Summary
Aligned electrospun fibrer direkt tillväxten av nervceller in vitro och är en potentiell del av byggnadsställningar skadade nervtrådar. Vi beskriver ett förfarande för att förbereda electrospun fiber substrat och serumfritt kultur av primär råtta E15 sensoriska (DRG) och motoriska nervceller. Visualisering av nervceller genom immuncytokemi ingår också.
Abstract
Electrospinning är en teknik för att producera mikro-till nanoskala fibrer. Fibrerna kan vara electrospun med olika grader av anpassning, från mycket anpassat till helt slumpmässigt. Dessutom kan fibrer vara spunnet av en mängd olika material, inklusive biologiskt nedbrytbara polymerer som poly-L-mjölksyra (PLLA). Dessa egenskaper gör electrospun fibrer lämplig för en mängd av byggnadsställningar applikationer inom tissue engineering. Vårt fokus ligger på användning av anpassade electrospun fibrer för skadade nervtrådar. Vi har tidigare visat att i linje electrospun PLLA fibrer direkt en utväxt av både primära sensoriska och motoriska nervceller in vitro. Vi vidhåller att användningen av en primär cellkultur är avgörande vid bedömningen av biomaterial att modellera verkliga nervceller som finns i vivo så nära som möjligt. Här beskriver vi tekniker som används i vårt laboratorium för att electrospin fibrösa byggnadsställningar och kultur dorsala explants ganglier, liksom dissocierade sensoriska och motoriska nervceller, på electrospun ställningar. Men de electrospinning och / eller tekniker kultur presenteras här enkelt anpassas för användning i andra tillämpningar.
Protocol
1. Poly-L-mjölksyra (PLLA) Spinnoljor
- Lös upp 0,4 g PLLA i 9 ml kloroform under omrörning på låg värme.
- Tillsätt 1 ml dimetylformamid till lösningen, vilket den slutliga koncentrationen av lösningen till 4% PLLA (w / v) i kloroform: DMF 09:01 (v / v).
- Placera lösningen i en polypropylen eller glas spruta med en trubbig 23ga metall spets.
2. Spinning Förbehandling 1
- Gör en 8% (w / v) lösning av 85:15 PLGA (poly-mjölksyra-co-glykolsyra) i kloroform under omrörning på låg värme.
- Coat rent glas täckglas i PLGA genom att täcka ytan på varje täckglas med PLGA lösningen. Låt PLGA torka till en tunn film (ca 30 min).
3. Electrospinning 2
- Säkra PLGA belagt glas täckglas till samlare med ledande kol tejp. För linje fibrer är samlaren en motordriven hjul. För slumpmässig fibrer är samlaren en stationär tallrik.
- Sätt sprutan i pump med spets 20 cm från samlare hjul. Ställ in pumpen till ca 2 ml / tim och om du använder ett hjul, ställ in motorn till 300-400 rpm. Om möjligt, tillämpa ett -2 kV DC partiskhet till uppköparen och 15 kV till metall spets. I avsaknad av tillgång till en bipolär strömförsörjning, jorda samlare.
- Fibrer stråle från sprutspetsen och samla på roterande hjul. Fortsätt snurra tills den önskade tätheten av fibrer erhålls. Dra metallen spets med en pappershandduk som fästs på ett icke-ledande stav med jämna mellanrum för att förhindra igensättning i spetsen.
4. Moating 1
- Efter spinning, "vallgrav" proverna electrospun genom att pipettera en rad PLGA runt i ytterkanten av locket halka. Låt PLGA torka. Detta kommer att bibehålla placeringen av fibrerna under kulturen.
5. Protein Beläggning
- Electrospun fibrer och kontroller glas måste överdragna med protein innan cellkultur. Täck substrat i ett protein lösning för minst en timme och sedan aspirera överflödig lösning och fortsätter aspirerande tills substrat är torra. Möjliga protein lösningar inkluderar: PLL (poly-L-lysin) (100 mikrogram / ml), laminin (25 mikrogram / ml) eller fibronektin (50 mikrogram / ml). Om PLL används bör substrat sköljas i sterilt vatten och torkas två gånger efter den första beläggningen.
