Summary
用于评估细胞生物分布的纳米粒子的生物成像方法适用于nanoformulated化合物的治疗和诊断监测。病理coregistration评估时，此处所描述的方法的敏感性和特异性。该方法提供了一个从啮齿类动物对人类应用的翻译途径。
Abstract
Nanomedications可以通过血液传染的单核细胞 - 巨噬细胞，成网状内皮系统（RES，脾，肝，淋巴结）进行和结束机关。后者包括肺，RES和大脑，在人类免疫缺陷病毒（HIV - 1）感染的手术。值得注意的是在积极的HIV - 1复制和炎症部位的领域进入到组织中巨噬细胞。为了评估nanocarriers，超顺磁性铁氧化物和/或涂层与表面活性剂的药物载货颗粒的巨噬细胞的潜力，肠外注入HIV - 1病毒脑炎小鼠。这样做是粒子和药物体内分布的定量评估。磁共振成像（MRI）的测试结果进行了验证，通过组织学coregistration和增强的图像处理。器官的疾病，如脑组织学改变为代表的MRI评估。 nanoformulations强劲迁移到局灶性脑炎等领域的示范规定“利用先进的生物成像技术监测巨噬细胞迁移的”概念证明“。更重要的是，在脑组织病理学异常相关疾病可行的细胞分布的研究一般实用的MRI与生物成像参数。我们断定，使用这种方法，可以提供实时翻译潜在人类疾病负担和疗效指数。
Protocol
1。简介
选择性的活动性疾病的和持续的微生物感染的细胞和组织的网站提供的药物和治疗大分子（多肽，蛋白质和核酸）将提高1-3在疾病的药品反应。网站是一个特定的细胞巨噬细胞是高度流动和免疫从事的主要目标是一致的人类免疫缺陷病毒（HIV）。，重要的是，巨噬细胞参与炎症也退行性，炎症，感染性的疾病，包括范围广泛的基础和癌变的疾病和细胞的流动性疾病的网站背后的组织损伤5-9进展。更重要的是，使用药物，高分子和信号运营商的血源性巨噬细胞，其翻译的潜力已经获得了最近受到关注。然而，在实现治疗潜力的重要障碍是血脑屏障（BBB）的除其他组织的障碍，滴水不漏的大分子和蛋白质谱。然而，做这些障碍，允许细胞传代。所有一起，它预计，在周边的巨噬细胞疾病，绕过障碍，可以进行感染或发炎的部位制定的药物，标记和肽的自然过程。然而，这种技术只停留在发展。 10-12人类疾病的实验室和动物模型的支持，可用于诊断和治疗等应用和应用开发，细胞介导的交付，这是通过我们的作品。
2。纳米材料的准备工作
药物输送和生物分布研究纳米材料的制备是在这个问题上的平行的手稿（参考并行手稿）的主题。结晶纳米粒子制造的所有程序都进行了层流罩。所有表面进行消毒，在使用前用70％酒精。这包括工作面上，手套外，任何泄漏。涵盖所有的复制70％的酒精溶液，立即用抹布。手套使用后丢弃，并没有进入任何其他实验室区域时穿。辅料，药品，无菌水/包含任何/所有试剂用于制造毒品载货颗粒只有带入工作区时，程序需要。仅用于无菌包裹移液器和成生物危险废物的容器，使用后丢弃。以下使用前用酒精消毒湿愿意仪器。工作区是立即清洗前，后用70％的酒精。纳米粒子的解决方案是在按照FDA的指导原则测试，以评估药物粒子的解决方案，用于对动物的细菌内毒素的情况下，热原。简单地说，
- 在体内使用的候选nanoformulations被复制取代具有相同大小的颗粒或精片的超顺磁性氧化铁（SPIO）涂装前适当的表面活性剂的药物核心或液滴。
- 其次是大小，电荷，形状，和细胞毒性，以确定是否超顺磁性氧化铁模型系统nanoformulated作为候选药物相同的属性的措施。
- 最后，细胞加载实验，以确定使用的标记细胞悬浮在琼脂凝胶组成的幽灵的细胞内的弛豫，与候选人的超顺磁性氧化铁模型nanoformultation孵化。 “幻影”一式三份，并准备在准备了一系列的浓度，以量化的弛豫由于超顺磁性氧化铁在细胞摄取。这提供了一个敏感指数，并确定是否nanoformulations可能影响氧化状态，并因此对超顺磁性氧化铁磁共振成像（MRI）扫描的知名度。
3。方法和程序：动物的制备
- 注射/导管。根据感兴趣的时间，注射可能需要使用导管内注入动物的MRI。使用非磁性的针和与最小直径的油管延伸，以尽量减少死腔注射线导管准备。导管应预填充注射或生理盐水，取决于死者的空间和总接受注射量的纳米材料的解决方案。如果可能的话，注射可能会遵循与生理盐水冲洗。如果急性倍的极端重要性，可进行预扫描，并注射液可在预定的时间完成磁铁外，前生物分布的措施跟进扫描。通常导管插入静脉注射尾静脉。
