Summary
Råttan modell av akut hjärtinfarkt (AMI) är användbar för att studera konsekvensen av en hjärtinfarkt på hjärtats patofysiologiska och fysiologiska funktioner.
Abstract
Med hjärtsvikt ledande dödsorsaken i USA (Hunt), är biomedicinsk forskning grundläggande för att främja medicinsk behandling för hjärt-kärlsjukdomar. Djurmodeller att härma mänskliga hjärtsjukdom, t.ex. hjärtinfarkt (MI) och ischemi-reperfusion (IR), som inducerar hjärtsvikt samt tryck-överbelastning (tvärgående aorta sammandragning), som inducerar hjärthypertrofi och hjärtsvikt (Goldman och Tarnavski) är användbara modeller för att studera hjärt-kärlsjukdom. I synnerhet är myokardischemi (MI) en ledande orsak till kardiovaskulär morbiditet och mortalitet trots att den kontrollerar vissa riskfaktorer som åderförkalkning och behandling via kirurgiska ingrepp (Thygesen). Dessutom en akut förlust av hjärtmuskeln följande myokardischemi (MI) resulterar i ökad lastförhållanden som inducerar ventrikulär ombyggnad av infarktzonen gränszonen och fjärrkontrollen inte infarktområdet hjärtmuskeln. Myocyte apoptos, nekros och den resulterande ökad hemodynamisk belastning aktivera flera biokemiska intracellulär signalering som initierar LV dilatation, hypertrofi, ventrikulär form distorsion, och kollagen ärrbildning. Denna patologiska ombildningar och underlåtenhet att normalisera den ökade väggen betonar resulterar i progressiv dilatation, rekrytering av gränszonen myokardiet i ärr, och så småningom försämrad myokardiell kontraktila funktion (dvs hjärtsvikt). Utvecklingen av LV dysfunktion och hjärtsvikt hos råttor liknar den som observerats hos patienter som råkar ut en stor hjärtinfarkt, överleva och sedan utvecklar hjärtsvikt (Goldman). Den akut hjärtinfarkt (AMI) modell på råtta har använts för att efterlikna människans hjärt-och kärlsjukdomar, specifikt används för att studera hjärt signalering mekanismer i samband med hjärtsvikt samt utvärdering av bidraget av behandlingsstrategier för behandling av hjärtsvikt. Metoden som beskrivs i denna rapport är råttmodell av akut hjärtinfarkt (AMI). Denna modell är även kallat ett akut ischemisk kardiomyopati eller ischemi följt av reperfusion (IR), som framkallas av en akut 30-minuters period av ischemi genom ligation i vänster främre nedstigande artären (LAD) följt av reperfusion av vävnaden genom släppa LAD ligation (Vasiljev och McConnell). Detta protokoll kommer att fokusera på bedömning av infarkt storlek och området-at-risk (AAR) av Evan blå färg och trifenyl tetrazoliumklorid (TTC) efter 4-timmars reperfusion, ytterligare kommentarer mot utvärdering av hjärtfunktion och ombyggnad genom att ändra varaktigheten av reperfusion, presenteras också. Sammantaget är detta AMI råttan djurmodell användbart för att studera konsekvensen av en hjärtinfarkt på hjärtats patofysiologiska och fysiologiska funktioner.
Protocol
1. Beredning av verksamhetsområdet
- Det operativa Ytan är först fram av desinficera området med 70% etanol.
- Alla kirurgiska instrument skall steriliseras med en varm pärla autoklav före operation (och mellan enskilda råtta operationer). Dessa instrument är: kirurgisk sax (2), pincett (1), böjd pincett (1), nål (2), och en kista rectractor.
- Gasväv och applikatorer ska vara tillgängliga för att hantera blödning.
- Justera temperaturen på en homeothermic filt system (värmedyna), som ska användas för att hålla kroppstemperaturen av djuret vid 37 ± 1 ° C, för att undvika en dramatisk nedgång i kroppstemperatur, storleken på en infarkt är beroende av varaktigheten av ocklusion samt kroppstemperatur (Tarnavski et al.).
- Innan anestesi, kommer varje djur får en dos av buprenorfin (0,1-2,5 mg / kg SQ) och karprofen orala tabletter (Rimadyl, Bioserv tabletter, 1 tablett) dagen före operation. Vid tidpunkten omedelbart före operationen, kommer varje djur får igen en dos av buprenorfin (0,1-2,5 mg / kg SQ).
