Summary
Унифицированные electrospun волокна прямой рост нейронов в пробирке и являются потенциальным компонентом леса нерва регенерации. Мы описываем процедуру подготовки electrospun волокна подложки и бессывороточной культуре первичных крысы E15 сенсорные (DRG) и моторных нейронов. Визуализация нейронов иммуноцитохимии также включен.
Abstract
Электропрядения является метод получения микро-к нано-волокон. Волокна могут быть electrospun с разной степенью выравнивания, из сильно выровнены по совершенно случайным. Кроме того, волокна можно прясть из различных материалов, включая биоразлагаемые полимеры, такие как поли-L-молочной кислоты (PLLA). Эти характеристики делают electrospun волокна, пригодные для различных приложений в лесу тканевой инженерии. Мы делаем упор на использование унифицированных electrospun волокон для нерва регенерации. Ранее нами было показано, что выравнивание electrospun PLLA волокна прямой результат как первичного, так сенсорные и моторные нейроны в пробирке. Мы утверждаем, что использование системы первичной культуры клеток имеет важное значение при оценке биоматериалов для моделирования реальных нейронов обнаружены в естественных условиях, насколько это возможно. Здесь мы опишем методы, используемые в нашей лаборатории electrospin волокнистых строительных лесов и культуры спинной эксплантов ганглиев корень, а также диссоциированных сенсорные и моторные нейроны, на строительные леса electrospun. Тем не менее, электропрядения и / или культуры методы, представленные здесь легко адаптированы для использования в других приложениях.
Protocol
1. Поли-L-молочная кислота (PLLA) прядильного раствора
- Растворите 0,4 г PLLA в 9 мл хлороформа при перемешивании на медленном огне.
- Добавьте 1 мл диметилформамида к решению, в результате чего конечная концентрация раствора до 4% PLLA (м / о) в хлороформе: DMF 9:1 (объем / объем).
- Место решения в полипропиленовые или стеклянные шприцы с тупым кончиком 23ga металла.
2. Спиннинг Подготовка основания 1
- Сделать 8% (вес / объем) раствор 85:15 PLGA (поли-молочной-со-гликолевой кислоты) в хлороформе при перемешивании на медленном огне.
- Пальто чистую стеклянную крышку сползает в PLGA, покрывая поверхность каждой покровным стеклом с решением PLGA. Разрешить PLGA сушить на тонкую пленку (около 30 мин).
3. Электропрядения 2
- Безопасные PLGA мелованной обложкой стекла скользит к коллектору с проводящей ленты углерода. Для выровнены волокон, коллектор с приводом от двигателя колеса. Для случайных волокон, коллектора стационарных пластины.
- Место шприца в насос с наконечником 20 см от коллектора колеса. Установить насос около 2 мл / час, а при использовании колес, установить двигатель до 300-400 оборотов в минуту. Если это возможно, применять -2 кВ постоянного тока смещения на коллекторе и +15 кВ до металлическим наконечником. В отсутствие доступа к питания биполярного землю коллектора.
- Волокна будет струи из наконечника шприца и собирать на вращающемся колесе. Продолжить спиннинг до требуемой плотности волокон получается. Размах металлическим наконечником с бумажным полотенцем, проставленный на непроводящих стержней периодически для предотвращения засорения на конце.
4. Moating 1
- После спиннинг, "Ров" electrospun образцы с помощью пипетки линии PLGA по периметру крышки скольжения. Разрешить PLGA для просушки. Это будет поддерживать выравнивание волокон во время культуры.
5. Белки покрытия
- Electrospun волокна и стекла контроля должны быть покрыты белком до клеточной культуры. Обложка субстратов в растворе белка, по крайней мере, один час, а затем аспират избыток раствора и продолжают аспирационных до подложки сухой. Возможные решения белка включают в себя: PLL (поли-L-лизин) (100 мкг / мл), ламинин (25 мкг / мл) или фибронектина (50 мкг / мл). Если ФАПЧ используется, поверхности должны быть промыты в стерильной воде и сушат в два раза после первого покрытия.
6. Получить E15 крысиных эмбрионов 3
* Все эксперименты были проведены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных утвержденного Мичиганского университета Комитета по использованию и уходу за животным.