- 麻醉和监测。扫描前，动物被放入一腔麻醉诱导。该商会是预充70％，n与1.5％异氟醚itrous氧化物和30％的氧气，以加速麻醉在动物发病，并最大限度地减少所需的时间，以确保动物不会醒来后，从会议厅中取出。一旦动物完全麻醉，动物是从会议厅中删除，并放入配备监测动物的呼吸频率和温度的同时，继续在设置供应异氟醚和扫描立体持有。
- 动物持有人及调整事项：设置包括眼部润滑剂，以防止角膜溃疡。动物是轻轻用纱布包裹，纱布是到位的录音，在扫描过程中尽量减少热损失，并提供对正压呼吸监控。动物持有人都配备了可调齿棒，使头部的垂直和水平对齐。这是特别重要的高场MRI，头喙尾方向角与磁场的不均匀性，由于磁化率造成额外的困难。磁场的不均匀性是有害的高品质的 T 2 * 核磁共振的1 H核磁共振谱（1H MRS）和磁共振扩散张量成像（DTI） 。除了头喙尾方向角的正确定位，应避免头部转动的程度是可行的。允许在磁铁的动物持有人旋转，将提供轻微的旋转，这可能发生在动物的补偿。精心安置的头部和关注的角度插入的磁共振成像系统的动物之前，这可能会进一步减少。
- 校准和匀场：一旦动物是在支架上正确放置在头部表面线圈，动物的初始位置是确定的喙尾方向的一维实时读数。信号仅限于该地区各地接待使用表面线圈，限制解释观察到的波的形式的需要。初始位置确定后，3架飞机的航向拍摄图像，以确定在扫描仪的动物的精确位置，并扫描（S）的利息所需的确切位置，以便运动。其次是调整磁场的同质性或“垫补”磁铁。这是通过映射场分布和计算精确的确定的空间上的电磁铁系列或“调整领域的同质化系统内的”匀场线圈测量的响应校正。匀场是使用多梯度回波序列和制图软件，由博士赫瑟林顿 13开发完成。同质化的地区是每一个人的成像方法研究该地区相匹配。一旦垫补是完整的，我们可以从动物获得的利益扫描（S）。
4。数据采集
- 高分辨率T 2 *加权成像。高分辨率三维T 2 *加权成像检测信号损失的地区，可以由超顺磁性氧化铁含有纳米粒子的生物分布。的大脑区域是确定的航向扫描和需要本地化扫描或额外的扫描规定。 2 * 150微米的各向同性分辨率加权MRI扫描，然后收购。一个高分辨率的三维梯度回顾收购回声MRI扫描鼠标头是使用采集参数的回波时间为5毫秒，重复时间= 50毫秒，30％的回声，翻转角= 35度，平均25毫米鸟笼量线圈= 2，视野= 20 × 20 × 20毫米，分辨率为128 × 128 × 128（体素大小= 150 × 150 × 150 微米 ），共采集时间= 30分钟。
- 扩散张量成像（DTI）：扩散张量图像定量措施，组织细胞内水分子扩散的方向和幅度。因此，信号的相位是非常敏感的议案，扫描敏或“加权”微观水的运动。因此，单杆收购所需，以防止收购之间的相移，造成信号涂抹;和呼吸门控，以防止在信号采集总值的议案。因此，一个呼吸门控自旋回波弥散加权平面回波成像（EPI）的MR序列是聘用。再次，匀场的扫描区域是非常重要的，信号的演变过程的非共振效应导致的信号频率的位置不正，因此位置，在平面图像。 EPI采集参数包括14片，200 kHz带宽，在飞机收购零填充到256 × 256 96 × 96，和一个0.5毫米的切片厚度。所使用的扩散编码是一种平衡，旋转不变性和交替极性的二十面体计划（12方向tions）14,15。编码方案的目的是减少背景扩散梯度接头16。扩散加权B因子= 800毫米的小号-2，δ= 4毫秒，Δ= 15毫秒，Gdmax = 40 G /厘米，200μs的上升时间，7 B = 0的收购平均，平均每个B = 800编码方向，共采集时间为20-40分钟，这取决于呼吸速率。