6. Skaffa E15 Rat embryon 3
* Alla försök gjordes i enlighet med NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur som godkänts av University of Michigan kommittén för användning och vård av djur.
- Förberedelse: Kontrollera om djuret är gravid. Tina 3 ml trypsin, 3 ml FBS och varm en flaska L15. Brand polera en pasteurpipett. Desinficera alla kirurgiska instrument i 70% etanol i 30 min.
- Förbered och varma plätering medier (se tabell 1).
- Eutanasi: Gör en IP injektion av ketamin / xylazin. Vänta 10-15 minuter och kontrollera att brist på hornhinnan och pedal tillbakadragande reflexer. När reflexer är frånvarande, utföra en IC injektion för pentobarbital (FatalPlus).
- Tält huden i buken. Skär genom huden och lager muskler att avslöja bukhålan. Leta i livmodern och ta bort den på livmoderhalsen och äggstockarna.
- Ta bort embryon från livmodern med sax och lägg dem genast till varma L15. (Alla följande förfaranden har fullgjorts enligt en dissekera mikroskop och embryon och dissekerade sladdar ska vara nedsänkt i varmt L15 hela tiden.) Halshugga de embryon genom att stänga pincetten runt hakan och nedanför nacken ben i skallen.
7. Dissection 3
- Placera embryot på ena sidan. Skydda ryggmärgen med en uppsättning av tång medan du använder den andra uppsättningen att skala bort lemmar och bukorganen.
- Vänd embryot och håll den stadigt med en uppsättning av tång. Klipp längs embryot, från nacken till svansen, tills hela sladden utsätts för.
- Ta tag i änden av sladden försiktigt och dra den över sig själv mot svansen att ta bort. Sladden kommer att dra gratis med membran och dorsalrotsganglier (DRG) bifogas.
- Om DRG Explantation eller dissocierade sensoriska neuron kulturen skall utföras, klipp DRG bort sladden och överföra dem till en ny maträtt av varma L15.
- För DRG Explantation kultur, gå till steg 10,2
- För dissocierade sensoriska neuron kultur, gå till steg 9
- För motor neuron kulturen kommer DRG tas bort med membranet i steg 7,5
- Ta bort membranet från ryggmärgen genom att greppa den i den övre änden av sladden och peeling ner, ungefär som att ta bort en lång strumpa. Upprepa för alla embryon och sedan hacka sladdar i små (2-3 mm) bitar.
- Häll den hackade sladdar och L15 i en konisk och snurra vid 1000 RPM under 2-3 minuter till pellets bitarna.
- Häll av supernatanten och tillsätt 3 ml trypsin till pelleterat sladdar. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 20 min.
- Tillsätt 3 ml FBS till koniska och snurra vid 1000 RPM under 2-3 minuter att åter pellets.
- Häll av supernatanten och pälsen en brand polerat pasteurpipett med FBS.
- Lägg till ett pasteurpipett-full av L15 till koniska och sedan mal sönder försiktigt tills lösningen är homogen utan synliga klumpar. Undvik bubblor.
- Förbered en 9% lösning av Optiprep i L15. Förbered ett rör med 3 mL av Optiprep lösning för varje två embryon (om det finns ett udda antal embryon, runda upp).
- Släpp det homogeniserade lösningen på Optiprep lösningen, att dela upp det jämnt bland alla rör. Spin rören vid 2000 rpm i 15 min.
- Försiktigt samla upp 2 ml från varje rör och pool i en 50 ml konisk. Fyll koniska med L15 och snurra vid 1000 rpm i 5 minuter för att skölja celler Optiprep.
- Häll av supernatanten och suspendera cellerna i en liten mängd plätering media (250-500 l). Räkna celler med hjälp trypan blå utestängning att identifiera levande celler. Gå till steg 10,1
9. Sensoriska neuron (SN) Bearbetning 7
- Häll DRG bort från ryggmärg och L15 i en konisk tub och snurra vid 1000 RPM under 2-3 minuter till pellets bitarna.
- Häll av supernatanten och tillsätt 3 ml trypsin till pelleterat DRG. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 10 min.
