Summary
هذا الفيديو يوضح الإجراء لعزل العقول كلها من ذبابة الفاكهة الكبار في التحضير لتسجيل واحدة من الخلايا العصبية باستخدام معيار تكنولوجيا الخلية بأكملها. وهو يتضمن صورا للخلايا العصبية وصفت GFP شوهدت أثناء التسجيل.
Abstract
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح إجراءات عزل العقول كلها من ذبابة الفاكهة الكبار في التحضير لتسجيل من الخلايا العصبية واحدة. نبدأ بوصف حل تشريح والاستيلاء على الإناث البالغات المستخدمة في دراستنا. ويتضح هذا الإجراء لإزالة الدماغ كله سليمة ، بما في ذلك كل من الفصوص البصرية. ويرد أيضا تشريح القصبة الهوائية الفوقية. الدماغ معزولة ليس فقط صغير ولكن يحتاج إلى عناية خاصة في التعامل في هذه المرحلة لمنع تلف الخلايا العصبية ، وكثير منها بالقرب من السطح الخارجي للنسيج. نظهر كيف يتم استخدام حامل الخاصة التي قمنا بتطويرها لتحقيق الاستقرار في الدماغ في غرفة تسجيل. تشكيل لالكهربية هو معيار يستخدم للحصول على تسجيل واحد من الخلايا العصبية أو أزواج من الخلايا العصبية. صورة الفلورسنت ، وينظر من خلال المجهر التسجيل ، من خط القيادة GAL4 GFP التعبير (GH146) يوضح كيف يتم تحديد الخلايا العصبية الإسقاط (PNS) في الدماغ حية. صورة رفيع Nomarski الطاقة يظهر عرض للعصبون واحد هو استهداف لتسجيل الخلية بأكملها. عندما تتم إزالة بنجاح دون ضرر في الدماغ ، والغالبية العظمى من الخلايا العصبية نشطة بشكل عفوي ، إطلاق إمكانات العمل و / أو العارضة مدخلات متشابك عفوية. هذا في إعداد الموقع ، والتي يمكن الجمع بين كل خلية من الخلايا العصبية تسجيل المحددة في الدماغ كله مع التلاعب الجيني والدوائي ، هو نموذج مفيدة لاستكشاف الفيزيولوجيا الخلوية واللدونة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين.
Protocol
أولا تشريح أدمغة البالغين من الطيران
- وضع قطرة صغيرة (~ 100 ميكرولتر) للتشريح في حل وسط طبق بيتري 35 مم.
- الصيد البالغات باستخدام الشافطة. تحت المجهر تشريح ، واستخدام إبر المحاقن اثنين إلى قطع رأس ذبابة.
- رئيس المركز في قطرة صغيرة من المياه المالحة تشريح (مع غراء المضافة) في طبق بتري.
- رئيس المركز مع مع خرطوم التي تواجه قاع الطبق.
- عقد إهاب المركب الذي يغطي العين اليسرى مع إبرة 1. اجراء خفض قطري التي تمتد من الظهرية الى السطح البطني مع إبرة 2 ، الإنسية لمجرد إبرة 1.
- مع الاستمرار على فمها واستخدام إبرة 1 إبرة 2 الى اجراء خفض الأفقي الذي يمتد من السطح البطني من العين اليسرى إلى العين اليمنى ، على مستوى القاعدة من خرطوم.
- عقد إهاب المركب الذي يغطي العين اليمنى مع إبرة 1. اجراء خفض قطري التي تمتد من الظهرية الى السطح البطني مع إبرة 2 ، الإنسي فقط من إبرة 1.
- استدارة الرأس بحيث الجانب منقاري على سطح طبق بتري. ادخال ابرة 1 بين جليدة منقاري والدماغ ، واستخدام إبر 2 لمتابعة مسار نفس الإبرة الأولى. من الناحية المثالية ، سوف تكون الكبسولة قشر بعيدا عن الدماغ مع كل من الفصوص البصرية منذ تولي هذه المهمة في تحقيق الاستقرار في الدماغ للتسجيل.
- تتم إزالة بعناية القصبة الهوائية والحويصلات الهوائية ، وغيرها من الأنسجة الضامة باستخدام اثنين ملقط غيض الغرامة.
- يجب تشريح كامل يستغرق 3-10 دقائق
II. تركيب الجهاز العصبي المركزي
- يتم نقل الدماغ إلى غرفة تسجيل باستخدام الماصة غيض الصفراء.
- في غرفة التسجيل ، واستقرت في الدماغ عن طريق وضع مثل هذا الإطار أن اثنين من البلاتين عبر الشعر الجميلة التي تجعل الاتصال مع الأنسجة عند تقاطع بين الفصوص البصرية والمنطقة المركزية في المخ.
