşık akış alanları bir alt kümesi ortaya çıkardı.
Bu geometrik etkileri açıkça boy oranları yüksek ve düşük reaktörlerde akış alanları karşılaştırarak görülebilir. Yüksek en-boy oranı durumda (h / d = 9; uzun boylu, sıska bir silindir), sıvı elementler aslında döngüler kapalı yollar izleme yörüngeleri boyunca advected, ve uzun süreler için de aynı yolu takip etmek kilitli (Şekil 3a). Sonuç olarak, f arasındaki alışverişi için çok az fırsat varPCR (reaktör üst ve alt yüzeylerinde tavlama ve denatüre uç arasında gidip) ve (merkezine yakın lokalize amplifikasyon katkıda değilsiniz kalan yörüngeleri çok daha büyük bir topluluk için termal koşulları en iyi dizisi reaktiflerin maruz düşük yörüngeleri reaktör).
Akışkan elemanı yörüngeleri artık kapalı yolları (Şekil 3b) izleyin anlamda daha kaotik olma, akış alanının küçük boy oranı (daha kısa, daha geniş bir silindir y / d = 3) çok farklıdır . Böylece, reaktifler daha karmaşık bir sıcaklık profili tabi olsa bile, sıvı elementler reaktif hacmi optimum ısı profilleri deneyimi için bir fırsat daha böylece çok daha geniş bir yörünge keşfetmek mümkün. Bu sonuçlar Sezgilere ise bireysel akış yörüngeleri h / d = 9 sıcaklık profilleri üreten PCR için daha olumlu görünebilir öneririz geleneksel PCR, / saat akış alanının kaotik yapısından istihdam benzer "bakmak" d = 3, sonuçta reaktifleri, çok uzun süre olumsuz yörüngeleri sıkışıp kalmamak için geliştirilmiş alışverişi teşvik ederek küresel ölçekte hakim.
Bu hipotezi test ve reaktör geometri PCR için daha elverişli olduğunu belirlemek için, bir insan genomik DNA şablondan β-aktin gen ile ilişkili 295 bp hedef PCR çoğaltma gerçekleştirmek için her ikisi de kullanılır. Enteresandır ki, biz rutin saatte sadece 10 dakika içinde doğru hedef ürün amplifikasyon elde / d = 3 y / d saptanabilir ürünleri en az 20 dakika önce aynı reaksiyonu gözlendi (Şekil 4a) = 9 (Şekil 4b) . Reaksiyon özgüllüğü de saatte daha büyüktür / d = 3 saat birden fazla nonspesifik ürünler üretilir tek bir PCR ürünü elde edilir / d = 9 akış alanının tuzakları uzun bir süre için olumsuz termal yörüngeleri sıvı unsurları .
Şekil 1. Termal konveksiyon alt ve üst yüzeyleri silindirik bir oda farklı sabit sıcaklıklarda tutulur. Alt yüzeyinde sıcaklık üst kısmında daha yüksek ise, dikey bir yoğunluk gradiyenti dolaşım akış paterni üretme yeteneğine sahip olan kapalı bir sıvı içinde kurulmuştur. Geometrik parametreleri (yüksekliği h ve çapı d) doğru bir seçim ile, konvektif akış alanının üst ve alt yüzeyleri sırasıyla sıcaklık, (yerçekimi dikey olarak aşağı doğru hareket eder) tavlama ve denatüre yakınlarındaki manintained PCR thermocycling harekete geçirmek için harnessed olabilir.
Şekil 2 (a), konvektif bir akış anahtar bileşenleri PCR thermocyler . Bir reaktör kartuşu, silindirik odaları bir dizi içeren bir polikarbonat blok oluşur. Dolaşan su banyosu ve gömülü ısıtıcılar içeren bir alt plaka bağlanmak üzere tasarlanmış bir üst plaka blok arasında sıkışmış. (B) PCR cihazı reaksiyonu gerçekleştirmek monte sonra yüklenir ve reaktör kartuş içinde mühürlü. Tamamlandığında, procucts kolayca sonraki analiz için dışarı pipetlenir olabilir.
Şekil 3 sıcaklıkları 53 ve 96 silindir reaktörler içinde oluşturulan 3-D konvektif akış alanları Hesaplamalı simülasyonları ° C, sırasıyla üst ve alt yüzeylerinde empoze. Sonuçlar, boy oranları gösterilmektedir (a) h / d = 9 (38.2 mcL reaktör hacmi) ve (b) h / d = 3 (18.5 mcL reaktör hacmi). 3D akış alanının yoluyla seyahat eden bir sıvı elemanı tarafından takip edilen temsili yörünge gösterilen yolun-üst ve yan projeksiyonları ile birlikte sol, sağ tarafta bir sıvı eleman aşağıdaki sıcaklık zamana karşılık gelen arsa gösterilir. H / d = 9 termal profili geleneksel PCR yakın görünür, ancak h / d = 3 kaotik akış alanının PCR Sezgilere daha uygundur.
Şekil 4. DNA replikasyonu Şekil 3 (yüzeyler sırasıyla 53 ve 96 ° C'de muhafaza edildi, üst ve alt) gösterilen reaktör geometrileri elde edilen sonuçlar. (A) PCR büyük ölçüde reaksiyon süresi sadece 10 dakika sonra (100 baz puan (bp) merdiveni, şerit 1-4: 4 farklı silindirik odaları paralel reaksiyonlar ürün M) görünür güçlü ürünler olarak ortaya h / d = 3 hızlanır. (B h / d = 9 gerçekleştirilen aynı reaksiyon görülebilir ürünler gözlenmektedir önce en az 20 dakika gerektirir ve birden çok bantlar istenilen ürüne ek olarak non-spesifik hedef DNA açıkça belirten çoğaltma: 100 bp merdiven , şeritleri 1-2: 2 farklı silindirik odaları paralel reaksiyonlar ürünler).
Discussion
Akış ve kimyasal reaksiyon arasındaki etkileşimi kaotik adveksiyon etkisi altında önemli ölçüde değiştirebilir. Ama bu karmaşık akış devletler, özellikle 3D efektleri önemli hale gerçekçi geometrileri, çalışma zorlu. Saat Rayleigh-Benard konveksiyon / d> 1 sadece bu olayları araştırmak için uygun bir platform sağlar, PCR işlemi gerçekleştirmek için uygulama probed olmak akışı ve kimyasal tepkimeler arasındaki kaplin sağlar. Bu benzersiz yeteneği kaotik etkileri hareket (Sezgilere) DNA replikasyon oranı hızlandırmak için en iyi akışı seçmek için mümkün kılar.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz minnetle Lynntech A.Ş., T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, ve B. Wallek teknik yardım ve birçok faydalı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, hibe CBET-0933688 altında ABD Ulusal Bilim Vakfı (NSF) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | |
| Aluminum tape | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | ||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
References
- Spitzack, K. D., Ugaz, V. M. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. Methods in Molecular Biology. Minteer, S. D. , Humana Press. Vol. 321 (2005).
- Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell. Science. 298, 793-793 (2002).
- Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. Exponential DNA replication by laminar convection. Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).
- Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling. Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).
- Wheeler, E. K. Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler. Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).
- Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems. Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).
- Ugaz, V. M., Krishnan, M. Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling. Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).
- Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system. Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).
- Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model. Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).
- Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. Coupled flow and reaction during natural convection PCR. Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).
- Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring. , Forthcoming (2010).