- Tillsätt 3 ml FBS till koniska och snurra vid 1000 RPM under 2-3 minuter att åter pellets.
- Häll av supernatanten och pälsen en brand polerat pasteurpipett med FBS.
- Lägg till ett pasteurpipett-full av L15 till koniska och sedan mal sönder försiktigt tills lösningen är homogen utan synliga klumpar. Undvik bubblor.
- Snurra homogenatet vid 1000 rpm i 5 min. Häll av supernatanten och suspendera cellerna i en liten mängd SN plätering media (250-500 l). Räkna celler med hjälp trypan blå utestängning att identifiera levande celler. Fortsätt till steg 10,1
10. Plating och Kultur
- För dissocierade SN eller MN kultur:
- Täck substrat med några droppar av media sedan lägga till en lämplig volym av cellsuspension. Dissocierade celler bör beläggas med låg densitet (25-50 celler / mm 2). Låt cellerna att hålla sig i minst en timme före översvämningar brunnarna med media.
- För DRG Explantation kultur:
- Täck substrat med några droppar av media sedan lägga DRG till media. Ordna DRG så de är jämnt fördelade över hela substratet (ca 4 DRG får plats på en 22x22 mm täckglas). Låt DRG att hålla i minst 4 timmar innan översvämningar brunnarna med media.
- Kulturer kan bibehållas i upp till fyra dagar utan medier förändras. För längre kulturer, bör halv medier förändringar göras med foder medier. Feed media är samma sammansättning som bordläggning medier minus L-glutamin.
11. Immuncytokemi 1,5,8
- Fastställande celler: Aspirera media och ersätta med varma 4% PFA (paraformaldehyd) i 30 min. Utför sedan 3X 5 min 1x PBS tvättar.
- Blockering / permeabilization: Förbered blockera / perm-lösning (1,25% bovint serumalbumin i 1X PBS, 0,05% Triton X-100 och 2,0% normal get serum). Aspirera PBS och tillämpa blockera / perm lösning på prov i 30 minuter. Utför sedan 1X 5 min 1x PBS tvättar.
- Primär antikropp: Förbered primära antikroppen arbetslösning (10% normal get serum, 1,25% bovint serumalbumin, 0,1% Na Blyazid, 0,05% Triton X-100 och till 10 ml med 1x PBS). Tillsätt lämplig mängd primär antikropp (se tabell 2). Linje flera rätter med parafilm. Placera en 200μl sträng av primär antikropp lösningen på parafilm för varje substrat. Vänd substrat, flytande dem cell nedåt på den primära antikroppen brukslösning över natten (om rummet är luftkonditionerade eller särskilt torr, kan en bit vattenmättad papper läggas till ett hörn av skålen för att förhindra avdunstning av brukslösning) .
- Sekundär antikropp: Ta bort substrat från den primära (den brukslösning kan samlas in, lagras vid 4 ° C och återanvändas) och utföra 2X 5 min 1x PBS tvättar. Applicera 200 l sekundär antikropp späds 1:200 i PBS (även inverterad på parafilm fodrad maträtt) i 4 tim.
- Ta bort från sekundära utför sedan 2X 5 min 1x PBS tvättar. Mount substrat på diabilder med Förläng Gold innehåller DAPI eller annan lämplig nukleär motverka fläcken.
12. Representativa resultat:
Den typiska morfologi linje och slumpmässiga electrospun fibrer visas i figur 1. Vi får ofta MN renhet> 90% nervceller 7,8 med detta protokoll, och vi har upprätthållit DRG kulturer så länge som en vecka utan någon större fibroblast tillväxt. Figur 2 visar typiska MN utseendet på glas och fibrer efter 24 timmar av kultur och immunfärgning. Immunostained DRG odlade i tre dagar på glas och fibrer är avbildade i figur 3.
Figur 1. Fiber anpassning är manipulerad av val av samlare. A.) Justerad fibrer spunna på ett roterande hjul samlare och B.) slumpmässiga fibrer spunna på en stationär solfångare. Skala staplar = 20 mikrometer.
Figur 2. Representant motoriska nervceller färgas för TuJ1 (grön) och DAPI (blå) efter 24 timmars kultur på PLL bestruket A.) fibrer och B.) glas. Skala staplar = 20 mikrometer.
