Summary
Het is algemeen bekend dat mechanische krachten in het lichaam kan cel differentiatie en proliferatie beïnvloeden. Hier presenteren wij een video-protocol demonstreren het gebruik van een custom-built bioreactor voor het leveren van uniaxiale cyclische rek aan cellen gekweekt op flexibele substraten micropatterned steel.
Abstract
De rol van mechanische krachten in de ontwikkeling en het onderhoud van de biologische weefsels is goed gedocumenteerd, waaronder een aantal mechanisch geregeld fenomenen zoals botremodellering, spierhypertrofie, en de gladde spiercellen plasticiteit. Echter, de betrokken diensten zijn vaak zeer complex en moeilijk te controleren en in vivo controle. Om beter de effecten van mechanische krachten op cellen, hebben we een in-vitro-methode voor het toepassen van uniaxiale cyclische rek het aanhangend cellen gekweekt op elastische membranen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen bioreactor met een gemotoriseerde cam-rotor systeem om de gewenste kracht toe te passen. Hier presenteren wij een stap-voor-stap video-protocol laten zien hoe je de verschillende onderdelen van elke "stretch kamer", met inbegrip van, in dit geval, een siliconen membraan met micropatterned topografie te oriënteren de cellen met de richting van de stam te monteren. We beschrijven ook de procedures voor het steriliseren van de kamers, zaaien cellen op het membraan, latching de kamer in de bioreactor, en het aanpassen van de mechanische parameters (dat wil zeggen de omvang en snelheid van stam). De procedures beschreven in dit protocol zijn specifiek voor het zaaien humane mesenchymale stamcellen op siliconen membranen met 10 micrometer brede kanalen gericht parallel aan de richting van de stam. Echter, de methodes en materialen die in dit systeem zijn flexibel genoeg om een aantal variaties op dit thema biedt plaats aan: reksnelheid, omvang, duur, celtype, membraan topografie, membraan-coating, enz. allemaal worden afgestemd op de gewenste toepassing of resultaat. Dit is een robuuste methode voor het onderzoeken van de effecten van uniaxiale trekspanning toegepast op cellen in vitro.
Protocol
Dag 0 - Sterilisatie voor de dag van het experiment
- Zet materialen in plastic kuip en steriliseren met alcohol 70% gedurende 2 uur:
- Kamers
- Deksels
- Frames (alle 3 stuks)
- Schroeven
- Rubberen dichtingen
- Pincet
- Schaar
- Hex sleutels
- Schone membranen met Aquet zeep en gedestilleerd water.
- Ultrasone trillingen membranen in 70% alcohol gedurende 10 minuten.
- Plaats de schone membranen in plastic vierkant gerechten. Bij gebruik van patronen membranen, ervoor zorgen dat de patroon zijde naar boven (spray alcohol op een zijde van het membraan en horloge voor de vloeistof af te rennen de groeven).
- Laat membranen bedekt met alcohol 70% gedurende 2 uur.
- Pakket handschoenen in aluminium folie voor autoclaaf morgenochtend.
- Maak 2% (gewicht / volume) gelatine-oplossing (2g/100mL) in gedestilleerd water voor autoclaaf morgen.
- Na de 2 uur sterilisatie in 70% alcohol, plaats alle polymere materialen en membranen (niet autoclaveerbaar materialen) in de kap voor de overnachting UV:
- Kamers
- Deksels
- Frames (alle 3 stuks)
- Membranen
- Voor resterende materialen in autoclaveerbaar zak:
- Schroeven
- Rubberen dichtingen
- Pincet
- Schaar
- Hex sleutels
Dag 1 - Montage van stretch kamers
- Autoclaaf tang, schaar, hex sleutels, schroeven, pakkingen, handschoenen, en gelatine met behulp van kleine autoclaaf bij 240 ° C gedurende 20 minuten in totaal
- Verwijder de membranen van UV en behandelen met O 2 plasma (een patroon naar boven) voor ~ 1 minuut.
- In TC kap, te dekken patroon gebied van plasma behandeld membranen met gelatine. Coat 30 voor minuten onder UV.