- Obs: För studier med bedömning av hjärtfunktion och hjärt ombyggnad under en period (7 - till 28-dagar och därefter), en dos av buprenorfin (0,1-2,5 mg / kg SQ) kommer att administreras, varje 6-timmars efter operationen i 24-48 timmar efter operationen och karprofen orala tabletter kommer att ges en gång dagligen (se "postoperativ återhämtning").
2. Upprättande och intubation hos råttor
- Innan induktion av anestesi, kommer djuren undersökas för att identifiera eventuella befintliga förhållanden som kan komplicera kirurgiska resultatet, fysisk undersökning kommer att omfatta visuell inspektion och mätning av puls, andningsfrekvens och kroppstemperatur och kroppsvikt.
- Om djuren är fast beslutna att vara frisk, kommer 250-300 gram hanråttor (t.ex. Sprague Dawley) vägas och identifiera egenskaper kommer att registreras.
- Råttor är sedan bedövas med 80 mg / kg av pentobarbital, rätt nivå av anestesi verifieras genom extremiteten tillbakadragande svar genom att trycket från råtta nagelbädden (toe-nypa reflex) och med jämna mellanrum under hela förfarandet.
- Buprenorfin (0,1-2,5 mg / kg, SQ) kommer att administreras i samband med kirurgi.
- En elektrisk rakapparat används sedan för att raka pälsen bilda hals och bröst områden. Obs: För studier med bedömning av hjärtfunktion och hjärt ombyggnad under en period (7 - till 28-dagar och därefter), måste pälsen vara helt rakat bort från operationsområdet för att bibehålla sterilitet.
- De rakade områden som ska tvättas och desinficeras med Betadine lösningen åtföljd av torka området med 70% alkohol, vilket Betadine och alkohol skrubba och desinfektion förfarande skall upprepas tre gånger.
- Den sövda djur placeras sedan i en liggande position på en homeothermic filt system (värmedyna) för att upprätthålla kroppstemperaturen.
- Endotrakeal intubation utförs sedan genom att först noggrant exponera luftstrupe, för att öka visualisering av intubation, genom att göra en 5 mm i mitten av halsen snitt och upprullning av muskelvävnad, precis ovanför luftstrupen.
- Detta ger bättre visualisering för insättning av endotrakealtub (polyeten storlek 90, PE 90), där slangen är avfasade på kanten för att underlätta ingång genom struphuvudet.
- Den endotrakealtub sätts in i luftstrupen, med visualisering med hjälp av hjälp av ett kirurgiskt stereo mikroskop, genom att försiktigt manipulera tungan medan du tittar på luftstrupen och ingången till endotrakealtub.
- Mekanisk ventilation är då uppnås genom att ansluta endotrakealtub till Kent vetenskapliga respirator (TOPO Dual Mode) cykla på 80 andetag per minut och en tidalvolym på 1,2 ml per 100 gram kroppsvikt.
- En steril duk placeras sedan över råttan, vilket innebär att endast den kirurgiska området utsätts för, vilket minimerar risken för kontaminering under operationen.
- Djuret kirurg och assistenter att bära mask, kappa och handskar, med handskar ändras mellan enskilda råtta operationer.
3. Övergående Left Anterior Descending (LAD) Artery Ligation
- När jämn andning är etablerad, är bröstet öppnas på vänster fourth interkostalrummet, genom att använda peanger eller runda sax slut att öppna utrymme, men utan att skära i vävnaden så att risken för blödningar kan minskas.
- En kista upprullningsdon är sedan placeras inom det fjärde interkostalrummet, för att sprida revbenen så att vänster kammare (LV) är utsatt, med maximal noga med att inte skada lungorna.
- Hjärtsäcken är då öppnas, men kvar på plats om möjligt.
- Den proximala vänster främre nedstigande (LAD) artär kommer att identifieras (figur-1) med hjälp av såurgical stereo mikroskop, och gossen är då tillfälligt knyts ihop (eller kan knytas med en slipknot) med en 6-0 prolene sutur för en 30-minuters ischemisk perioden (figur-1), men utan exteriorisering i hjärtat.
- För att möjliggöra hjärt reperfusion, är mikrokirurgisk sax används för att klippa knut på ligatur (eller genom att släppa slipknot), som gjorts av 6-0 prolene suturen, 30-minuter efter ligation av LAD.
- I bluff kontroll råttor, är förfarandet identiska, utom LAD inte är tillfälligt knyts ihop.
- Utflödet är sedan snabbt (1-2 sekunder) nöp bort på respirator för att flytta inflationen i lungorna.
