Summary
Bağlantısızlar electrospun lifler in vitro nöron büyüme doğrudan ve sinir rejenerasyonu iskeleleri potansiyel bir bileşenidir. Biz electrospun elyaf yüzeyleri ve birincil sıçan E15 duyusal (DRG) ve motor nöronların serum serbest kültür hazırlanması için bir prosedür açıklanmaktadır. Immünsitokimya tarafından nöronların Görselleştirme de dahildir.
Abstract
Elektrospinning nano ölçekli liflerin mikro üretmek için kullanılan bir tekniktir. Elyaf yüksek tamamen rasgele hizalanır, uyum değişen derecelerde ile electrospun olabilir. Buna ek olarak, lifler, poli-L-laktik asit (PLLA) gibi biyolojik olarak parçalanabilen polimerler dahil olmak üzere çeşitli malzemeler spun olabilir. Bu özellikler, doku mühendisliği iskele uygulamaları bir dizi için uygun electrospun elyaf olun. Bizim odak sinir rejenerasyonu için hizalanmış electrospun liflerin kullanımı ile ilgili. Biz daha önce hizalı electrospun PLLA lifleri in vitro hem de primer duyu ve motor nöronların akıbet doğrudan göstermiştir . Biz mümkün olduğunca yakın bir in vivo model gerçek nöronların biyomateryaller değerlendirirken birincil hücre kültürü sisteminin kullanılması gerekli olduğunu korur. Burada, fibröz iskeleleri ve kültür dorsal kök gangliyon eksplantlar, yanı sıra electrospun iskeleleri dissosiye duyu ve motor nöronlar, electrospin laboratuvarımızda kullanılan teknikler açıklanmaktadır. Ancak, elektrospinning ve / veya burada sunulan kültür teknikleri kolayca diğer uygulamalarda kullanılmak üzere uyarlanmıştır.
Protocol
1. Poli-L-laktik asit (PLLA Çözüm İplik)
- 9 mL kloroform 0.4 g PLLA kısık ateşte karıştırarak eritin.
- DMF: 09:01 (v / v) kloroform% 4 PLLA (w / v) çözümün nihai konsantrasyonu getirerek, çözüm için 1 ml dimetilformamid ekleyin.
- Künt 23ga metal ucu ile bir polipropilen ya da cam şırınga çözüm yerleştirin.
2. Yüzey Hazırlığı 1 İplik
- 85:15 PLGA% 8 (w / v) solüsyonu (poli-laktik-ko-glikolik asit), kısık ateşte karıştırarak tarafından kloroform olun.
- PLGA çözümü ile her kapak kayma yüzeyi kaplayan tarafından PLGA Coat temiz cam kapak fişleri. PLGA ince bir film (yaklaşık 30 dakika) kurumasını bekleyin.
3. Elektrospinning 2
- Güvenli PLGA kaplı cam kapak, iletken karbon bant ile kolektör sığar. Hizalanmış lifleri için, toplayıcı, motorlu tekerlek. Kollektör rastgele lifleri için, sabit bir plaka.
- Yeri şırınga ucu 20 cm toplayıcı tekerlek ile pompa. Yaklaşık 2 mL / saat pompa seti ve bir tekerleğini kullanarak, 300-400 RPM motor ayarlarsanız. Mümkünse, -2 kV DC kollektör önyargı ve 15 kV metal uç geçerlidir. Iki kutuplu bir güç kaynağına erişim yokluğunda, kollektör zemin.
- Elyaf şırınga ucu jet ve dönen bir tekerlek üzerinde toplamak. Liflerin istenen yoğunluk elde edilinceye kadar iplik devam edin. Swipe bir kağıt havlu ile metal ucu olmayan bir iletken çubuğun ucunda periyodik tıkanmasını önlemek için yapıştırılmış.
4. 1 Moating
- Ardından iplik, kapak kayma çevresinde PLGA bir çizgi pipetleme hendek electrospun örnekleri. PLGA kurumasını bekleyin. Bu kültür sırasında lifler uyum koruyacaktır.
5. Protein Kaplama
- Electrospun cam elyaf ve kontrolleri hücre kültürü öncesinde protein kaplı olması gerekir. En az bir saat için bir protein çözüm substratlar Kapak ve daha sonra aşırı bir çözüm aspirat ve aspire substratlar kuruyana kadar devam edin. Olası protein çözümler şunlardır: PLL (poli-L-lisin) (100 mg / ml), laminin (25 mcg / ml) veya fibronektin (50 mg / ml). PLL kullanılması durumunda, substratlar steril su ile durulanır ve ilk kaplama aşağıdaki iki kez kuru olmalıdır.