- يسمح لكل الدماغ الى الراحة في غرفة مع تسجيل مستمر مع نضح المياه المالحة الاوكسيجين (95 ٪ أكسجين و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) ما لا يقل عن 10 دقائق. هو استمرار التروية للغرفة مع الاوكسيجين المالحة طوال فترة التسجيل. هو إعداد تصور باستخدام المجهر تستقيم (Axioskop 2FS ؛ زايس ، Oberkochen ، ألمانيا) مع مرحلة ثابتة وغمر المياه 40X الهدف (Achroplan ؛ الفتحة العددية ، 0.8 ؛ زايس) والبصريات Nomarski. واعتبر GFP مع فلتر BP مضان 505-530.
III. الكهربية
- وتستخدم Pipets من 8-14 Mohms للتسجيلات خلية كاملة
- تجرى التسجيلات الجاري المشبك المشبك والجهد التي تستخدم قائمة EPC7 أو مضخم Axopatch 200B ، وهو 1322A Digidata DA المحول (الأجهزة الجزيئية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) ، وهو البعد ديل 8200 الكمبيوتر (ديل كمبيوتر ، جولة الصخرة ، تكساس) ، وpClamp 9 البرمجيات (الأجهزة الجزيئية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المعزولة إعداد الدماغ كله نوضح في هذا الفيديو يسمح تقييم الآليات الخلوية الكامنة وراء استثارة ونقل متشابك في الخلايا العصبية التي تم تحديدها ، بما في ذلك تلك الموجودة في مسارات معالجة حاسة الشم في الدماغ ذبابة الفاكهة الكبار (ودود يا قو ، 2006). هذا النهج هو مكمل لدراسة نشاط الخلايا العصبية في الدماغ من ذبابة الفاكهة سليمة الكبار (ويلسون وآخرون 2004 جميع) ، في معظم التسجيلات بنفس الطريقة من الخلايا العصبية في المخ لدى الثدييات شريحة مكملة لتسجيلات مستيقظا في الثدييات التصرف. هناك اثنين من المزايا الرئيسية ليطير في الموقع إعداد المخ مقارنة مع شرائح الثدييات. أولا يطير المخ بأكمله يناسب بسهولة في غرفة تسجيل لذلك فإنه ليس من الضروري لاستئصال قطعة صغيرة من نسيج أكبر الدوائر العصبية التي تحدث عندما جعل شرائح الدماغ لدى الثدييات. لذا الدوائر العصبية في الدماغ Drospohila معزولة لا تزال سليمة إلى حد كبير. وثانيا ، والهيئات الخلية لمعظم الخلايا العصبية القريبة من سطح الدماغ ، ويمكن الوصول إليها بسهولة لتسجيل خلية كاملة وأنها ما زالت نشطة وظيفيا عندما perfused باستمرار مع الاوكسيجين المياه المالحة لعدة ساعات.
باستخدام تسجيل قاع الغرفة الزجاجية كما يتيح التعرف على الخلايا العصبية المحددة على أساس موقعهم و / أو التعبير GFP. في هذا الإعداد ، التسجيل أثناء نضح يتطلب تحقيق الاستقرار في المخ. هذا لا يتوافق مع الإجراءات القياسية ، بما في ذلك أسلاك الذهب بموقع استراتيجي أو شبكة النايلون ، والتي هي فعالة للأنسجة مثل شرائح الحصين ، ونظرا لصغر حجم الدماغ كله (~ 1MM). ولذلك فإننا حامل تصميم بإطار البلاتين وعبر الشعر النايلون المتمركزة في الاتصال الدماغ في موقعين فقط للتقليل من الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية التي تقع بالقرب من سطح الدماغ. هذا يستقر في الدماغ ، مع السطح سواء الأمامية أو الخلفية للمواجهة وسطح المعاكس طفيفة فقط يستريح على أرضية غرفة تسجيل. باستخدام هذا الجهاز ونحن قادرون على الحفاظ على الاستقرار بشكل روتيني التسجيلات خلية كاملة لمدة تصل إلى ساعة واحدة ، وحتى من الخلايا العصبية الصغيرة بما في ذلك الخلايا كينيون ، في حين تقوم المعالجات الدوائية التي تتطلب تطبيق حمام من أدوية محددة. ينبغي أن يكون من المفيد أيضا حامل في تأمين عينات الأنسجة الأخرى الصغيرة للدراسات الكهربية مثل شرائح من الحبل الشوكي القوارض الولدان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS27501 DKOD. وقدمت دعما إضافيا لهذا العمل من قبل برنامج المنح HHMI أستاذ لDKOD.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Foceps | Tool | Fine Science Tools | No. 11251-10 | Be careful, never damage the fine tips of forceps |
| Papain | Reagent | Worthington Biochemical | 3126 | 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine |
| Dissecting microscope | SMZ-2B Model:C-PS | Nikon Instruments | Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle | |
| Needle & Syringe | PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co | 305175 & 309602 | Cheap and durable | |
| Upright microscope | Axioskop2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp | |
| Patch clamp amplifier | 200 B | Molecular Devices | ||
| Digidata D-A converter | 1322A | Molecular Devices |
References
- Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