- Kistan Upprullningsdonet tas sedan bort och revbenen dras ihop med en 2-0 prolene sutur med en avbruten sutur mönster.
- När revbenen är stängda, är utflödet av fläkten igen en kort stund (1-2 sekunder) kläms ut för att säkerställa korrekt andning.
- Huden är stängt med 6-0 prolene sutur med en kontinuerlig sutur mönster.
4. Bekräftelse av Framgångsrik Ligation av LAD Artery
- Korrekt ligation av LAD kommer att bekräftas genom att observera bleknande hjärtinfarkt i vävnaden distalt om suturen samt dysfunktion i den främre väggen, som observerats under den transienta LAD ligatur.
- Reperfusion kommer att kontrolleras av avkastningen av röd färg för att myokardiets vävnad och demonstration av en viss återhämtning av främre vägg rörelse, som observerats omedelbart efter övergående LAD ligatur.
- Obs: För studier med bedömning av hjärtfunktion och hjärt ombyggnad under en period (7 - till 28-dagar och därefter), kommer ett ekokardiogram ske 24 timmar ligation inlägg LAD, i syfte att fastställa omfattningen av de inducerade hjärtinfarkt. Alla djur med en vänster kammare fraktionerad förkorta (LV FS) <20%, som bestäms från en ekokardiografi, samt främre väggen rörelse dysfunktion i linje med infarkt, kommer att identifieras och användas för uppföljning hjärtfunktion och studier ombyggnad. Sham kontroll råttor förväntas ha en normal LV FS mellan 40-45% (del Monte et al).
5. Postoperativ återhämtning
- När operationen är klar kommer steril duk över djuret tas bort. Kroppstemperaturen (med en rektal termometer), andningsfrekvens (visuellt), hjärtfrekvens (av hjärtklappning) och onormala tecken på smärta ska övervakas tills djuret blir ambulatorisk.
- Råttan kommer att tas bort från fläkten och sedan placeras i ett djur bur och tillåtas att återhämta sig från anestesi. I denna bur, kommer den ena änden av buren värmas av en värmedyna att låta råttan att söka värme. Dessutom kommer vattnet vara tillgänglig för råttan under observationstiden.
- Om tecken på uttorkning observeras efter operationen, kommer 0,5 ml steril koksaltlösning injiceras intraperitonealt (IP).
- Buprenorfin (0,1-2,5 mg / kg, SQ) kommer då att ges omedelbart efter operationen och under postoperativ återhämtning.
- Obs: För studier med bedömning av hjärtfunktion och hjärt ombyggnad under en period (7 - till 28-dagar och därefter), en dos av buprenorfin (0,1-2,5 mg / kg SQ) kommer att administreras, varje 6-timmars efter operationen i 24-48 timmar efter kirurgi. Karprofen orala tabletter (Rimadyl, Bioserv tablett) kommer också att ges (1-tablett dagligen) under minst 48 timmar efter kirurgi.
6. Histologisk Utvärdering av Ischemi Reperfusion
- Efter avslutad 4-timmars reperfusion perioden, råttor ska bedövas igen med 80 mg / kg för pentobarbital och gossen är knyts ihop en gång (eller slipknot kan knytas om) (Huang et al och Kaiser et al).
- 1 ml 5% Evans Blue (i fosfatbuffrad koksaltlösning) är sedan sprutas in i höger kammare kammaren och tillåts BEGJUTA för 2-minuter.
- Efter 2-minuter, är 1 ml mättad kaliumkloridlösning sedan injiceras i höger kammare kammaren för att stoppa hjärtat från att slå.
- Hjärtat är sedan snabbt skärs, inbäddade i 2% agaros fosfatbuffrad koksaltlösning och sedan uppställd i 1-2 mm skivor.
- Den livskraftiga hjärtmuskeln är då färgas med 2% trifenyl tetrazoliumklorid (TTC) för 20-minuter och bilder på varje skiva fångas. Bilderna är sedan kvantifieras för att identifiera mängden hjärtinfarkt i området: (1) som inte är-at-risk (blå avsnitt), (2) område-at-risk (AAR, röd och vit avsnitt), och (3 ) område som är infarktområdet (vit "ofärgade" avsnitt) (Figur-2).
