Summary
Bioimaging métodos utilizados para avaliar biodistribuição das células de nanopartículas são aplicáveis para monitorização terapêutica e de diagnóstico de compostos nanoformulated. Os métodos descritos neste documento são sensíveis e específicos, quando avaliada por coregistration histológica. As metodologias de fornecer um caminho de translação de roedores para aplicação em seres humanos.
Abstract
Nanomedications pode ser transportado por pelo sangue de monócitos-macrófagos no sistema retículo-endotelial (RES; baço, fígado, linfonodos) e para acabar com os órgãos. Estes últimos incluem o pulmão, RES, e do cérebro e estão operacionais durante o vírus da imunodeficiência humana tipo um (HIV-1) infecção. Entrada de macrófagos nos tecidos é notável em áreas de replicação do HIV-1 ativa e locais de inflamação. A fim de avaliar o potencial de macrófagos como nanocarriers, óxido de ferro superparamagnético-e / ou drogas partículas carregadas foram revestidas com tensoativos parenteral injetado em camundongos HIV-1 encefalítico. Isto foi feito para uma avaliação quantitativa de partículas e biodistribuição de drogas. Ressonância magnética resultados (MRI) de teste foram validados pelo coregistration histológica e de processamento de imagem melhorada. Doença de órgãos como tipificado pela histologia alterada do cérebro foram avaliadas por ressonância magnética. A demonstração da migração robusto de nanoformulations em áreas de encefalite focal fornece "prova de conceito" para o uso de técnicas avançadas de bioimaging para monitorar a migração de macrófagos. Importante, aberrações histopatológico no cérebro se correlacionam com parâmetros bioimaging fazendo a utilidade geral da RM em estudos de distribuição das células na doença viável. Postulamos que o uso de tais métodos pode fornecer um índice em tempo real de carga da doença ea eficácia terapêutica com potencial de translação para os seres humanos.
Protocol
1. Introdução
A entrega seletiva de drogas e macromoléculas terapêutica (peptídeos, proteínas e ácidos nucléicos) para sites de celular e tecidual da doença ativa e infecções microbianas em curso irá melhorar as respostas farmacêutica durante a doença 1-3. Um site particular celular é o macrófago, que é altamente móvel e imune envolvente e consistente é um alvo principal para o vírus da imunodeficiência humana (HIV). 4 É importante ressaltar que a inflamação macrófagos envolvidos também está subjacente uma ampla gama de distúrbios que incluem degenerativas, inflamatórias, infecciosas e doenças cancerosas; e mobilidade da célula para progressão da doença subjacente locais de lesões de tecidos 09/05. Importante, o uso de macrófagos pelo sangue como drogas, macromolécula, e portadores de sinal ganhou atenção recentemente por seu potencial de translação. No entanto, uma obstrução significativa na realização do potencial terapêutico é a barreira hematoencefálica (BBB), entre as barreiras outros tecidos que são impermeáveis a um espectro de macromoléculas e proteínas. Essas barreiras, no entanto, não permitir a passagem de células. Todos juntos projeta-se que no curso natural da doença macrófagos periféricos que as barreiras de bypass pode transportar drogas formulado, marcadores, e peptídeos aos locais de infecção ou inflamação. No entanto, tais tecnologias permanecem apenas em desenvolvimento. É através de nossas obras que mediada por células de entrega pode ser desenvolvida para aplicações diagnósticas e terapêuticas e aplicações, tais são suportados pelo laboratório e modelos animais de doenças humanas 10-12.
