Summary
Il modello di topo di infarto miocardico acuto (AMI) è utile per studiare la conseguenza di un infarto miocardico sulla funzione cardiaca fisiopatologici e fisiologici.
Abstract
Con insufficienza cardiaca la causa principale di morte negli Stati Uniti (Hunt), la ricerca biomedica è fondamentale per far avanzare trattamenti medici per le malattie cardiovascolari. Modelli animali che mimano umano malattie cardiache, come infarto del miocardio (MI) e ischemia-riperfusione (IR) che induce insufficienza cardiaca e pressione sovraccarico (restringimento aortico trasversale) che induce l'ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco (Goldman e Tarnavski), sono modelli utili per studiare le malattie cardiovascolari. In particolare, l'ischemia del miocardio (MI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare, nonostante il controllo dei fattori di rischio determinati come l'arteriosclerosi e trattamenti tramite intervento chirurgico (Thygesen). Inoltre, una perdita acuta del miocardio a seguito di ischemia del miocardio (MI) si traduce in un aumento condizioni di carico che induce rimodellamento ventricolare della zona di confine infartuata e il telecomando non miocardio infartuato. Miociti apoptosi, necrosi e la conseguente aumento del carico emodinamico più attiva di segnalazione intracellulare biochimici che avvia dilatazione LV, ipertrofia, forma di distorsione del ventricolo, e la cicatrice formazione di collagene. Questo rimodellamento patologico e l'incapacità di normalizzare la parete maggiore stress si traduce in una dilatazione progressiva, l'assunzione del miocardio zona di confine nella cicatrice, e alla fine deterioramento della funzione contrattile del miocardio (cioè insufficienza cardiaca). La progressione della disfunzione ventricolare sinistra ed insufficienza cardiaca nei ratti è simile a quello osservato in pazienti che subiscono un infarto miocardico grande, sopravvivere e di sviluppare successivamente scompenso cardiaco (Goldman). L'infarto miocardico acuto (IMA) nei ratti modello è stato usato per mimare umano malattie cardiovascolari; utilizzate in modo specifico per studiare meccanismi di signaling cardiaco associato a scompenso cardiaco e per valutare il contributo delle strategie terapeutiche per il trattamento dello scompenso cardiaco. Il metodo descritto in questa relazione è il modello di ratto di infarto miocardico acuto (IMA). Questo modello è indicato anche come cardiomiopatia ischemica acuta o ischemia seguita da riperfusione (IR), che è indotto da un acuto di 30 minuti di ischemia mediante legatura della discendente anteriore sinistra (LAD), seguita da riperfusione del tessuto da rilasciando la legatura LAD (Vasilyev e McConnell). Questo protocollo si concentrerà sulla valutazione della dimensione dell'infarto e la zona a rischio (AAR) di colorante blu di Evan e cloruro di trifeniltetrazolo (TTC) dopo 4 ore di riperfusione, commenti aggiuntivi verso la valutazione della funzione cardiaca e del rimodellamento modificando la durata della riperfusione, è anche presentato. Nel complesso, questo modello di ratto AMI animale è utile per studiare la conseguenza di un infarto del miocardio in funzione cardiaca fisiopatologici e fisiologici.
Protocol
1. Preparazione dell'area operativa
- La superficie di funzionamento è il primo preparato da disinfettare la zona con etanolo al 70%.
- Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati con uno sterilizzatore a caldo tallone prima dell'intervento chirurgico (e tra i singoli ambulatori ratto). Questi strumenti sono: forbici chirurgiche (2), pinze (1), pinze curve (1), porta aghi (2), e un rectractor petto.
- Garza di cotone e applicatori devono essere disponibili per gestire sanguinamento.
- Regolare la temperatura di un sistema di coperta homeothermic (pad riscaldamento), da utilizzare per mantenere la temperatura del corpo dell'animale a 37 ± 1 ° C, al fine di evitare una drammatica caduta della temperatura corporea, la dimensione di un infarto dipende la durata di occlusione come temperatura corporea bene (Tarnavski et al.).
- Prima dell'anestesia, ogni animale riceveranno un dosaggio di buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ) e compresse carprofene orale (Rimadyl, Bioserv compressa, 1 compressa) il giorno prima della chirurgia. Al momento immediatamente precedente l'intervento, ogni animale sarà nuovamente ricevere un dosaggio di buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ).