- Подготовка: Убедитесь, что животное беременна. Оттепель 3 мл трипсина, 3 мл ФБС и теплая бутылка L15. Пожар польский пипетки Пастера. Лечить все хирургические инструменты в 70% этаноле в течение 30 мин.
- Подготовка и теплая обшивка СМИ (см. таблицу 1).
- Эвтаназия: Выполнение IP инъекции кетамина / ксилазина. Подождите 10-15 минут, и проверить его на отсутствие роговицы и педали вывода рефлексов. Как только рефлексы отсутствуют, выполните IC инъекции фенобарбиталом (FatalPlus).
- Палатка кожу живота. Вырезать через кожу и мышечные слои, чтобы разоблачить брюшной полости. Найдите матки и отделить его на шейку матки и яичников.
- Удалить эмбрионов из матки с помощью ножниц и место их сразу в теплую L15. (Все следующие процедуры будут завершены под микроскопом и рассекает эмбрионов и расчлененный шнуры должны быть погружен в теплую L15 во все времена.) Обезглавьте эмбриона, закрыв щипцы вокруг подбородка и ниже затылочной кости черепа.
7. Препарирование 3
- Место эмбриона на одной стороне. Защита спинного мозга с одним набором щипцов, используя другой набор к полосе от конечностей и органов брюшной полости.
- Включите эмбриона и удерживайте его устойчивым с одним набором щипцов. Snip по длине эмбриона, от шеи до хвоста, пока весь шнур подвергается.
- Возьмитесь за конец шнура тщательно и вытяните ее над собой к хвосту, чтобы удалить. Шнур будет тянуть бесплатно с мембраной и спинной ганглий корня (DRG) прилагается.
- Если DRG эксплантов или диссоциированных сенсорных нейронов культуры должны быть выполнены, СНиП DRG от мозга и передавать их на свежий блюдо теплым L15.
- Для DRG эксплантов культуры, перейдите к шагу 10,2
- Для диссоциированных сенсорная культура нейронов, переходите к шагу 9
- Для культуры двигательных нейронов, DRG, будут удалены с мембраной в шаге 7,5
- Удалить мембрану из спинного мозга, держа его в верхней части мозга и пилинг его, похоже на удаление долго носок. Повторите эти действия для всех эмбрионов, а затем нарезать на небольшие шнуры (2-3 мм) штук.
- Залейте нарезанные шнуры и L15 в конических и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин для осаждения штук.
- Слейте надосадочную жидкость и добавить 3 мл трипсина в гранулированной шнуры. Инкубируйте в 37 ° С на водяной бане 20 мин.
- Добавьте 3 мл ФБС для конических и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин повторно гранул.
- Слейте надосадочную и пальто огнем полированные пипетку Пастера с FBS.
- Добавьте одну пипетку Пастера-полно L15 для конической, а затем растирают мягко, пока решение однородной, без видимых комков. Избегайте пузырей.
- Подготовка 9%-ный раствор Optiprep в L15. Подготовка одну пробирку с 3 мл раствора Optiprep на каждых двух эмбрионов (если есть нечетное число эмбрионов, округлить).
- Оставьте гомогенизированный раствор на решение Optiprep, разделив ее поровну между всеми трубами. Спиновые труб при 2000 оборотов в минуту в течение 15 мин.
- Осторожно собрать топ 2 мл из каждой пробирки и бассейн в 50 мл коническую. Заполните конические с L15 и спина при 1000 оборотов в течение 5 мин для полоскания клетки Optiprep.
- Слейте надосадочную и ресуспендирования клеток в небольшом количестве покрытие СМИ (250-500 мкл). Граф клеток с использованием трипанового синего исключения для выявления живых клеток. Пропустить и перейти к шагу 10,1
9. Сенсорного нейрона (SN) Обработка 7
- Налейте DRG удален из спинного мозга и L15 в конической трубе и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин для осаждения штук.
- Слейте надосадочную жидкость и добавить 3 мл трипсина в гранулированной DRG. Инкубируйте в 37 ° С на водяной бане 10 мин.
- Добавьте 3 мл ФБС для конических и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин повторно гранул.
- Слейте надосадочную и пальто огнем полированные пипетку Пастера с FBS.