6. E15 Rat Embriyolar Edinme 3
* Bütün deneyler NIH Hayvanların Kullanımı ve Bakımı, Michigan Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu doğrultusunda yapıldı.
- Hazırlanışı: hayvanın gebe olup olmadığını kontrol edin. 3 ml tripsin, 3 mL FBS ve L15 sıcak bir şişe çözülme. Yangın bir Pasteur pipeti lehçe. 30 dakika süreyle% 70 etanol bütün cerrahi aletler dezenfekte edin.
- Kaplama ortamı hazırlayın ve sıcak (bkz. Tablo 1).
- Ötenazi: ketamin / xylazine bir IP enjeksiyon gerçekleştirin. 10-15 dakika bekleyin ve kornea eksikliği olup olmadığını kontrol edin ve geri çekilme refleksleri pedal. Refleksleri sonra, pentobarbital (FatalPlus) bir IC enjeksiyon gerçekleştirin.
- Çadır karın cilt. Karın boşluğu ortaya çıkarmak için, kas ve deri katmanları yoluyla kesin. Bulun rahim ve rahim ağzı ve yumurtalıklar ayırmak.
- Makas ile embriyolar rahim çıkarın ve hemen sıcak L15 içine koyun. (Diseksiyon mikroskobu ve embriyolar altında aşağıdaki işlemler tamamlandı ve disseke kablolarını her zaman sıcak L15 batık olmalıdır.), Kapatma ve çene etrafında forseps aşağıdaki oksipital kemik, kafatası embriyolar başını kesmek.
7. Diseksiyon 3
- Bir tarafta embriyo yerleştirin. Bacaklarda ve karın içi organların şerit diğer seti kullanılarak bir dizi forseps ile omurilik koruyun.
- Embriyo açın ve bir set forseps ile sabit tutun. Tüm kablosu maruz kadar, boyundan kuyruk uzunluğu boyunca embriyo Snip.
- Kablosunun sonunda dikkatli bir şekilde tutun ve kaldırmak için kuyruk karşı kendini üzerinden çekin. Kablosu membran ve dorsal kök gangliyon (DRG) bağlı çeker.
- DRG eksplant veya ayrışmış bir duyusal nöron kültürü yapılacak ise, kablo kapalı DRG snip ve L15 sıcak taze yemek aktarabilirsiniz.
- Eksplant kültür DRG için, 10.2 adıma geçin
- Ayrışmış duyusal nöron kültürü için, 9. adıma geçin.
- Motor nöron kültürü için, DRG adım 7.5 'de membran ile silinecektir
- Uzun çorap çıkarmadan benzer kablosunun üst ucunda açgözlü ve aşağı soyma omurilik zarı, çıkarın. Tüm embriyolar için tekrarlayın ve sonra küçük parçalar halinde (2-3 mm) kordonlar doğrayın.
- 2-3 dakika süreyle adet pelet 1000 RPM konik ve spin içine doğranmış kablolarını ve L15 dökün.
- Süpernatantı dökün ve tripsin 3 mL pelet kabloları ekleyin. 20 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edin.
- Konik ve 2-3 dakika süreyle yeniden pelet 1000 RPM dönüş 3 mL FBS ekleyin.
- Süpernatantı ve kat FBS ile bir yangın cilalı Pasteur pipeti dökün.
- Konik bir Pasteur, L15, pipet dolu ve çözüm görünür kümeleri ile homojen olana kadar yavaşça çiğnemek. Kabarcıkları kaçının.
- L15 Optiprep% 9 çözüm hazırlayın. 3 mL Optiprep çözüm her iki embriyo (embriyo bir tek sayı varsa, kadar yuvarlak) bir tüp hazırlayın.
- Tüm tüpler arasında eşit olarak bölünerek homojenize çözüm, Optiprep çözüm üzerine bırakın. Tüpleri 15 dakika için 2000 RPM Spin.
- Üst 2 ml, 50 ml konik her tüp ve havuz dikkatlice toplamak. Optiprep hücreleri durulamak için 5 dakika için 1000 RPM hızında, L15 ve spin konik doldurun.
- Süpernatantı dökün ve kaplama medya (250-500 ul) küçük bir miktar hücrelerin tekrar süspansiyon. Hücreler, canlı hücreleri belirlemek için tripan mavisi dışlama kullanarak güvenin. 10.1 adıma geç
9 - Duyusal Nöron (SN) İşleme 7
- 2-3 dk pelet adet 1000 RPM konik bir tüp ve spin omurilik ve L15 kaldırılır DRG dökün.
- Süpernatantı dökün ve tripsin 3 mL pelet DRG ekleyin. 10 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edin.
