Summary
Este video muestra una técnica eficaz para la diferenciación y la disección de las diferentes estructuras semi-transparente del cuerpo humano en el vítreo posterior ojos mortem.
Abstract
El humor vítreo es un ópticamente transparente, la matriz extracelular de colágeno que llena el interior del ojo y se superpone a la retina. 1,2 interacciones anormales entre las subestructuras de vítreo y la retina la base de varias enfermedades vítreo-retiniana, incluyendo desgarro retiniano y desprendimiento, pliegue macular, agujero macular, relacionada con la edad degeneración macular, la tracción vitreomacular, vitreorretinopatía proliferativa, retinopatía diabética proliferativa, y vitreoretinopathies heredado. 1,2 La composición molecular de las subestructuras del vítreo no se conoce. Dado que el cuerpo vítreo es transparente con el acceso quirúrgico limitado, ha sido difícil de estudiar sus subestructuras en el nivel molecular. Hemos desarrollado un método para separar y conservación de estos tejidos para análisis proteómico y bioquímicos. La técnica de disección en este video experimental muestra la forma de aislar a base del vítreo, hialoidea anterior, vítreo núcleo y la corteza vítreo de ojos de cadáver. Una dimensión SDS-PAGE análisis de cada componente vítreo mostró que nuestra técnica de disección resultó en cuatro perfiles de proteínas único correspondiente a cada sub-estructura del cuerpo vítreo humano. Identificación de proteínas diferencialmente en compartimientos revelará las moléculas candidatas subyacente de diversas enfermedades vítreo-retiniana.
Protocol
1. La disección del segmento anterior.
- La córnea se elimina en primer lugar hacer una incisión en el limbo en la cámara anterior con una hoja de 15 ° (Figura 1). A continuación, una hoja de curva escleral córnea-tijera se introduce en la cámara anterior. Cortes circunferenciales se hacen en la córnea, justo por delante del limbo.
- 0,12 Colibri pinzas y tijeras Westcott se utilizan para cortar la circunferencia anterior del iris en el cuerpo ciliar.
- El núcleo del cristalino se extrae con pinzas de 0,12 Colibri o una cuchilla de 15 ° (supersharp) y la corteza y la cápsula con las pinzas.
2. La aspiración central del vítreo.
- Una aguja de calibre 23 en una jeringa de 5 cc se inserta en la mitad de vítreo (Figura 1).
- Aproximadamente 1 ml o más de núcleo vítreo es aspirada suavemente.
- La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido.
3. La disección hialoidea anterior.
- La hialoides anterior se ve como un anillo semi-transparente, mediante el ajuste de la luz incidente de una luz de gallina microscopio cuello. Aspiración previa de la base del vítreo se separa la hialoides anterior de otras estructuras para facilitar su identificación.
- La hoja de tejido elástico se hala cuidadosamente lejos del cuerpo ciliar con Colibri o fórceps vestirse y cortarse con tijeras Vannas. Esta maniobra se repite.
- La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido.
4. Disección base del vítreo.
- Utilizando unas pinzas 0,12 para estabilizar el ocular, tijeras Westcott se utilizan para "flor" a los ojos, haciendo cuatro equidistantes para aliviar el estrés cortes del cuerpo ciliar hacia la cabeza del nervio óptico.
- La pars plicata del cuerpo ciliar (Figura 2) se elimina de cada uno de los cuadrantes con tijeras de Westcott.
- La base del vítreo se amarra a ambos lados de la ora serrata con unas pinzas sobre la pars plana y la retina (Figura 2).
- La tracción continua sobre la base del vítreo se aplica con las pinzas. Corte con tijeras de Westcott secuencial extractos de un pañuelo de papel semi-transparente, con un "collar de perlas", aspecto que se extirpa.
- La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido.
5. Eliminación de la corteza vítrea.
- La pars plana se extirpa de cada uno de los cuadrantes con tijeras de Westcott mediante la reducción de la hoja de aproximadamente 3 mm por detrás de la ora serrata (Figura 2).
- Entre los prospectos de tejidos, la corteza del vítreo se visualiza como una película semi transparente.
- La película elástica está bien agarrado con pinzas de 0,12 o en poder de la adhesión a una esponja Weck-Cel quirúrgica. La corteza del vítreo se tira a la retina y corta con tijeras Westcott (Figura 1).
- La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenan a -80 ° C hasta el momento utilizados para la experimentación.
