Summary
酶解，表面标记和流式细胞仪检测纤维/成脂和小鼠骨骼肌生肌祖净化的方法。
Abstract
骨骼肌包含多个不同的胚胎起源和发展潜力的祖人口。生肌祖细胞，通常居住在“卫星细胞的位置”之间的肌纤维质膜和层粘连蛋白丰富的基底膜，ensheaths，自我更新的细胞仅致力于生肌血统 1,2 。最近，我们所描述的船只相关的祖细胞，能够产生肌纤维母细胞和白色脂肪细胞，这是为了响应有效地进入扩散损害和肌细胞提供营养支持在组织再生3,4第二类。其中一个最值得信赖的分析来确定一个特定的细胞群的发育和再生的潜力依赖于他们的分离和移植5-7。为此，我们已经优化了其净化的协议，通过流式细胞仪，酶分离肌肉，我们将在这篇文章中概述。使用这种方法得出的人口将包含生肌或纤维/成脂细胞集落形成细胞，没有其他类型的细胞，能够扩大在体外或体内交货尚存。然而，当这些人群分子之一必须牢记，新鲜排序的子集可能包含其他污染物细胞缺乏形成的殖民地或嫁接受助人的能力的分析（如QRT - PCR）排序后立即使用。
Protocol
1。收集组织：
- 使用7至12周龄的小鼠。通常情况下，至少有两种动物：一种是设立补偿和荧光减一的同型对照样品所需的流式细胞仪的单色控制。另一种是实际样品进行排序。
- 安乐死小鼠CO 2吸入或根据选择的道德协议。放置纸巾，朝上，喷以70％的乙醇小鼠彻底防止污染用鼠标毛皮。
- 提起腹部皮肤与钳，然后让一个小锋利的剪刀纵行剪开。
- 剥离皮肤皮瓣在相反的方向（上下）完全暴露后肢肌肉下方。
- 海关通过插入并延长剪刀沿胫骨两侧的肌肉组织。
- 股骨重复同样的过程中提取的肌肉组织。
- 放置在60毫米培养皿的菜全部切除的肌肉组织，组织从每个鼠标使用一盘。
- 重复上述所有小鼠。
2。酶消化分解成单细胞组织：
在本节的协议，使用消毒试剂和工具，并在无菌条件下工作。
- 第二胶原酶（Sigma公司，猫＃6885，500U /毫升）2毫升和20μL250MM氯化钙2股票添加到每个基于Petri盘。
- 撕成小块（约1毫米3）注重用两个镊子（一锯齿形，与2牙齿，从精细的科学工具，猫＃11051-10，11154-10）取出并丢弃多少污染，肌肉组织尽可能的非肌肉组织。
- 盖的Petri菜和孵育30分钟，摄氏37度。
- 检索的Petri菜，并用3毫升注射器推杆彻底捣烂组织块。每个样品使用一个柱塞，以避免污染。
- 添加一些（约5毫升）无菌冷PBS每个基于Petri盘，并转移到一个50毫升猎鹰管组织的污泥（如果要收回所有的组织，冲洗的Petri菜）
- 大力摇晃的Falcon管，填充管，用PBS离心@ 800rpm × 5分钟（Eppendorf公司的台式产品型号：5810R），吸出上清液（重复3次）
- 每管加入1毫升混合胶原酶ð（CAT＃11088882001，罗氏，1.5U / ML）/ Dispase II（罗氏，猫＃：04942078001，2.4u /毫升）和氯化钙210μL（250毫米），在37度孵育摄氏一小时轮换。
- 添加5-10毫升冷，无菌PBS，旋涡和吸管彻底均质组织。
- 填充管，用PBS，拌匀。
- 转移到液体50毫升猎鹰管顶部放置一个40微米的细胞滤网过滤掉剩余的大块组织。每个样品匀成300毫升猎鹰管。填充每个管与PBS，然后在8摄氏度@ 1600rpm离心5分钟。
- 弃上清，收集细胞进行染色。
3。抗体染色和排序：
在本节的协议，使用无菌流式细胞仪和收集缓冲区，并在无菌条件下工作。商业抗体通常被认为是无菌的，如果处理得当。
- 单一的颜色和同型对照样品，重悬浮缓冲液1ml流式细胞仪的样品和除以900 1.5ml的预标记的Eppendorf管（100μL，每管）悬浮细胞。
- 设置单一颜色的染色混合根据如下表：
注意：在染色的同型对照抗体终浓度应符合他们控制的主要抗体 。 例如，如果使用反SCA - 1是1μg/106细胞，其相应的同型，必须使用在相同浓度。管＃ 管名称 公司 猫＃ 克隆 同型 稀释 1 非染色 2 Hoechst33342 西格玛 B2261 2-5ug/ml 3 有价证券投资 西格玛 P4864 1ug/ml 4 CD31 - FITC