Figur 3. Representant DRG färgas för neurofilament (grön) efter 3 dagars kultur på PLL belagt A.) glas och B.) fibrer. Skala bar = 200 ìm.
| Stamlösning: | MN media: | DRG / SN media: |
| 10 mg ml -1 albumin | 12,5 l | - |
| 10 mg ml -1 APO-transferrin | 50 l | 40 l |
| 50 mikrogram mL -1 β-estradiol | 2,7 l | 2,2 l |
| 0,1 mg ml -1 biotin | 50 l | - |
| 16 mg ml -1 katalas | 8 l | - |
| 15 mg ml -1 D-galaktos | 50 l | - |
| 50 mikrogram ml -1 hydrokortison | 3,7 l | 2,9 l |
| 0,63 mg ml -1 progesteron | 0,5 l | - |
| 16 mg ml -1 Putrescine | 50 l | - |
| 50 mikrogram ml -1 selen | 3,4 l | 4,1 l |
| 2,5 mg ml -1 superoxiddismutas | 50 l | - |
| * 500 ng ml -1 nervtillväxtfaktor | - | 1 ml |
| * 100X PSN | 0,5 ml | 0,5 ml |
| * B27 | 1 ml | 1 ml |
| * 2 mM L-glutamin | 35 l | 35 l |
| * Neurobasal | till 50 ml | till 50 ml |
Tabell 1. Lägg stjärna (*) komponenter till media strax före användning. Resterande komponenter kan förberedda som en stamlösning och förvaras vid -20 ° C tills det behövs 6,7.
| Primär (koncentration) | Nervceller: | Glia: | Fibroblaster: |
| anti-β-tubulin (TuJ1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-neurofilament (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| anti-NGFR p75 (1:500) | ✓ | ✓ | X |
Tabell 2. Urvalet av primär antikropp är beroende av målen för utredaren. Ovanstående är flera antikroppar och de koncentrationer vi har använt med framgång i vårt laboratorium. S-100 är särskilt användbart för att identifiera Schwann celler och / eller kontrollera förorenar fibroblaster, men observera att det måste användas i kombination med NGFR p75 att skilja mellan Glia och fibroblasts4. Vi har också märkt att NGFR p75 fläckar neurites mycket lätt medan neurofilament eller TuJ1 är utmärkta val om målet är att visualisera enskilda neurites.
Discussion
Detta protokoll har flera viktiga steg. Den första handlar om den rätta produktionen av electrospun fiber substrat. I flytande media, kommer PLLA fibrer, PLGA film och PLGA vallgrav separat från skyddsglaset glida som en enhet. Om PLGA utelämnas kommer PLLA fibrerna inte vara en platt plåt - de kommer att krypa upp i en oanvändbar härva. Således är PLGA filmen ingår som ett lämpligt substrat för att bibehålla fiber anpassning under kultur. Vallgraven läggs till efter spinning både för att säkerställa att fibrerna är ordentligt fast i PLGA film och lägga strukturella styvhet till filmen. Vallgraven fungerar också som en bra handtag när substrat manipuleras under fastställande, färgning och montering. Trituration är andra avgörande steg. Alla ansträngningar bör göras för att undvika uppkomsten av bubblor. Dessutom har vi fått betydligt högre avkastning när en brand-polerad pipett används för detta steg. För brand polska, tända en Bunsenbrännare och bifoga en glödlampa på pipetten. Passera pipetten snabbt genom lågan 2-3 gånger under hela tiden klämma och släppa lampan - luftflödet genom pipetten hjälper till att förhindra spetsen från att stänga helt. Undersök spetsen på pipetten för att säkerställa att hålet är fortfarande öppen och att kanterna verkar lätt rundade före användning.
Electrospinning är en mycket mångsidig process, den electrospinning parametrar kan ändras för att producera fibrer med en rad olika morfologier. Tan et al. (2005) närmare en systematisk studie av parametrar som påverkar diametern på PLLA electrospun fibrer. Wang et al. (2009) presenterar en detaljerad studie av de parametrar som påverkar anpassningen av electrospun PLLA fibrer.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