- 本地化的1 H核磁共振光谱（1H MRS）：1 H MRS可从在相同的成像会议期间获得的图像规定大脑区域。解剖位置上的图像，以订明获取光谱感兴趣的区域。一旦确定了该地区，是一个匹配的收购量的地区进行垫补，检查使用本地化的水频谱。然后，水抑制脉冲电源进行了优化，是测量水的频率，以确保水共振信号，并获得一个简短的测试频谱，以提供质量控制。如果光谱质量不足，系统设置，包括射频（RF）功率和垫片设置，检查。最后，如果质量仍然不足，第二个3飞机航向是运行，以确保动物已经从最初的扫描移动。根据我们的经验，这的光谱收购的重现性和准确性提供了一个非常高的程度。最后，光谱获取重置与系统之间的收购频率磁场漂移，以消除影响，并确保最终扫描的重现性和质量在短期块。在收购结束时，在预定的前置放大器增益的单脉冲频谱水是用来作为一个定量信号的幅度参考。
- 组织学和Blockface影像后，最终在实验的时间序列MRI扫描会话，鼠标灌注，大脑和嵌入华侨城成块，复合使用一滴印度墨水已经变黑。该块被放入一个低温恒温器，切片和病理分析。 Blockface图像是使用数码相机（佳能EOS数码反叛300D佳能60毫米镜头USM微距镜头的超声波的EFS）安装在低温恒温器的前面，用一个自定义的装载和一个遥控开关触发的收购。整个脑容量的数字图像通过收购，每50微米。切片是组织学处理和染色后的登记编号，让内卷。个人blockface片对齐重建的三维体积，使用块概述了在低温恒温器头位置的抖动。大脑的体积，然后自动分段使用种子基于区域生长算法在分析软件包（AnalyzeDirect，Lexena，KS）。
5。数据分析
- 超顺磁性氧化铁检测使用MRI：超顺磁性氧化铁导致T 2 *加权成像信号损失，正因为如此，MRI信号无效是一个敏感的，但不具体组织的存在超顺磁性氧化铁标记。灵敏度是核磁共振成像扫描和超顺磁性氧化铁粒子的大小的空间分辨率，单一微米大小的粒子检测100微米的各向同性分辨率。在这些作品中，150微米与200纳米超顺磁性氧化铁颗粒各向同性分辨率。要提供超顺磁性氧化铁在大脑的灵敏度和特异性，小鼠扫描前注射超顺磁性氧化铁标记的细胞，以便在稍后的时间点减法图像在大脑中的细胞呈阳性的鉴定使用。 3D MRI扫描subimaged使用约束的水平集方法，在我们的实验室开发，正如先前所描述的17。 Subimaged大脑体积，然后配准，信号强度正常化，卷减去信号损失（超顺磁性氧化铁的存在），这是沿边缘不积极，以消除任何子像素登记错误的虚假信号检测与大脑的体积内的地区。
- Coregistration组织学和MRI检查：组织学和MRI之间Coregistration是通过使用一个共同的参考blockface形象。这种方法降低了纠正在制备过程中的不对称收缩和组织切片染色二维问题，因为我们在 18,19以前的作品中描述的主要问题的复杂性。在这里，超顺磁性氧化铁含有巨噬细胞在脑MRI和组织学检测表明良好的空间相关性，与预期高估MRI信号的损失和更大的敏感性少数细胞组织学12表明音量。这两个信号的精确定位提供了一个测量精度coregistration和组织学翘曲回片的原始形状。
- 利息率（ROI）分析，英国贸工部的地区：英国贸工部扫描通常是选择一个解剖的投资回报率determ分析国家统计局在一个特定的解剖下部结构的平均扩散性质的组织。
扩散加权的数据分析使用在IDL（交互式数据语言，ITT视觉信息解决方案，博尔德，一氧化碳），如前面描述的15,20编写的自定义程序执行。分析产生张扩散的地图（λ1，λ2，λ3），平均扩散系数（D AV） 其中：D AV =（λ1 +λ2 +λ3）/ 3和各向异性分数（FA），其中：
横向（λ⊥=（λ2 +λ3）/ 2）和纵向（λLL =λ1）获得其他地方21所描述的扩散张量的组成部分。地图一旦兴建，投资回报率上绘制T 2加权MRI颜色编码λ1方向性地图覆盖。图1展示了艾滋病毒的小鼠模型中进行分析选择的地区的例子。 - 光谱分析：促进脑的1 H MRS峰的代谢化合物的定量确定使用各种曲线拟合的方法之一。各种曲线拟合技术已经开发出来。在我们的实验室中，我们聘请jMRUI 23信号处理包，这是一个个别的代谢物谱的线性组合，最终频谱时域拟合的方法 （ QUEST）22。我们使用22个别代谢产物的潜在因素的基础。基础光谱模拟和检查使用的解决方案的个人代谢物的光谱。从一个单一的频谱曲线拟合结果的一个例子是如图2所示。
6。代表性的成果