- Добавьте одну пипетку Пастера-полно L15 для конической, а затем растирают мягко, пока решение однородной, без видимых комков. Избегайте пузырей.
- Спиновые гомогената при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Слейте надосадочную и ресуспендирования клеток в небольшом количестве SN покрытие СМИ (250-500 мкл). Граф клеток с использованием трипанового синего исключения для выявления живых клеток. Перейдите к шагу 10,1
10. Покрытие и культуры
- Для диссоциированных С. Н. или М. Н. культуры:
- Обложка подложках с несколькими каплями медиа затем добавить соответствующий объем клеточной суспензии. Расхождение между клетки должны быть покрыты при низкой плотности (25-50 кл / мм 2). Разрешить клетки придерживаться, по крайней мере за один час до затопления скважин со СМИ.
- Для DRG эксплантов культуры:
- Обложка подложках с несколькими каплями медиа затем добавить DRG, чтобы средства массовой информации. Упорядочить DRG, чтобы они равномерно распределены по всей подложке (около 4 DRG может поместиться на 22x22 скольжения крышки мм). Разрешить DRG придерживаться, по крайней мере, 4 часа до затопления скважин со СМИ.
- Культуры могут быть сохранены на срок до 4 дней без изменения информации. Для более длинных культур, половина средств массовой информации изменений должно быть сделано с кормом СМИ. Поток средств массовой информации является тот же состав, покрытие СМИ минус L-глутамина.
11. Иммуноцитохимическая 1,5,8
- Крепление клеток: Аспирируйте СМИ и заменить теплым 4% PFA (параформальдегид) в течение 30 мин. Затем выполните 3X 5 мин 1x PBS стирок.
- Блокировка / пермеабилизации: Подготовьте блок / Пермь решение (1,25% бычьего сывороточного альбумина в 1X PBS, 0,05% Тритон Х-100 и 2,0% нормальной козьей сывороткой). Аспирируйте PBS и применить блок / Пермь решение образцов в течение 30 минут. Затем выполните 1X 5 мин 1x PBS стирок.
- Первичное антитело: Подготовка первичных антител рабочего раствора (10% нормальной козьей сывороткой, 1,25% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Na азид, 0,05% Тритон Х-100 и до 10 мл с 1x PBS). Добавить необходимое количество первичных антител (см. таблицу 2). Линия несколько блюд с парафильмом. Место шарик 200 мкл первичных антител решение о парафильмом для каждой подложке. Обратить субстратов, плавучие их ячейки вниз на первичных антител рабочего раствора на ночь (если в комнате есть кондиционер или особенно сухой, часть воды, насыщенной бумаги могут быть добавлены в углу блюдо для предотвращения испарения рабочего раствора) .
- Вторичные антитела: Удаление подложки из первичных (рабочий раствор может быть собрана, хранить при температуре 4 ° С и использовать повторно) и выполнять 2X 5 мин 1x PBS стирок. Применить 200 мкл разбавленного вторичные антитела 1:200 в PBS (также обращена на парафильмом выстроились блюдо) в течение 4 часов.
- Удалить из вторичного затем выполнить 2X 5 мин 1x PBS стирок. Горы субстратов на слайдах с Продли Золотой содержащей DAPI или другой подходящий ответного ядерного пятно.
12. Представитель Результаты:
Типичная морфология выровнены и случайных эльectrospun волокна показано на рисунке 1. Как правило, мы получаем MN чистоты> 90% нейронов 7,8 с этим протоколом, и мы сохранили DRG культур тех пор, пока одна неделя без какого-либо значительного роста фибробластов. На рисунке 2 показан типичный вид MN на стекле и волокон после 24 часов культуры и иммунной окраски. Immunostained DRG культивировали в течение трех дней на стекле и волокна изображено на рисунке 3.
Рисунок 1. Волоконно выравнивание манипулировать выбором коллектора. А.) неприсоединения волокна нити на вращающуюся коллектор колесо и б) случайные волокна нити на стационарный коллектор пластины. Шкала баров = 20 мкм.
Рисунок 2. Представителем моторных нейронов окрашивают в течение TuJ1 (зеленый) и DAPI (синий), после 24 часов культуры на PLL покрытием А.) волокон и б) стекла. Шкала баров = 20 мкм.