2. Preparação de nanomateriais
Preparação de nanomateriais para a entrega da droga e estudos de biodistribuição é o tema de um manuscrito paralelo nesta edição (manuscrito paralelo de referência). Todos os procedimentos para a fabricação de nanopartículas cristalinas são realizadas em uma capela de fluxo laminar. Todas as superfícies são desinfectados antes da sua utilização com álcool a 70%. Isto inclui a superfície de trabalho, o exterior de luvas e de todos os derramamentos. Todos são cobertas com solução de álcool 70% replicar imediatamente com toalhetes. Luvas são descartados após o uso e não são usadas quando entrar em qualquer área de laboratório. Excipiente, de drogas, água estéril com / reagentes contendo qualquer / todos para a fabricação de drogas carregadas de partículas são postos em áreas de trabalho, quando necessário para os procedimentos. Pipetas estéreis embalados são usados apenas e descartados após o uso em um recipiente de resíduos de risco biológico. O aparelho molhado dispostos é desinfetada com álcool antes e após o uso. Área de trabalho é limpo imediatamente antes e depois com álcool a 70%. Solução de nanopartículas é testado para pirogênio, em conformidade com as diretrizes da FDA para avaliar a ausência de endotoxina bacteriana em soluções de drogas de partículas utilizados para os animais. Brevemente,
- Nanoformulations candidato para uso in-vivo são replicadas através da substituição do núcleo de drogas ou de gotículas com uma partícula de tamanho idêntico ou um pedaço moído de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) antes do revestimento com o surfactante apropriado.
- Isso é seguido por medidas de carga, tamanho, forma e citotoxicidade para determinar se o sistema modelo SPIO tem as mesmas propriedades do medicamento candidato nanoformulated.
- Finalmente, ensaios de carga da pilha são realizados por incubação com o modelo nanoformultation SPIO candidato, a fim de determinar a relaxação dentro das células usando fantasmas composto de células marcadas suspensas em gel de agar. Fantasmas são preparadas em triplicata e são preparados em uma série de concentrações, a fim de quantificar a relaxação devido à absorção SPIO nas células. Isto proporciona um índice de sensibilidade e determina se o nanoformulations podem afetar o estado de oxidação e, portanto, a visibilidade do SPIO em ressonância magnética (RM).
3. Métodos e Procedimentos: Preparação de Animais
- Injecções / cateteres. Dependendo do tempo de interesse, as injeções podem exigir o uso de um cateter para injetar o animal dentro do MRI. Cateteres são preparadas usando uma agulha não-magnético e uma extensão de tubulação com diâmetro mínimo para minimizar o espaço morto na linha de injeção. O cateter deve ser pré-carregada com qualquer solução que contém o nanomaterial a ser injetado ou salina, dependendo do espaço morto eo volume total aceitável da injeção. Se possível, a injeção pode ser seguido com um flush salina fisiológica. Se os tempos de aguda não são de extrema importância, uma verificação de pré-pode ser executada, ea injeção pode ser feito fora do magneto em um tempo pré-determinado antes do acompanhamento scans de medidas biodistribuição. Cateteres são normalmente introduzida na veia da cauda para a IV injeções.
- Anestesia e monitoramento. Antes da digitalização, o animal é colocado em uma câmara para induzir a anestesia. Esta câmara é pré-carregada com o isoflurano 1,5% em 70% nóxido itrous e oxigênio 30%, a fim de acelerar o início da anestesia no animal e minimizar a quantidade de tempo necessário para garantir que o animal não vai acordar após a remoção da câmara. Uma vez que o animal está totalmente anestesiado, o animal é removido da câmara e colocadas no suporte estereotáxica equipados para monitorar a taxa de respiração e temperatura do animal, enquanto continua a fornecer isoflurano durante a configuração e digitalização.