CD45 - FITCeBioscience公司 11-0311-85 390 鼠IgG2a 500 众议院提出 I3 / 2 鼠IgG2b 500 5 SCA1 - PECY7 eBioscience公司 25-5981-82 D7 鼠IgG2a 5000 6 α- 7的APC 众议院提出 R2F2 鼠IgG2b 1000 - 设置同型对照染色混合使用下表：
管＃ 名称
管赫希斯特 有价证券投资 CD31 -
FITC标记CD45 -
FITC标记SCAL -
PE - CY7A - 7 -
APC的鼠
IgG2b -
APC的鼠
IgG2a -
pecy7鼠
IgG2a -
FITC标记鼠
IgG2b -
FITC标记7 ISO -
CD31
/ CD45+ + - - + + - - + + 8 ISO -
SCAL -
pecy7+ + + + - + - + - - 9 ISO -
α- 7 - APC+ + + + + - + - - - - 从第20步到适当的Eppendorf管吸取单一的颜色和同位素控制染色混合物（我们通常调整的抗体浓度，使5至10μL染色混合添加到每个样品）。充分混合，并在冰上孵育1小时。
- 设置单一颜色的染色混合根据如下表：
- 从样品鼠标细胞染色抗体鸡尾酒800μL流式细胞仪细胞分选（下图）。充分混合，并在冰上孵育1小时。
抗体鸡尾酒：赫司特，PI，CD31 - FITC，CD45 - FITC标记，PECY7 SCA1 -α- 7 APC
注意：对细胞抗体的最佳比例必须由单独滴定每个抗体，作为批次之间可能存在显着差异决定的 。 在每10 6靶细胞抗体μgs和抗体的最佳的使用量应表示使用同一批次的抗体时，保持不变。 显然，如果不靶细胞的数量显着变化之间的实验，或者，如果染色卷细胞的数量与规模，每个抗体的固定稀释也可以使用。 - 洗：流式细胞缓冲9对照管各加入约1毫升;增加约流式细胞仪缓冲液20ml样品管。
- 离心5分钟Eppendorf管@ 3000RPM（Eppendorf公司台式离心机，型号：5417C）。离心机样品管@ 1600rpm 5分钟（Eppendorf公司台式离心机，型号：5810R）。
- 吸弃管上清。
- 悬浮细胞，在流式细胞仪缓冲区（1ML每个控件，排序样本4ML）移液器细胞进入“流式细胞仪管”通过细胞过滤器盖（屋宇署猎鹰猫＃352235，孔径40微米），去除剩余的团块可能影响的流式细胞仪。
- 成立单一的色彩控制和同型对照流式细胞仪分选机。
- 根据下表（95％DMEM培养液，5％FBS）分别在3.5毫升收集缓冲区收集排序细胞。通常情况下，收获两个后肢时，一个单一的野生型小鼠可产生大约15万生肌祖细胞或100000成脂分化的祖细胞，95％以上的可行性，用流式细胞仪来判断在该过程结束时重新分析排序细胞（图1 ）
表面染色的基础上生肌和成脂分化的祖细胞的定义抗体/染色 生肌祖（MP） 成脂祖（AP） 赫希斯特 + + 有价证券投资 - - CD31 - FITC - - CD45 - FITC - SCA1 - PECY7 - + α- 7的APC + -
4。移植：
- 离心机排序细胞@ 1500RPM 5分钟，取出上清液和转让细胞灭菌Eppendorf管（1.5毫升），500μL无菌PBS（无血清！）冲洗细胞，然后离心5分钟@ 3000RPM。所有的试剂，并在无菌条件下保持在一个组织的文化罩工作，重悬在约10 6细胞/ mL PBS中，或在基质胶成脂祖（屋宇署猫＃354234）生肌祖。
- 移植生肌的祖细胞或成脂祖受体小鼠。
- isoflouran根据机构的政策与麻醉鼠标。
- 剃须注射区周围的头发，然后消毒，用70％乙醇擦的皮肤
- 生肌祖细胞或成脂分化的祖细胞（= 20K细胞），使用3 / 10的CC胰岛素注射器注入20μL（屋宇署猫＃309300）。
- 经过适当的时间（三个星期，但表达捐助衍生的转基因标记的肌纤维通常在移植后1周明显），麻醉受体小鼠腹腔注射400μL，Avertin（西格玛猫＃T04840 - 2从步骤29， 25毫克/毫升），再灌注transcardially毫升PBS（含EDTA的10微米）第一15ML，4％的煤灰。收集与4％煤灰一夜之间的目标组织，修复后，如果需要的话，然后转移到20％蔗糖过夜。嵌入在华侨城，冻结和cryosection。
5。代表性的成果：