7. Representativa resultat
För studier med utvärdering av infarkt storlek och området-at-risk (AAR), av Evan blå färg och trifenyl tetrazoliumklorid (TTC), efter 4-timmars reperfusion kan korrekt ligation av LAD bekräftasgenom att observera bleknande hjärtinfarkt i vävnaden distalt om suturen samt dysfunktion i den främre väggen, som observerats under den transienta LAD ligatur. Reperfusion kan verifieras genom återlämnandet av röd färg för att myokardiets vävnad och demonstration av en viss återhämtning av främre vägg rörelse, observeras omedelbart efter övergående LAD ligatur. För studier som omfattar bedömning av hjärtfunktionen och hjärt ombyggnad under en period (7 - till 28 - dagar och därefter), kan korrekt ligation av ischemi följt av reperfusion också bekräftas av bleknande vävnaden, dysfunktion i den främre väggen och återlämnande av röd färg med viss återhämtning av väggen rörelse efter reperfusion. Dessutom kan nedsatt hjärtfunktion fastställas genom ett ultraljud utförs 24 timmar efter LAD ligation, i syfte att fastställa omfattningen av den inducerade hjärtinfarkt. Alla djur med en vänster kammare fraktionerad förkorta (LV FS) <20%, som bestäms från en ekokardiografi, samt främre väggen rörelse dysfunktion i linje med infarkt, kommer att identifieras och användas för uppföljning hjärtfunktion och studier ombyggnad. Sham kontroll råttor förväntas ha en normal LV FS mellan 40-45% (del Monte).
Figur 1. Schematisk bild av en hjärtinfarkt och LAD Ligation. Skiss av (1) hjärtinfarkt och (2) ligation av vänster kammares främre fallande (LAD) artär med hjälp av en sutur som används för att efterlikna hjärtinfarkt orsakad av pesten bildas.
Figur 2. Representativ bild av en råtta hjärtat efter AMI. Representativ bild av råttans hjärta med det området i blått (icke-ockluderade koronar genomblödning område), område i rött (ockluderade koronar genomblödning område anger område-at-risk (AAR) för infarkt, och området i vit / gul (infarktzonen inom AAR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En akut hjärtinfarkt (AMI) hos råttor, även kallad ischemi-reperfusion (IR), används ofta för att härma mänskliga ventrikulär ombyggnad som leder till hjärtsvikt. Utvecklingen av LV dysfunktion och hjärtsvikt i djurmodeller (råtta och mus) liknar den som observerats hos människor som upprätthålla en hjärtinfarkt, överleva och sedan därefter utvecklar hjärtsvikt (Goldman). Detta förfarande beskrivs en version av denna teknik och också innehöll ytterligare beskrivningar av metodologiska variationer. Ytterligare sådana variationer i akut hjärtinfarkt (AMI) innefattar den tid ischemi och hur länge reperfusion. Det finns också variationer när det kirurgiska ingreppet används för att få tillgång och ligate gossen. När det gäller längden på ischemisk perioden, till tiden för LAD ligation framkalla en hjärtinfarkt kan begränsas akut (30-minuter till 60 minuter, AMI), eller alternativt, begränsad kroniskt (permanent, MI). När det gäller längden på reperfusion efter denna första ischemisk tiden före hjärtinfarkt bedömningen (dvs. efter reperfusion perioden), kan vara kort (4-timmar till 24-timmar) för att utvärdera infarkt storlek och område-at-risk (AAR ) av Evan blå färg och trifenyl tetrazoliumklorid (TTC), eller alternativt, långvarig (7-dagar till 28 dagar och därefter) för att utvärdera hjärtfunktionen och ombyggnad. Denna patologiska kardiell remodellering (apoptos, nekros och LV dysfunktion) kommer att variera beroende på vald längd ischemi och reperfusion. Som ett alternativ till det kirurgiska ingreppet för minimalt utsätta hjärtat för att ligate the Lad i den fjärde interkostalrummet och utan exteriorisering i hjärtat (se del 3: Övergående Left Anterior Descending (LAD) Artery Ligation), ett snitt genom bröstbenet att skapa en större tillgång till och syn på hjärtat, kan utföras. Kort sagt, ett snitt genom den ventrala bröstet huden till mitten av bröstkorgen varefter bröstkorgen öppnas till mitten av bröstbenet. Denna partiella torakotomi följs av att dra tillbaka sternala kanterna med ett upprullningsdon. Den proximala LAD artären är sedan identifieras med hjälp av en kirurgisk mikroskop, och antingen tillfälligt knyts ihop (eller kan knytas med en slipknot) med en 6-0-prolene sutur för en 30-minuters ischemisk perioden (AMI) eller permanent knyts ihop med en 6-0-prolene sutur (MI). För AMI förfaranden kommer mikrokirurgisk sax användas för att klippa knut på ligatur 30-minuter efter LAD ligatur. Utflödet är sedan snabbt (1-2 sekunder) nöp bort på respirator för att flytta inflationen i lungorna. Upprullningsdonet tas bort och revbenen dras samman och sys med 2-0 prolene med en avbruten sutur mönster. När kistan är stängd, är utflödet kort kläm iväg igen för att säkerställa korrekt andning och huden stängs med 6-0 prolene suturer med en kontinuerlig sutur mönster. Sammantaget härmar akut hjärtinfarkt (AMI) djurmodell som beskrivs i detta protokoll mänskliga ischemisk hjärtsjukdom och fungerar som ett viktigt verktyg för att hjälpa belysa molekylära signalering mekanismer som är inblandade i hjärt remodeling och hjärtsvikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