Рисунок 3. Представитель DRG окрашивают в течение нейрофиламентов (зеленый) после 3 дней культуры на PLL покрытием А.) стекла и б) волокон. Шкала бар = 200 мкм.
| Маточного раствора: | М. Н. СМИ: | DRG / SN СМИ: |
| 10 мг мл -1 альбумина | 12,5 мкл | - |
| 10 мг мл -1 апо-трансферрина | 50 мкл | 40 мкл |
| 50 мкг мл -1 β-эстрадиола | 2,7 мкл | 2,2 мкл |
| 0,1 мг мл -1 биотин | 50 мкл | - |
| 16 мг мл -1 каталазы | 8 мкл | - |
| 15 мг мл -1 D-галактозы | 50 мкл | - |
| 50 мкг мл -1 гидрокортизон | 3,7 мкл | 2,9 мкл |
| 0,63 мг мл -1 прогестерона | 0,5 мкл | - |
| 16 мг мл -1 путресцин | 50 мкл | - |
| 50 мкг селена мл -1 | 3,4 мкл | 4,1 мкл |
| 2,5 мг мл -1 супероксиддисмутазы | 50 мкл | - |
| * 500 нг мл -1 фактора роста нервов | - | 1 мл |
| * 100X PSN | 0,5 мл | 0,5 мл |
| * B27 | 1 мл | 1 мл |
| * 2 мМ L-глутамина | 35 мкл | 35 мкл |
| * Neurobasal | до 50 мл | до 50 мл |
Таблица 1. Добавить снялся (*) компонентов в СМИ непосредственно перед использованием. Остальные компоненты могут быть подготовлены в качестве исходного раствора и выдерживают при температуре -20 ° С до необходимых 6,7.
| Первичные (концентрации) | Нейроны: | Глия: | Фибробласты: |
| анти-β-тубулина (TuJ1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| анти-нейрофиламентов (1:1000) | ✓ | X | X |
| анти-S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| анти-NGFR p75 (1:500) | ✓ | ✓ | X |
Таблица 2. Отбор первичных антител зависит от целей исследователя. Выше несколько антител и концентрации мы с успехом использоваться в нашей лаборатории. S-100 особенно полезен для выявления Шванн клеток и / или проверки загрязнения фибробластов, но учтите, что она должна использоваться в сочетании с NGFR p75 различать глии и fibroblasts4. Мы также заметили, что NGFR p75 пятна нейритов очень легко в то время как нейрофиламентов или TuJ1 являются отличным выбором, если цель заключается в визуализации отдельных невриты.
Discussion
Этот протокол имеет несколько важных шагов. Первый предполагает собственного производства подложек electrospun волокна. В жидких средах, PLLA волокна, пленки и PLGA PLGA ров будет отделена от скольжения стеклянной крышкой, как единое целое. Если PLGA опущен, PLLA волокна не останется плоский лист, - они будут сворачиваться в клубок непригодным. Таким образом, фильм PLGA включен в качестве подходящего субстрата для поддержания выравнивания волокна во время культуры. Ров добавляется после спиннинг как для обеспечения того, чтобы волокна надежно закреплены к фильму PLGA и добавить жесткости к фильму. Ров также служит полезным ручку, когда субстраты манипулируют во время фиксации, окрашивания и монтажа. Растирание является вторым важным шагом. Следует приложить все усилия, чтобы избежать образования пузырьков. Кроме того, мы получили гораздо более высокие урожаи при огневой полировкой пипетка используется для этого шага. Чтобы запустить для ногтей, свет горелку и прикрепить лампу для пипетки. Pass кончике пипетки быстро через пламя в 2-3 раза, непрерывно сжимая и отпуская луковица - поток воздуха через пипетку поможет предотвратить наконечник от закрытия полностью. Изучить кончика пипетки для обеспечения отверстие остается открытым, и что края появляются слегка закругленный перед использованием.
Электропрядения это очень универсальный процесс; электропрядения параметры могут быть модифицированы для производства волокна с различными морфологии. Тан и соавт. (2005) подробно систематическое изучение параметров, влияющих на диаметр волокна PLLA electrospun. Wang и соавт. (2009) представляет собой детальное изучение параметров, влияющих на выравнивание electrospun волокна PLLA.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