- Was elk membraan met PBS 2X. Na de 2e wassen, laat wat PBS op de membranen te houden gladde, voor eenvoudiger assemblage in de kamers. (Moet ook gebruik maken van dit PBS om de dichtingen te smeren voor eenvoudiger montage).
- Assembleren membranen in kamers (draag handschoenen geautoclaveerd tijdens de montage)
- Sluit de twee belangrijkste stukken van het frame met een enkele schroef.
- Flip de frame over en plaats een membraan op de top, zodat de gelatine-gecoate zijde gezichten in de richting van het frame (het patroon gebied moet worden in het midden).
- Bevestig de membraan aan het frame met behulp van een pakking aan beide kanten.
- Druk op de afdichtingen in, met behulp van zachte, gelijkmatige druk, om niet aan het membraan rippen.
- Bevestig gemonteerd frame om T-bar.
- Flip het frame en plaats in de kamer op zijn kop. UV achterkant van het frame en membraan gedurende 30 minuten
- Weer flip het frame, en schroef in kamers (geen verandering voor de controle kamer, maar voor stretch kamer, moeten twee schroeven te gebruiken om het eindstuk van het frame aan de onderkant van de kamer hechten, en de noodzaak om de enkele schroef die is te verwijderen die de twee stukken van het frame samen). UV voorkant gedurende 30 minuten. Zorg ervoor dat de membranen volledig droog zijn voordat u doorgaat naar de volgende stap, of anders de cel oplossing kan off slip tijdens het zaaien.
- Zaad cellen. Oppervlakte van een plaat = Ruimte van 3 membranen, dus gebruik 1 / 3 van een confluente plaat per membraan. Gebruik 1 ml oplossing per cel membraan. Nog meer dan 1,5 ml zal het moeilijk zijn om de oplossing te houden. Zet cel oplossing alleen op patronen gebied, en gebruik de pipet tip om de oplossing rond te verspreiden. Cover kamers en laat cellen hechten gedurende 30 minuten RT in de motorkap.
- Verhuizen kamers te incubator en laat de cellen hechten voor een meer uren. Wees ZEER voorzichtig het verplaatsen van de kamers om te voorkomen dat mobiele oplossing afglijden! De cellen in die kamer zal worden geruïneerd als de oplossing valt op dit punt.
- Keer terug naar kamer kap en voeg 20 ml media.
- Plaats kamers in alcohol gereinigd kuip die is afgedekt met aluminiumfolie (ook bespoten met alcohol). Verhuizen kamers te incubator (10% CO 2) stretch.
- Veilige kamers in stretch machine. Laat 's nachts verder cellen hechten, en start languit op de volgende dag. (Opmerking: Als de kamers in de rekken machine, vergeet niet om de machine te vergrendelen in de "nul" positie voor het plaatsen van kamers, en vervolgens de rubberen band rond de versnellingen draai Vergeet niet om de tandwielen te ontgrendelen voordat u de machine.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Banes et al.. eerst gemeld van het gebruik van een systeem voor mechanische stimulatie van de cellen in vitro met behulp van een flexibele elastomeer substraat om mechanische kracht te leveren aan cellen 1. Sinds die tijd zijn er veel variaties op dit ontwerp is bedacht en benut. Verschillende mechanische stretch-systemen zijn commercieel verkrijgbaar onder de naam "Flexercell" (Flexcell International Corp), terwijl sommige laboratoria gebruiken custom-built-apparaten. In deze video protocol hebben we beschreven de setup en het gebruik van een dergelijk apparaat in ons lab.
De custom-built "stretch machine" afgebeeld in dit protocol is gebruikt in verschillende studies naar de effecten van de eenassige cyclische belasting van verschillende celtypen 2,3 onderzoeken. Deze machine is een veelzijdig apparaat met een aantal instelbare parameters die gebruikt kunnen worden voor een verscheidenheid aan mechanische belasting studies. De setup hierin afgebeeld vertegenwoordigt een unieke en robuuste methode voor het leveren van eenassige cyclische belasting het aanhangend cellen in cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