- Os detentores dos animais e ajuste: Set-up inclui lubrificante olho para proteger contra úlceras de córnea. O animal é levemente envolto com gaze e gaze é gravado no local para minimizar a perda de calor durante a digitalização e para fornecer uma pressão positiva contra o monitor de respiração. Detentores de animais são equipados com barras de dentes ajustáveis, permitindo o alinhamento vertical e horizontal da cabeça. Isto é particularmente importante para alto campo de ressonância magnética, como angulação da cabeça em sentido caudal-rostral causará dificuldades adicionais com a falta de homogeneidade do campo magnético devido à susceptibilidade magnética. Não homogeneidade do campo magnético é deletério para alta qualidade T 2 * MRI, bem como 1 H espectroscopia por ressonância magnética (1 H MRS) e ressonância magnética difusão tensor imaging (DTI). Além de posicionamento adequado do ângulo da cabeça na direção caudal-rostral, as rotações da cabeça deve ser evitado na medida em que é viável. Permitindo a rotação do titular animal no ímã prevê compensações para rotações menores, o que pode ocorrer a partir de animal para animal. Isto pode ser minimizado pela colocação cuidadosa da cabeça e atenção para a angulação antes de inserir o animal no sistema de ressonância magnética.
- Calibração e calços: Uma vez que o animal está no suporte e bobina de superfície é adequadamente colocado na cabeça, a posição inicial do animal é determinado por um tempo real de leitura unidimensional na direção caudal-rostral. Sinal é restrito à área em torno da bobina de superfície utilizada para a recepção, limitando a necessidade de interpretação das formas de onda observados. Uma vez que a posição inicial é determinada, uma imagem localizador 3-plano é levado para determinar a posição exata do animal no scanner e para permitir o movimento para a localização exata necessária para a digitalização (s) de interesse. Isto é seguido pelo ajuste da homogeneidade do campo magnético ou "calços" o ímã. Isto é feito através do mapeamento da distribuição do campo e do cálculo de uma correcção precisamente determinada espaciais baseados em respostas medidas de uma série de eletroímãs ou "bobinas shim" dentro do sistema projetado para ajustar a homogeneidade de campo. Calços é realizado usando uma seqüência de eco multi-gradiente e software de mapeamento desenvolvido pelo Dr. Hetherington 13. Regiões de homogeneidade são compatíveis com a região examinada por cada método de imagem individual. Uma vez calçamento está completo, podemos adquirir o scan (s) de interesse do animal.
4. Aquisição de Dados
- Alta Resolução T 2 * MRI ponderado. Biodistribuição das nanopartículas contendo SPIO pode ser determinado através da detecção de regiões de perda de sinal em alta resolução 3D T 2 * MRI ponderado. A região do cérebro é determinado a partir dos scans localizer e prescritos nos exames localizador ou varreduras adicionais, conforme necessário. AT 2 * scan RM ponderada com 150 resolução isotrópica micron é então adquirido. A alta resolução 3D lembrou gradiente echo exame de ressonância magnética da cabeça de rato é adquirido através de um volume de 25 milímetros bobina gaiola com parâmetros de aquisição de tempo de eco = 5 ms, tempo de repetição = 50 ms, 30% de eco, ângulo de inclinação = 35 graus, em média = dois de campo, de vista = 20 x 20 x 20 mm com uma resolução de 128 x 128 x 128 (voxel size = 150 x 150 x 150 M 3), tempo de aquisição total = 30 min.
- Difusão Tensor Imaging (DTI): imagens do tensor de difusão são medidas quantitativas da direção e magnitude da difusão da água dentro das células do tecido. Como resultado, a fase do sinal é extremamente suscetível ao movimento, como os exames são sensibilizados ou "ponderada" para o movimento de água microscópicas. Como resultado, as aquisições único tiro são desejados para evitar deslocamentos de fase entre as aquisições de causar manchas de sinal, e gating respiratório é necessário para impedir o movimento bruto durante a aquisição de sinal. Portanto, um respiratório gated spin-eco ponderada difusão echo planar imaging (EPI) seqüência MR é empregado. Mais uma vez, calçar a região das varreduras é muito importante, pois fora de ressonância efeitos durante a evolução do sinal faz com que o registro incorreto de a freqüência do sinal e, portanto, posição, no plano da imagem. Parâmetros EPI aquisição incluiu 14 fatias, 200 kHz, 96 x 96 na aquisição de avião zero-preenchido para 256 x 256, e uma espessura de corte de 0,5 mm. A codificação de difusão utilizado foi equilibrada, o esquema de polaridade rotacionalmente invariante e alternada icosaédrico (12 direçõesções) 14,15. O esquema de codificação foi projetado para reduzir a difusão de fundo gradiente acoplamentos 16. Ponderação difusão b-fator = 800 mm -2 s, δ = 4 ms, Δ = 15 ms, Gdmax = 40 G / cm, 200 mS tempo de subida, 7 médias para b = 0 a aquisição, 3 médias para cada b = 800 a codificação direção, por um tempo total de aquisição de 20-40 min, dependendo da taxa de respiração.