BKM stöds av en National Institute of Health (NIH) / National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) bevilja (R01-HL085487). MH stöds av American Heart Association National (AHA) Scientist utveckling Grant (SDG) och Society of Geriatric kardiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ventilator | Kent Scientific | TOPO | TOPO Dual Mode |
| Thermostatic Circulator E103 | Harvard Apparatus | 732802 | |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Apparatus | 55-7222F | |
| Stereo Microscope | Nikon Instruments | MMA36300 | SMZ-645 Zoom Stereo Microscope |
| Hot Bead Sterilizer | Harvard Apparatus | 610183 | |
| Electric Shaver | GE Healthcare | ||
| Blades and Handles | Welch Allyn | 690047-1 | Standard (Lamp) Laryngoscope Blades |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11028-15 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12004-18 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Chest Retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| Masks | VWR international | 47730-640 | |
| Gauze Sponges | Dermacea | 441205 | |
| Sterile Gloves | Cardinal Health | 2D7203I | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | |
| 20 ml Syringe | BD Biosciences | 301625 | |
| 6-0 Prolene Suture | Ethicon Inc. | 8706H | |
| 2-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | K873H | |
| Pentobarbital Sodium Injection | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-55 | |
| Povidone-Iodine | NOVAPLUS | V10-8204 | |
| Buprenorphine | Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 |
References
- Hunt, S. A., Baker, D. W., Chin, M. H., Cinquegrani, M. P., Feldmanmd, A. M., Francis, G. S., Ganiats, T. G., Goldstein, S., Gregoratos, G., Jessup, M. L., Noble, R. J., Packer, M., Silver, M. A., Stevenson, L. W. SC.ACC/AHA Guidelines for the Evaluation and Management of Chronic Heart Failure in the Adult: Executive Summary A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee to Revise the 1995 Guidelines for the Evaluation and Management of Heart Failure). Circulation. 104, 2996-3007 (2001).
- Goldman, S., Raya, T. E. Rat infarct model of myocardial infarction and heart failure. J Card Fail. 1, 169-177 (1995).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., &, I. zumo, S, Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
- Thygesen, K., Alpert, J. S.
- Vasilyev, N., Williams, T., Brennan, M. L., Unzek, S., Zhou, X., Heinecke, J. W., Spitz, D. R., Topol, E. J., Hazen, S. L., Penn, M. S. Myeloperoxidase-generated oxidants modulate left ventricular remodeling but not infarct size after myocardial infarction. Circulation. 112, 2812-2820 (2005).
- McConnell, B. K., Popovic, Z., Mal, N., Lee, K., Bautista, J., Forudi, F., Schwartzman, R., Jin, J. P., Penn, M., Bond, M. Disruption of protein kinase A interaction with A-kinase-anchoring proteins in the heart in vivo: effects on cardiac contractility, protein kinase A phosphorylation, and troponin I proteolysis. J Biol Chem. 284, 1583-1592 (2009).
- Monte, D. el, Butler, F., Boecker, K., Gwathmey, W., K, J., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol. Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Huang, M. H., Nguyen, V., Wu, Y., Rastogi, S., McConnell, B. K., Wijaya, C., Uretsky, B. F., Poh, K. K., Tan, H. C., Cheng, J., Perin, E., Fujise, K. Synergistic Infarct Size Reduction by Combination Therapy with Milrinone and Esmolol at Early Reperfusion during Acute Myocardial Infarction. American Journal of Physiology. , Forthcoming Forthcoming.
- Kaiser, R. A., Bueno, O. F., Lips, D. J., Doevendans, P. A., Jones, F., Kimball, T. F., Molkentin, J. D. Targeted inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase antagonizes cardiac injury and cell death following ischemia-reperfusion in vivo. J Biol Chem. 279, 15524-15530 (2004).