- Nota: Per gli studi che coinvolgono la valutazione della funzione cardiaca e del rimodellamento cardiaco in un periodo di tempo (7 - a 28-giorni e oltre), un dosaggio di buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ) sarà somministrato ogni 6 ore dopo l'intervento chirurgico per 24-48 ore dopo l'intervento e il carprofen compresse orali verranno forniti una volta al giorno (vedi "recupero post-operatorio").
2. Preparazione e intubazione di Ratti
- Prima l'induzione di anestesia, gli animali saranno esaminati per individuare eventuali patologie preesistenti che potrebbero complicare risultato chirurgico, esame fisico comprende l'ispezione visiva e la misurazione della frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e la temperatura corporea e il peso corporeo.
- Se gli animali sono determinati ad essere sani, 250-300 grammi ratti maschi (per esempio Sprague Dawley) saranno pesati e caratteristiche di identificazione verrà registrato.
- I ratti sono poi anestetizzati con 80 mg / kg di pentobarbital, il corretto livello di anestesia è verificato attraverso la risposta ritiro arto applicando pressione del letto ungueale ratto (toe-pinch reflex) e periodicamente durante tutta la procedura.
- Buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg; SQ) sarà somministrato al momento della chirurgia.
- Un rasoio elettrico viene poi utilizzato per radersi la forma di pelliccia delle aree collo e al torace. Nota: Per gli studi che coinvolgono la valutazione della funzione cardiaca e del rimodellamento cardiaco in un periodo di tempo (7 - a 28-giorni e oltre), la pelliccia deve essere completamente rasata lontano dalla zona chirurgica per mantenere la sterilità.
- Le aree devono essere rasati rimosso e disinfettati con una soluzione di Betadine seguita da pulire l'area con alcool al 70%: questo betadine e macchia alcool e procedura di disinfezione deve essere ripetuta tre volte.
- Anestetizzato l'animale viene posto in posizione supina su un sistema coperta homeothermic (piastra elettrica), al fine di mantenere la temperatura corporea.
- Intubazione endotracheale viene poi eseguita da prima attentamente esponendo la trachea, per migliorare la visualizzazione di intubazione, facendo di 5 mm a metà collo incisione e la retrazione del tessuto muscolare, appena sopra la trachea.
- Questo permette una migliore visualizzazione per l'inserimento del tubo endotracheale (polietilene Taglia 90, PE 90), dove è smussato il tubo sul bordo per facilitare l'ingresso attraverso la laringe.
- Il tubo endotracheale viene inserita nella trachea, con visualizzazione aiutato utilizzando un microscopio operatorio stereo, manipolando con attenzione la lingua durante la visualizzazione della trachea e l'ingresso del tubo endotracheale.
- Ventilazione meccanica è poi ottenuto collegando il tubo endotracheale a Kent scientifico ventilatore (modalità TOPO Dual) ciclismo a 80 respiri al minuto e un volume corrente di 1,2 ml per 100 grammi di peso corporeo.
- Un telo sterile viene posto sopra il topo, lasciando solo l'area chirurgica esposta, in modo da minimizzare la contaminazione potenziale durante l'operazione.
- Il chirurgo animali e gli assistenti devono indossare una maschera, camice e guanti, con i guanti di essere cambiato tra ambulatori ratto individuali.
3. Transitorio discendente anteriore sinistra (LAD) Arteria Ligation
- Una volta che respiro costante è stabilito, il petto è aperto a sinistra quarto spazio intercostale, utilizzando hemostats o forbici fine turno per aprire lo spazio, ma senza tagliare il tessuto in modo che il rischio di sanguinamento può essere ridotto.
- Un retrattore petto è quindi posizionato all'interno del quarto spazio intercostale, al fine di diffondere le costole in modo che il ventricolo sinistro (LV) è esposto, tenendo massima cura a non danneggiare i polmoni.
- Il pericardio è quindi aperto, ma lasciato al suo posto, se possibile.
- Prossimale sinistra discendente anteriore (LAD) arteria sarà identificato (Figura-1), con l'utilizzo di quantostereomicroscopio urgical, e il ragazzo viene transitoriamente legatura (o può essere legato con un nodo scorsoio) con un 6-0 prolene sutura per un periodo di 30 minuti ischemico (Figura-1), ma senza esteriorizzazione del cuore.