- Localizada 1 H espectroscopia por ressonância magnética (1 H MRS): 1 H MRS pode ser obtido a partir de regiões do cérebro prescritos em imagens adquiridas durante a sessão de imagem mesmo. Localizações anatômicas são encontrados em imagens de prescrever a região de interesse para a aquisição de espectros. Uma vez que a região é identificada, calços é realizada em uma região correspondente ao volume de aquisição, verificada usando um espectro de água localizada. Então, o poder dos pulsos de supressão de água são otimizados, a freqüência de água é medido para assegurar a ressonância sinal de água, e um espectro pequeno teste é adquirido para fornecer controle de qualidade. Se espectros são de qualidade insuficiente, configurações do sistema, inclusive a radiofreqüência de potência (RF) e as configurações de calço, são verificados. Finalmente, se a qualidade ainda é insuficiente, um localizador três avião-segundo é executado para garantir que o animal não se moveu de os exames iniciais. Em nossa experiência, isso proporciona um alto grau de reprodutibilidade e precisão para aquisições espectroscópicas. Finalmente, os espectros são adquiridos em blocos curtos, com a redefinição do sistema de freqüência entre as aquisições para eliminar os efeitos da deriva do campo magnético e para garantir a reprodutibilidade e qualidade dos scans final. No final da aquisição, um espectro único pulso de água em um ganho pré-amplificador predefinido é utilizado como referência quantitativa sinal de amplitude.
- Histologia e Blockface Imaging: Após a sessão de digitalização final MRI da série histórica de experimentos, o mouse é perfundido, o cérebro é removido e incorporado em um bloco de outubro, composto que tem sido escurecida usando uma gota de tinta nanquim. O bloco é colocado em um criostato para fatiar e análise histológica. Blockface imagens são adquiridas usando uma câmera digital (Canon EOS 300D Digital Rebel com uma Canon EFS Ultrasonic 60 milímetros f/2.8 Macro USM) montado na frente do criostato com uma montagem personalizada e acionado por um interruptor remoto. Imagens digitais são adquiridas a cada 50 micrômetros através do volume do cérebro inteiro. Fatias são numeradas para permitir o registo dentro do volume após o processamento histológico e coloração. Blockface fatias individuais foram alinhadas para reconstruir o volume 3D usando o bloco de esboços para explicar jitter na posição da cabeça criostato. O volume do cérebro é então automaticamente segmentado utilizando o algoritmo de semente região com base em crescimento no pacote de software Analyze (AnalyzeDirect, Lexena, KS).
5. Análise de Dados
- Detecção SPIO usando ressonância magnética: SPIO causa perda de sinal em T 2 * RM ponderada; marcador e, como tal, o vazio sinal de RM é um sensível, mas não específicos para SPIO presença no tecido. A sensibilidade é dependente da resolução espacial da ressonância magnética e do tamanho da partícula SPIO, com uma partícula de tamanho único mícron detectado com 100 resolução isotrópica micron. Nestes trabalhos, a 150 micron resolução isotrópica com 200 nanômetros de tamanho de partículas SPIO são usados. Para fornecer tanto a sensibilidade e especificidade para a presença de SPIO no cérebro, os ratos foram digitalizadas antes da injeção das células SPIO rotulados para permitir que as imagens de subtração a ser utilizado para a identificação positiva das células do cérebro em pontos depois do tempo. Scans 3D MRI foram subimaged usando o método set limitado nível desenvolvido em nosso laboratório como descrito anteriormente 17. Volumes cerebrais Subimaged foram, então, co-registrados, a intensidade do sinal normalizado, e os volumes subtraídos para detectar regiões dentro do volume do cérebro com perda de sinal (presença de SPIO), que não foi ao longo das bordas para eliminar falso sinal positivo de quaisquer erros de registro subpixel.