当MP移植到小鼠骨骼肌，他们爽快地保险丝与预先存在的肌纤维。因此，任何在供体细胞的遗传标签，将在收到他们的纤维，很容易检测到。图2显示了一个例子移植的细胞中表达人碱性phostphatase，显示组织化学。
AP都移植的结果是高度依赖移植部位的环境：当皮下注射移植这些细胞起源于脂肪细胞和肌纤维母细胞（见图2）。在许多其他网站，包括肌肉，他们无法生存，除非已经脂肪变性引起的3。
图1。骨骼肌祖种群隔离的排序策略 （一）排序策略 ：基于前向散射和侧向散射活菌。 Hoechst染色是用来排除anuclear碎片和碘化丙啶（PI）染色排除死细胞。排序盖茨造血（CD45）和血管内皮细胞（CD31）被排除在外。在α7+赫斯特+ PI - CD45 - CD31 - SCAL -子集包含所有祖细胞（MP），生肌。 SCAL +赫斯特+ PI - CD45 - CD31 - α7 -人口包含祖（AP）成脂。 （二）荧光减一（FMO）的同型对照确认污渍的特殊性。 （三）纯度检查排序后的MP和AP亚群。
图2。 MP和AP移植。美联社代表结果皮下移植（顶部面板）和MP肌肉注射（底部面板）。在这两种情况下，供体细胞的起源从表达的转基因人类碱性磷酸酶的老鼠，棕黄色染色确定。
Discussion
本议定书的目标是取得一个合理的平衡之间的高收益和高纯化的细胞活力。可以预见，在最关键的一步，确保健康的细胞恢复，开始组织酶解。组织的处理应特别温柔，这是很难证明或欣赏视听格式甚至的。另一个关键因素是程序的长度。时间越长，去捐助给收件人动物的可行性较低，因此，植入的效率。如果有任何不立即通过PI在纯化后的细胞样本阳性事件排序后的频率回答关于可行性的问题，我们建议，是一个限制的稀释检测，以测量clonogenicity 3。各种典型完好的肌肉经常在15-20细胞能够在体外生肌或纤维/成脂殖民地发起产量约1。虽然从国会议员发起的殖民地，基本上100％包含有区别的肌管，从FAPs获得的殖民地只有约三分之一包含除了平滑肌肌动蛋白的积极肌纤维母细胞中的脂肪细胞。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C-6885, | 500 u/ml |
| Collagenase D | Roche Group | 11088882001 | 1.5 u/ml |
| Displace II | Roche Group | 04942078001 | 2.4 u/ml |
| cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40 μm |
| Tube with cell strainer | BD Biosciences | 352235 | 40 μm |
| H–chst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 2-5 ug/ml |
| CD31-FITC | eBioscience | 11-0311-85 | Clone 390 |
| CD45-FITC | Home made | Clone I3/2 | |
| Sca1-PECY7 | eBioscience | 25-5981-82 | Clone D7 |
| α-7 integrin APC | Home made | Inquire with Rossi lab | R2F2 |
References
- Buckingham, M., Montarras, D.
- Relaix, F., Marcelle, C.
- Joe, A. W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
- Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell Cycle. 9, (2010).
- Sherwood, R. I. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. , (2008).
- Montarras, D. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