- Per consentire la riperfusione cardiaca, forbici microchirurgico sono usati per tagliare il nodo della legatura (o rilasciando il slipknot), con il prolene 6-0 sutura, 30 minuti dopo la legatura del LAD.
- Nella finzione ratti di controllo, la procedura è identica, ad eccezione del LAD non è transitoriamente legato.
- Il deflusso è poi brevemente (1-2 secondi) fuori pizzicato sul respiratore per consentire nuovamente l'inflazione dei polmoni.
- Il retrattore del torace viene quindi rimosso e le costole sono riunite con un 2-0 sutura prolene con un modello di sutura interrotta.
- Una volta che le costole sono chiuse, il deflusso del ventilatore è di nuovo brevemente (1-2 secondi) pizzicato fuori per assicurare una corretta respirazione.
- La pelle è chiuso con sutura prolene 6-0 con un modello di sutura continua.
4. Conferma della legatura con successo l'arteria discendente anteriore
- Legatura corretta della LAD sarà confermata osservando sbiancamento del tessuto del miocardio distale alla sutura così come disfunzione della parete anteriore, come osservato durante la legatura LAD transitorio.
- Riperfusione sarà verificata dal ritorno di colore rosso al tessuto miocardico e la dimostrazione di una certa ripresa del movimento della parete anteriore; come osservato subito dopo la legatura LAD transitorio.
- Nota: Per gli studi che coinvolgono la valutazione della funzione cardiaca e del rimodellamento cardiaco in un periodo di tempo (7 - a 28-giorni e oltre), un ecocardiogramma sarà eseguita 24 ore dopo la legatura LAD, al fine di determinare l'entità del indotta infarto del miocardio. Tutti gli animali con un accorciamento frazionale del ventricolo sinistro (LV FS) <20%, come stabilito da un ecocardiogramma, così come la disfunzione movimento della parete anteriore coerente con l'infarto, saranno individuate e utilizzate per il follow-up funzione cardiaca e gli studi di rimodellamento. Sham ratti di controllo sono tenuti ad avere una normale LV FS tra il 40-45% (del Monte et al).
5. Recupero post-operatorio
- Una volta che l'operazione è completa, il telino sterile sopra l'animale verrà rimosso. La temperatura corporea (da un termometro rettale), frequenza respiratoria (con un esame visivo), la frequenza cardiaca (da palpitazioni), anomalo e segni del dolore sono da monitorare finché l'animale diventa ambulatoriale.
- Il ratto verrà rimosso dal ventilatore e poi essere inserito in una gabbia di animali e ha permesso di recuperare da anestesia. In questa gabbia, una delle estremità della gabbia sarà riscaldata da una piastra elettrica per consentire il ratto a cercare calore. Inoltre, l'acqua sarà disponibile per il topo durante questo periodo di osservazione.
- Se i segni di disidratazione sono osservati dopo l'intervento chirurgico, 0,5 ml di soluzione fisiologica sterile verrà iniettato per via intraperitoneale (IP).
- Buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg; SQ) sarà somministrata immediatamente dopo l'intervento chirurgico, e durante il recupero post-operatorio.
- Nota: Per gli studi che coinvolgono la valutazione della funzione cardiaca e del rimodellamento cardiaco in un periodo di tempo (7 - a 28-giorni e oltre), un dosaggio di buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ) sarà somministrato ogni 6 ore dopo l'intervento chirurgico per 24-48 ore dopo la chirurgia. Carprofene compresse orali (Rimadyl, Bioserv compressa) saranno fornite anche (1-compressa al giorno) per almeno 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
6. La valutazione istologica della ischemia riperfusione
- A seguito del completamento del periodo di 4 ore di riperfusione, i ratti sono anestetizzati di nuovo con 80 mg / kg di pentobarbital e il ragazzo è legatura ancora una volta (o il cappio può essere retied) (Huang et al e Kaiser et al).
- 1 ml di 5% di blu di Evan (in PBS) viene poi iniettato nella camera ventricolare destra e ha permesso di perfusione per 2 minuti.
- Dopo 2 minuti, 1 ml di soluzione satura di cloruro di potassio viene iniettato nella camera ventricolare destra in modo da fermare il cuore di battere.