- Coregistration de Histologia e RM: Coregistration entre histologia e RM foi realizado usando a imagem blockface como uma referência comum. Esta abordagem reduz a complexidade do problema principal de corrigir a retração assimétrica de fatias de tecido durante a preparação e coloração para um problema bidimensional, tal como descrito em nossos trabalhos anteriores 18,19. Aqui, a ressonância magnética ea histologia detecção de macrófagos contendo em SPIO cérebro mostraram correlação espacial excelente, com uma superestimativa do volume esperado pela perda de sinal de MRI e de maior sensibilidade para algumas células demonstrado pela histologia 12. Precisas co-localização destes dois sinais fornece uma medida da precisão de coregistration e distorção da histologia de volta para as formas originais das fatias.
- Região de Interesse (ROI) Análises de DTI: scans DTI são tipicamente analisados pela seleção de um ROI anatômicas para determine as propriedades de difusão média do tecido em uma subestrutura anatômica particular.
Análises da difusão ponderado de dados são realizados utilizando programas personalizados escritos em IDL (Interactive Data Language, Information Solutions ITT Visual, Boulder, CO), como descrito anteriormente 15,20. Análises produzir mapas do difusividades tensor (λ 1, λ 2, λ 3), difusividade média (D av) onde: D av = (1 + λ λ λ 2 + 3) / 3 e anisotropia fracionada (FA), onde:
Transversal (λ ⊥ = (λ 2 + λ 3) / 2) e longitudinal (λ ll = λ 1) componentes do tensor de difusão foram obtidos conforme já descrito 21. Uma vez que os mapas são construídos, ROIs são desenhadas no T 2 sobrepostos RM ponderada com cores codificadas λ 1 mapas direcionalidade. Exemplos das regiões escolhidas para análise no modelo do rato HIV são apresentados na Figura 1. - Análise espectroscópica: A quantificação dos compostos metabólicos que contribuem para os picos do cérebro 1 H MRS é determinada usando um de uma variedade de métodos de ajuste de curva. Uma variedade de técnicas de ajuste de curva têm sido desenvolvidos. Em nosso laboratório, utilizamos um método de ajuste de tempo de domínio (QUEST) 22 no pacote de processamento jMRUI 23 sinal de que é uma combinação linear de espectros metabólito individuais que contribuem para o espectro final. Usamos uma base conjunto de 22 metabólitos individuais como possíveis fatores contribuintes. Os espectros de base são simuladas e verificada utilizando o espectro de soluções de metabólitos individual. Um exemplo de um resultado de ajuste da curva a partir de um único espectro é mostrado na Figura 2.
6. Resultados representante
Exemplos de DTI e 1HMRS são mostrados nas figuras 1 e 2. Exemplos adicionais de 1H MRS 24-26 e 27 DTI resultados podem ser vistos nas nossas publicações anteriores. Exemplos de preinjection T 2 * MRI ponderado com uma sobreposição da localização das células marcadas em amarelo é mostrado na Figura 3. O rato tinha marcado monócitos macrófagos derivados injetado na veia da cauda. Cinco dias depois, T 2 * MRI ponderado foi adquirida e processada como descrito acima. O rato foi preparado pela injeção de infectados pelo HIV macrófagos humanos no cérebro, que é visto como uma linha de monócitos do mouse detectado macrófagos derivados. Outros exemplos de ambos, detecção de células marcadas e coregistration com histologia pode ser vista em nossas publicações anteriores 10,12.