英国贸工部和1HMRS的例子是在图1和2所示。 1H MRS 24-26和DTI 27个结果的其他例子可以看出，在我们以前的出版物。注射前T 2的例子*加权成像覆盖的黄色标记细胞的位置如图3所示。鼠标尾静脉注射标记的单核细胞衍生的巨噬细胞。五天以后，T2 *加权成像收购和处理描述的那样，以上。艾滋病毒感染人类巨噬细胞注射入脑，这是检测小鼠单核细胞衍生的巨噬细胞，鼠标准备。进一步双方检测标记的细胞和组织学coregistration的例子可以看出，在我们的10,12以前的出版物。
图1。贸工部指标分析地区的写照。
图2。光谱装修使用jMRUI信号处理套件的追求。
图3。超顺磁性氧化铁标记从一个大脑区域与协调性脑炎的外周血细胞迁移检测。细胞的位置（黄色）代表片覆盖从T 2 *加权MRI在详细的文字收购。
Discussion
组织学与体内成像效果的准确登记，是在成像生物标志物进行检测和神经元疾病的分期发展的关键一步。一些成像指标可能与总值的形态学变化，包括用于检测脑白质病和癌症的存在组织的磁弛豫特性的变化密切相关。其他更细微的方法，如英国贸工部，有可能发现早期细胞的变化可能不被探测到由疾病引起的病理变化不出现，直到后来的疾病阶段。还有其他的标志物，如光谱标记，可能是早期和可逆的变化，即使是微妙的细胞改变之前的指标。
体内的分布，可确定的非侵入性使用的各种方法。主要的非侵入性的方法是正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层显像（SPECT），光学成像和MRI。许多生物分布，核医学成像（PET和SPECT）多年来一直使用，但这些方法都是有限的标签，尤其是用于PET示踪剂化合物或纳米材料，使用的放射性示踪剂的半衰期。光学成像，可用于小型啮齿类动物，但不能转化人类使用容易，如表面的肿瘤，由于光吸收和光散射的地区除外。此外，它是难以量化的光信号，这些同样的原因。 MRI检查使用持久性，如超顺磁性氧化铁的一个星期内，可在体内追踪标签。 ，这也必须谨慎使用，标签可以转移到不同的细胞或身体再吸收。
可以提供多种方法检测超顺磁性氧化铁在MRI的特异性。检测方法，提供正面以及负面的信号，用于提高检测组织中存在的超顺磁性氧化铁的特异性的MRI。在这项工作中使用的加减法已被他人使用， 以及 28 。其他办法包括关闭的共振检测 29-31，相位敏感的成像产生超顺磁性氧化铁空隙32，零回波时间图像，使用的T1加权产生一个积极的信号强度，超顺磁性氧化铁33地区附近的一个特定模式。提高标签定量方法的进步，敏感性和特异性，今天是一个活跃的研究领域。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了补助金1K25MH089851，1P01DA028555 - 01A1，2R01 NS034239，2R37 NS36126，P01 NS31492，P20RR 15635，P01MH64570，并从美国国立卫生研究院P01 NS43985。作者感谢罗宾泰勒女士的手稿和杰出的图形和文学支持的关键读。作者还要感谢他们的技术支持，梅丽莎 - 梅隆埃林麦金太尔和Lindsay米。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | |||
| Medical Oxygen | |||
| Isoflurane vaporizer | |||
| Rodent gas anesthesia mask | |||
| MRI compatible Stereotactic head holder | |||
| Syringe | |||
| Polyethylene catheter tubing | |||
| Non-magnetic needle | |||
| Eye lubricant | |||
| Gauze | |||
| Tape | |||
| Perfusion media | |||
| OCT compound for embedding tissue | |||
| MRI system | |||
| Digital Camera | |||
| Tissue Sectioning Cryostat |
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