- Konik ve 2-3 dakika süreyle yeniden pelet 1000 RPM dönüş 3 mL FBS ekleyin.
- Süpernatantı ve kat FBS ile bir yangın cilalı Pasteur pipeti dökün.
- Konik bir Pasteur, L15, pipet dolu ve çözüm görünür kümeleri ile homojen olana kadar yavaşça çiğnemek. Kabarcıkları kaçının.
- 5 dakika için 1000 RPM Homojenat Spin. Süpernatantı dökün ve SN kaplama medya (250-500 ul) küçük bir miktar hücrelerin tekrar süspansiyon. Hücreler, canlı hücreleri belirlemek için tripan mavisi dışlama kullanarak güvenin. 10.1 adım devam edin
10 Kaplama ve Kültür
- : Ayrışmış SN veya MN kültür için
- Sonra birkaç damla medya substratlar Kapak uygun bir hacimli hücre süspansiyonu ekleyin. Disosiye hücreleri düşük yoğunluklu (25-50 hücre / mm 2) kaplama olmalıdır. Hücrelerin en az bir saat önce, medya ile kuyu sel uyması izin verin.
- Eksplant kültür DRG için:
- Medya birkaç damla substratlar Kapak sonra medyaya DRG ekleyin. Substrat (22x22 mm kapak astar üzerine yaklaşık 4 DRG uyacak) eşit dağılmış, böylece DRG düzenleyin. DRG medya ile kuyuların sel önce en az 4 saat boyunca uyması izin verin.
- Kültürler medya değişiklik olmadan 4 gün öncesine kadar devam edilebilir. Besleme medya ile uzun kültürler için, yarım medya değişiklikler yapılmalıdır. Besleme medya kaplama medya eksi L-glutamin aynı kompozisyon.
11. İmmünositokimya 1,5,8
- Tespit hücreleri: aspire medya ve 30 dakika süreyle sıcak% 4 PFA (paraformaldehid) ile değiştirin. Sonra 5 dakika 1x PBS 3X yıkar gerçekleştirin.
- Permeabilization Engelleme / blok / perma solüsyonu (% 1,25 1X PBS albümin sığır serumu,% 0.05 Triton X-100 ve% 2,0 'normal keçi serumu) hazırlayın. Aspire PBS ve 30 dakika için örnek blok / perma çözümü uygulamak. Sonra 1X 5 dakika 1x PBS yıkar gerçekleştirin.
- Primer antikor: primer antikor çalışma çözeltisi hazırlayın (% 10 normal keçi serumu,% 1.25 sığır serum albumin,% 0.1 Na azid, 1x PBS ile% 0.05 Triton X-100 ve 10 ml). (Bkz. Tablo 2) primer antikor uygun miktarda ekleyin. Parafilm doğrultusunda birkaç yemekler. Her bir yüzey için parafilm birincil antikor çözüm 200μl boncuk yerleştirin. Substratları haricindekileri, gece primer antikor çalışma çözeltisi hücre tarafı aşağı kayan (oda klimalı ya da özellikle kuru ise, suya doymuş kağıt bir parça çanak çalışma çözeltisi buharlaşma önlemek için bir köşesinde eklenebilir.) .
- İkincil antikor: birincil (çalışma solüsyonu ° 4 saklanan, C toplanan ve yeniden olabilir) substratları çıkarın ve 2X 5 dakika 1x PBS yıkar gerçekleştirmek. 200 ul sekonder antikoru 1:200 sulandırılmış PBS (parafilm astarlı çanak ters) 4 saat süreyle uygulayın.
- Sonra ikincil dan çıkarın 2X 5 dk 1x PBS yıkar gerçekleştirin. Dağı substratlar slaytlarla DAPI veya başka uygun bir nükleer sayaç içeren Altın leke uzatır.
12. Temsilcisi Sonuçlar:
Hizalanmış ve rastgele El tipik morfolojiectrospun lifleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Biz genellikle bu protokol ile>% 90 nöronlar 7,8 MN saflık elde etmek ve herhangi bir önemli fibroblast büyüme olmadan uzun bir hafta boyunca kültürlerin DRG korumuştur. Şekil 2, 24 saat sonra kültür ve immün cam ve elyaf tipik MN görünüm gösterir. Cam ve elyaf üç gün boyunca kültür immunohistokimyasal DRG Şekil 3'te.
Şekil 1. Fiber hizalama, koleksiyoncu seçimi tarafından manipüle . A.)) dönen bir tekerlek toplayıcı ve B. üzerine bükülmüş liflerin Bağlantısızlar rasgele lifler sabit bir plaka toplayıcı üzerine döndü. Ölçek bar = 20 mm.