Figura 1. Representação de regiões analisadas para métricas de DTI.
Figura 2. Encaixe espectroscópicas usando QUEST na suíte de processamento de sinal jMRUI.
Figura 3. Detecção de células SPIO rotulados migrando do sangue periférico em uma região do cérebro com encefalite focal. Posições de células (amarelo) fatias overlay representante de uma T 2 * aquisição de RM ponderada conforme detalhado no texto.
Discussion
O registro preciso da histologia com resultados in-vivo de imagens é um passo crítico no desenvolvimento de biomarcadores de imagem para detecção e estadiamento da doença neuronal. Algumas métricas de imagem são susceptíveis de ser correlacionado com alterações morfológicas bruta incluindo mudanças nas propriedades magnéticas de relaxamento do tecido utilizado para detectar a presença de doença na substância branca e câncer. Outros métodos mais sutis, como a DTI, são susceptíveis de detectar precocemente alterações celulares que podem não ser detectável como alterações histológicas causadas pela doença não aparecem até mais tarde, os estágios da doença. Ainda outros marcadores, como marcadores espectroscópicas, podem ser indicadores de alterações precoces e reversíveis, que precede até mesmo as mais sutis alterações celulares.
Biodistribuição pode ser determinada de forma não invasiva usando uma variedade de métodos. O principal métodos não-invasivos são a tomografia por emissão de pósitrons (PET), emissão de fóton único tomografia computadorizada (SPECT), imagem óptica, e RM. Medicina nuclear baseada imagem (PET e SPECT) têm sido utilizados ao longo dos anos para biodistribuição muitos, mas estes métodos são limitados pela meia-vida de radiotraçadores utilizados para a rotulagem dos compostos ou os nanomateriais, especialmente para os traçadores PET. Imageamento óptico pode ser utilizado para pequenos roedores, mas não pode ser traduzido para uso humano, exceto para as regiões de fácil acesso, tais como tumores superficiais, devido à absorção de luz e espalhamento de luz. Além disso, é difícil quantificar os sinais ópticos por essas mesmas razões. MRI usa tags persistentes como SPIO que podem ser rastreados no corpo durante um período de semanas. Isto, também, deve ser usado com cautela, como o rótulo pode ser transferido para diferentes células ou ser reabsorvido pelo corpo.
Especificidade de detecção de SPIO na ressonância magnética podem ser fornecidos por uma variedade de métodos. Métodos de detecção, que fornecem sinais positivos como negativos, são usados para melhorar a especificidade da ressonância magnética para detectar a presença de SPIO no tecido. O método de subtração utilizado neste trabalho tem sido usado por outros, bem 28. Outras abordagens incluem a detecção de ressonância 29-31, fase de imagem sensível que produz um padrão particular perto vazios SPIO 32, e zero imagem tempo de eco que usa ponderação T1 para produzir uma intensidade de sinal positivo na região de SPIO 33. O avanço desses métodos para melhorar a quantificação de etiqueta, sensibilidade e especificidade é uma área de pesquisa ativa atualmente.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho foi suportado por concessões 1K25MH089851, 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15.635, P01MH64570 e P01 NS43985 do National Institutes of Health. Os autores agradecem a Sra. Robin Taylor para a leitura crítica do manuscrito e suporte gráfico e literário em circulação. Os autores também gostariam de agradecer a Erin McIntyre, Melissa Mellon, e Lindsay arroz para o seu suporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | |||
| Medical Oxygen | |||
| Isoflurane vaporizer | |||
| Rodent gas anesthesia mask | |||
| MRI compatible Stereotactic head holder | |||
| Syringe | |||
| Polyethylene catheter tubing | |||
| Non-magnetic needle | |||
| Eye lubricant | |||
| Gauze | |||
| Tape | |||
| Perfusion media | |||
| OCT compound for embedding tissue | |||
| MRI system | |||
| Digital Camera | |||
| Tissue Sectioning Cryostat |
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