6. Resultados representante
Las muestras de tejido puede ser procesado por una variedad de métodos para experimentos específicos. En nuestro caso, las muestras fueron enviadas para análisis de proteínas por SDS-PAGE (Figura 3).
Figura 1. Corte transversal del ojo humano que representa subestructuras diferentes partes del cuerpo vítreo. El humor vítreo más anterior es una fina capa de colágeno llamada la hialoides anterior. El núcleo vítreo comprende toda la región central del cuerpo vítreo. Esta parte del vítreo es más acuosa, en contraste con la base del vítreo, que es viscoso, lo suficiente como para ser captado por los fórceps y se une firmemente con el cuerpo ciliar y la retina subyacente. Que abarca el núcleo vítreo es un shell de colágeno muy fino llamado la corteza del vítreo.
Figura 2. Anatomía base del vítreo. La base del vítreo es una subestructura semi-transparente del cuerpo vítreo, situado a lo largo de la ora serrata (flechas blancas), que es la línea divisoria que separa el cuerpo ciliar y la retina. El borde anterior de la base del vítreo se extiende sobre la pars plana (línea blanca) del cuerpo ciliar. El borde posterior de la base del vítreo se extiende de 2 a 3 mm por detrás de la ora serrata (tablero blanco). Para extirpar la base del vítreo, fórceps se utilizan para agarrar el tejido y tire de ella fuera del cuerpo ciliar y la retina subyacente. Una vez elevada, tijeras Westcott se utilizan para cortar a lo largo de la base.
Figura 3. Una dimensión SDS-PAGE de los elementos del cuerpo vítreo. Concentración de proteínas totales de la hialoides anterior, base del vítreo, vitnúcleo vítreo, y la corteza vítrea fueron 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 mg / ml, respectivamente. Electroforesis en gel se realizó en 200 kV durante 45 minutos, se tiñeron con Flamingo (Bio-Rad), y se visualizan mediante un sistema de VersaDoc imágenes (Bio-Rad). Los perfiles de los diferentes tejidos muestran varias bandas similares, lo que indica de conservación o la contaminación cruzada de las proteínas, así como bandas únicas (asterisco), lo que indica proteínas diferencialmente localizados.
Discussion
El cuerpo vítreo es un gel semi-transparente, cuya composición molecular es poco conocida, especialmente en el ámbito de sus subestructuras: la base del vítreo, el núcleo, la corteza y hialoidea anterior. El núcleo vítreo contiene colágeno II, V, IX y XI, junto con el sulfato de condroitina proteoglicanos, proteoglicanos heparán sulfato, y ácido hialurónico. 1,2 biomarcadores de proteínas en el núcleo vítreo se han asociado con enfermedades como la retinopatía diabética. 3.5 ¿Cómo estas proteínas se expresan diferencialmente en cada una de las subestructuras, y en muchos casos las identidades de proteínas específicas, no se conocen. Estos detalles pueden dar una idea sobre el origen de las proteínas asociadas con enfermedades específicas vítreo-retiniana y ayudar a las terapias blanco en el futuro. Aunque el mensaje óptimo intervalo mortem para la disección de los tejidos no se ha determinado, la degradación de proteínas puede afectar a los experimentos posteriores. Por ejemplo, la inmunohistoquímica se ve afectado en los ojos postmortem de 12 horas y algunas actividades enzimáticas específicas se puede reducir en unas pocas horas (observaciones no publicadas). Todos los tejidos de este estudio fueron recogidos entre 2 y 8 horas de la muerte, sin cambios significativos en la expresión de la proteína o la idoneidad para analsyis proteómica. El método de congelación de nitrógeno líquido de conservación se elige sobre la fijación con el fin de evitar que pequeños cambios en la estructura de las proteínas causada por fijador de reticulación, que se ha demostrado en otros tejidos por LC-MS/MS. Seis estudios proteómicos dependerá de la capacidad de precisión analizar los diferentes compartimentos del vítreo, como se demuestra en este experimento de vídeo. Hemos validado la técnica de disección con una dimensión SDS-PAGE. A medida que nuestros resultados sugieren, que se expresan diferencialmente en las proteínas de las subestructuras de diversas partes del cuerpo vítreo. La identificación de estas proteínas proporcionan una comprensión más detallada de la compartimentalización del vítreo.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El financiamiento fue proporcionado por la lucha por la vista. Los tejidos fueron obtenidos a partir del Banco de Ojos Iowa Leones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5-cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Straight Dressing Forceps With Serrations | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| 23 gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Castroviejo angled corneal scissors | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas Curved Capsulotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Westcott Curved Tenotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3320 |
References
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