Şekil 2) PLL kaplı A. 24 saat sonra kültür TuJ1 (yeşil) ve DAPI (mavi) elyaf ve B. lekeli Temsilcisi motor nöronlar) cam. Ölçek bar = 20 mm.
Şekil 3 PLL kaplı A. 3 gün sonra kültür nörofilaman Temsilcisi DRG boyandı (yeşil)) cam ve B.) lifleri. Ölçek bar = 200 mm.
| Stok çözelti: | MN medya: | DRG / SN medya: |
| 10 mg mL -1 albümin | 12.5 ul | - |
| 10 mg mL -1 apo-transferrin | 50 ul | 40 ul |
| 50 mg mL -1 β-östradiol | 2.7 ul | 2.2 ul |
| 0.1 mg mL -1 biotin | 50 ul | - |
| 16 mg mL -1 katalaz | Ul 8 | - |
| 15 mg mL -1 D-galaktoz | 50 ul | - |
| 50 mg mL -1 hidrokortizon | 3.7 ul | 2.9 ul |
| 0.63 mg mL -1 progesteron | 0.5 ul | - |
| 16 mg mL -1 putrescine | 50 ul | - |
| 50 mg mL -1 selenyum | 3.4 ul | 4.1 ul |
| 2.5 mg mL -1 süperoksit dismutaz | 50 ul | - |
| * 500 ng mL -1 sinir büyüme faktörü | - | 1 ml |
| * 100X PSN | 0,5 mL | 0,5 mL |
| * B27 | 1 ml | 1 ml |
| * 2 mM L-glutamin | 35 ul | 35 ul |
| * Neurobasal | 50 ml | 50 ml |
Tablo 1: kullanımdan hemen önce medyaya (*) bileşenleri oynadı ekleyin. Geri kalan bileşenleri bir stok solüsyonu olarak hazırlanan ve 6,7 ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
| Primer (konsantrasyon) | Nöronlar: | Glia: | Fibroblastlar: |
| anti-β-tubulin (TuJ1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-nörofilaman (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| anti-NGFR P75 (1:500) | ✓ | ✓ | X |
Tablo 2. Primer antikor seçim araştırmacının hedeflerine bağlıdır. Yukarıda birkaç antikorlar ve laboratuvarda başarı ile kullanılan konsantrasyonları. S-100, Schwann hücreleri ve / veya fibroblastlar kirlenmesine kontrol tanımlamak, ancak glia ve fibroblasts4 ayırt etmek NGFR P75 ile birlikte kullanılmalıdır gerektiğini özellikle yararlıdır. Ayrıca nörofilaman veya TuJ1 amacı bireysel neurites görselleştirmek için ise mükemmel bir seçimdir NGFR P75 lekeleri çok hafifçe neurites fark var.
Discussion
Bu protokol, pek çok kritik adımlar vardır. Ilk electrospun fiber yüzeylerin uygun üretim içerir. PLLA lifler, PLGA film ve PLGA hendek sıvı medya, tek bir birim olarak cam kapak slip ayrı olacaktır. PLGA atlanırsa, PLLA lifleri, düz bir levha kalamaz kullanılamaz karmaşasının içine kıvrılıp. Böylece, PLGA filmi kültür sırasında fiber uyum sağlamak için uygun bir substrat olarak yer almaktadır. Hendek lifler güvenli PLGA film sabit ve filmin yapısal katılık eklemek sağlamak için her iki iplik sonra eklenir. Yüzeyler, montaj, boyama ve montaj sırasında manipüle hendek de yararlı bir kolu olarak hizmet vermektedir. Öğütme ikinci kritik bir adımdır. Kabarcık oluşumunu önlemek için her türlü çabayı yapılmalıdır. Ayrıca, bu adımı bir yangın cilalı pipet kullanıldığında çok daha yüksek verim elde edilmiştir. Lehçe yangın, bir Bunsen beki ışık ve pipet bir ampul takın. Sürekli sıkma ve ampul bırakırken alev ile 2-3 kez hızlı bir şekilde pipet ucu Pass - pipet ile hava akışı tamamen kapatarak ucu önlemeye yardımcı olur. Pipet ucu delik hala açık olduğundan emin olmak için inceleyin ve kullanmadan önce biraz yuvarlatılmış kenarları görünür.
Elektrospinning çok yönlü bir süreçtir; elektrospinning parametreleri morfolojileri çeşitli lifler üretmek için modifiye edilebilir. , Tan ve ark. (2005) PLLA electrospun liflerin çapı etkileyen parametrelerin sistematik bir çalışma . Wang ve ark (2009), hizalama electrospun PLLA lifleri etkileyen parametreler detaylı bir çalışma sunar .
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