- Il cuore viene rapidamente asportato, incorporato nel 2% agarosio PBS, e poi sezionato in 1-2 fette di mm.
- Il miocardio vitale è poi macchiata con il 2% di cloruro di trifeniltetrazolo (TTC) per 20 minuti e le immagini di ogni fetta viene catturato. Le immagini sono poi quantificati al fine di individuare la quantità di area del miocardio: (1) che non a rischio è (sezioni blu), (2) area a rischio (AAR, rosso e bianco sezioni), e (3 ), zona che è infartuata (bianca "senza macchia" sezioni) (Figura-2).
7. Rappresentante Risultati
Per gli studi che coinvolgono la valutazione delle dimensioni dell'infarto e la zona a rischio (AAR), con colorante blu di Evan e cloruro di trifeniltetrazolo (TTC), dopo 4 ore di riperfusione, legatura corretto del LAD può essere confermataosservando sbiancamento del tessuto del miocardio distale alla sutura così come disfunzione della parete anteriore, come osservato durante la legatura LAD transitorio. Riperfusione può essere verificata dal ritorno di colore rosso al tessuto miocardico e la dimostrazione di una certa ripresa del movimento della parete anteriore; osservato subito dopo la legatura LAD transitorio. Per studi che comprendano la valutazione della funzione cardiaca e del rimodellamento cardiaco in un periodo di tempo (7 - a 28 - giorni ed oltre), la legatura corretto ischemia seguita da riperfusione può anche essere confermata dal pallore della disfunzione del tessuto, della parete anteriore e il ritorno di colore rosso con una certa ripresa del movimento della parete dopo riperfusione. Inoltre, disturbi della funzione cardiaca può essere determinato da un ecocardiogramma in corso di 24 ore legatura LAD post, al fine di determinare l'entità della infarto miocardico indotto. Tutti gli animali con un accorciamento frazionale del ventricolo sinistro (LV FS) <20%, come stabilito da un ecocardiogramma, così come la disfunzione movimento della parete anteriore coerente con l'infarto, saranno individuate e utilizzate per il follow-up funzione cardiaca e gli studi di rimodellamento. Sham ratti di controllo sono tenuti ad avere una normale LV FS tra il 40-45% (del Monte).
Figura 1. Rappresentazione schematica di un infarto del miocardio e Ligation LAD. Schema di (1) infarto del miocardio e (2) legatura del ventricolo sinistro discendente anteriore (LAD) arteria con una sutura, utilizzato per simulare l'infarto miocardico causato dalla formazione di peste.
Figura 2. Un'immagine rappresentativa di un Cuore Rat seguito AMI. Immagine rappresentativa del cuore di ratto che mostra l'area in blu (non occluso zona perfusione coronarica), area in rosso (area di perfusione coronarica occlusa che indica la zona a rischio (AAR) per l'infarto, e la zona in bianco / giallo (zona infartuata all'interno del AAR).
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Discussion
Un infarto miocardico acuto (IMA) nei ratti, anche come ischemia-riperfusione (IR), è comunemente usato per mimare il rimodellamento ventricolare umano che porta a insufficienza cardiaca. La progressione della disfunzione ventricolare sinistra e scompenso cardiaco in modelli animali (ratti e topi) è simile a quello osservato negli esseri umani che sostengono un IM, sopravvivere e poi si sviluppa successivamente insufficienza cardiaca (Goldman). Questa procedura delineata una versione di questa tecnica e conteneva anche altre note che descrivono le variazioni metodologiche. Ulteriori tali variazioni al infarto miocardico acuto (IMA) procedura includono la durata di ischemia e la durata della riperfusione. Inoltre, ci sono variazioni rispetto alla procedura chirurgica utilizzata per ottenere l'accesso e legare il LAD. Per quanto riguarda la durata del periodo ischemico, il tempo della legatura LAD per indurre un infarto miocardico acuto può essere limitato (30 minuti a 60 minuti; AMI), o, in alternativa, limitato cronica (permanente; MI). Per quanto riguarda la durata della riperfusione dopo questo periodo iniziale ischemica prima alla valutazione del miocardio (cioè il periodo di riperfusione successivi), possono essere di breve durata (4 ore a 24 ore) per valutare dimensioni dell'infarto e la zona a rischio (AAR ) di colorante blu di Evan e cloruro di trifeniltetrazolo (TTC), o, in alternativa, prolungato (7 giorni a 28 giorni e oltre) al fine di valutare la funzione cardiaca e del rimodellamento. Questo rimodellamento cardiaco patologico (apoptosi, necrosi e disfunzione ventricolare sinistra) varia a seconda della durata scelta di ischemia e riperfusione. In alternativa alla procedura chirurgica minimamente di esporre il cuore al fine di legare il KOP nel quarto spazio intercostale e senza esteriorizzazione del cuore (vedi Parte 3: transitori discendente anteriore sinistra (LAD) legatura dell'arteria), un'incisione attraverso lo sterno , per creare un accesso più ampio e vista del cuore, può essere eseguita. In breve, un'incisione è fatta attraverso la pelle ventrale petto fino a metà torace dopo di che il torace è aperto a metà dello sterno. Questo parziale toracotomia è seguita dalla scomparsa i bordi dello sterno con un divaricatore. L'arteria discendente anteriore prossimale viene poi identificato, con l'uso di un microscopio operatorio, e sia transitoriamente legatura (o può essere legato con un nodo scorsoio) con un 6-0-prolene sutura per un periodo di 30 minuti ischemica (IMA) o permanentemente legatura con un 6-0-prolene sutura (MI). Per le procedure di AMI, forbici microchirurgia sarà utilizzato per tagliare il nodo della legatura di 30 minuti dopo legatura LAD. Il deflusso è poi brevemente (1-2 secondi) fuori pizzicato sul respiratore per consentire nuovamente l'inflazione dei polmoni. Il divaricatore viene rimosso e le costole sono riunite e suturato con 2-0 prolene con un modello sutura interrotta. Una volta che il torace è chiuso, il deflusso è brevemente pizzicato di nuovo per assicurare una corretta respirazione e la pelle si chiude con 6-0 punti di sutura prolene con un modello di sutura continua. Nel complesso, l'infarto miocardico acuto (IMA) modello animale descritto in questo protocollo imita umano cardiopatia ischemica e serve come un importante strumento per contribuire a chiarire i meccanismi di segnalazione molecolari coinvolti nel rimodellamento cardiaco e insufficienza cardiaca.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
BKM è supportato da una National Institute of Health (NIH) / National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) di assegnazione (R01-HL085487). MH è sostenuto dalla American Heart Association Nazionale (AHA) Scientist Development Grant (SDG) e la Società di Cardiologia Geriatrica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ventilator | Kent Scientific | TOPO | TOPO Dual Mode |
| Thermostatic Circulator E103 | Harvard Apparatus | 732802 | |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Apparatus | 55-7222F | |
| Stereo Microscope | Nikon Instruments | MMA36300 | SMZ-645 Zoom Stereo Microscope |
| Hot Bead Sterilizer | Harvard Apparatus | 610183 | |
| Electric Shaver | GE Healthcare | ||
| Blades and Handles | Welch Allyn | 690047-1 | Standard (Lamp) Laryngoscope Blades |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11028-15 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12004-18 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Chest Retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| Masks | VWR international | 47730-640 | |
| Gauze Sponges | Dermacea | 441205 | |
| Sterile Gloves | Cardinal Health | 2D7203I | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | |
| 20 ml Syringe | BD Biosciences | 301625 | |
| 6-0 Prolene Suture | Ethicon Inc. | 8706H | |
| 2-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | K873H | |
| Pentobarbital Sodium Injection | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-55 | |
| Povidone-Iodine | NOVAPLUS | V10-8204 | |
| Buprenorphine | Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 |
References
- Hunt, S. A., Baker, D. W., Chin, M. H., Cinquegrani, M. P., Feldmanmd, A. M., Francis, G. S., Ganiats, T. G., Goldstein, S., Gregoratos, G., Jessup, M. L., Noble, R. J., Packer, M., Silver, M. A., Stevenson, L. W. SC.ACC/AHA Guidelines for the Evaluation and Management of Chronic Heart Failure in the Adult: Executive Summary A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee to Revise the 1995 Guidelines for the Evaluation and Management of Heart Failure). Circulation. 104, 2996-3007 (2001).
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