Summary
Магнитно-резонансная томография (МРТ) становится все более популярным инструментом для изучения фенотип генетически измененных мышей. Эта статья иллюстрирует методы, необходимые для достижения высокой пропускной фенотипирование генетически измененных мышей использованием нескольких мышей МРТ.
Abstract
Области мышь фенотипирование с магнитно-резонансной томографии (МРТ) является быстро растущим, мотивируя необходимость совершенствования инструментов для характеристики и оценки мышиные модели человеческих заболеваний. МРТ является отличным методом для исследования генетически измененных животных. Она способна целом охват мозга, могут быть использованы в естественных условиях, а также предоставляет множество механизмов контраста для исследования различных аспектов neuranatomy и физиологии. Появление сильного поля сканеров, а также возможность сканировать несколько мышей одновременно позволяет быстро фенотипирование новых мутаций.
Эффективное мыши МРТ исследования требуют внимания многие аспекты эксперимента. В этой статье мы опишем общие методы приобретения качественных изображений для мыши фенотипирование с помощью системы, что изображения мышей одновременно в экранированных приема / передачи радиочастотного (РЧ) катушек в общей магнит (Бок и соавт., 2003). Мы ориентируемся на особенности анатомического фенотипирование, важные и доступные приложения, которое показало высокий потенциал воздействия во многих моделях мышей в нашем центре изображения. Прежде, чем мы можем предоставить подробные шаги по приобретению таких изображений, Есть важные практические соображения, как в естественных изображений мозга (Дадзай и соавт., 2004) и экс естественных изображений мозга (весна и соавт., 2007), что должно быть отмечено. Эти вопросы обсуждаются ниже.
Protocol
1. Несколько мыши в естественных изображений мозга:
При визуализации живых животных, несколько ключевых особенностей должны присутствовать во изображений сессии: 1) безопасный метод обезболивания, 2) экологический контроль и 3) физиологические мониторинга. Кроме того, при визуализации нескольких предметов одновременно, Есть добавила сложностей в отношении легкости и скорости подготовки и воспроизводимость животных позиции для облегчения регистрации изображений. Таким образом, три основных пользовательских компонентов были разработаны и изготовлены: система загрузки, чтобы вставить мышь в РФ катушки внутри МРТ, индукция камеры для облегчения подготовки и платформы со встроенными мониторинга приводит к стандартизации позиции.
Загрузка системы:
Система загрузки мыши состоит из двух основных частей: 'мыши улей »и« загрузки массива. Основной функцией мыши улья в том, чтобы положение семь многоножки РФ катушек (Varian ЯМР системы, Пало-Альто, Калифорния) в гексагональную массива внутри отверстие магнита. Загрузки массив предназначен для хранения и транспортировки несколько мышей расположен в 50 тюбиков миллилитр центрифуга с отверстиями через их советы, чтобы обеспечить въезд газа анестезии. После мышей наркоз и сопряжено с мониторингу оборудования на подготовку области в непосредственной близости от магнита, они вставляются в изменение трубы центрифуги и установлен на загрузку массива. После установки всех мышей, загрузки массива транспортируется и вставляется в магнитом и расположен на железнодорожной системы. Железнодорожная система позволяет массив пару с мышью улей при нажатии вниз отверстие магнита. Когда полностью вставлена в магнит, док центрифужные пробирки на систему анестезии доставка по РФ катушек. Изофлюрана в смеси с кислородом поставляется с конца улей мыши к образцу через трубку вдоль оси каждой отдельной катушки. Эта смесь анестетика газ поступает в трубы, мимо мышей и собирает активную очистку блок прикреплен к задней загрузкой массива (рис. 1).
Индукционная палаты:
С изображениями раз может занять до трех часов, сводя к минимуму время животное подготовка очень важна, чтобы ограничить воздействие мыши на анестезию. Таким образом, мы создали пользовательскую камеру индукции упростить процесс подготовки (рис. 2). Пользовательские камеры индукции создает единую среду для индукции и обработки нескольких мышей. Изготовлен из прозрачного акрила, индукция камере функции Самозакрывающаяся силиконовой диафрагмы порты, чтобы минимизировать утечки анестетика и позволяет пользователю получить доступ к внутренней среде без необходимости в специальных перчатках. По сравнению с обычными маской и схемы для одной мыши, индукция камеры достаточно велик, чтобы вместить до двадцати мышами и позволяет бесплатно манипуляции мышей без крепления громоздких трубок и масок. Устройство поставляется с постоянным потоком газа анестетик, который собирают использованием пассивной очистки системы. Резистивные нагревательные элементы используются для обогрева полу камеры для поддержания температуры тела животных в процессе приготовления.
День рождения не
Один из самых неудобных и трудоемких аспектов подготовки мышей для МРТ применении электрокардиограф (ЭКГ) и ректальный электроды датчиков температуры. Кроме того, многие из обычных электродов, такие как манжеты и игольчатых электродов, было установлено, искажают позу животного, что затрудняет стандартизацию позиционирования. Поэтому мы разработали специальную форму, оборудован платформой позиционирования с встроенными ЭКГ, дыхания и датчиков температуры называют "сани" (патент США 7146936) (рис. 3). Движение ограничений из крепежа Velcro были использованы для ограничения движения головы.
Несколько мыши с шагом естественных изображений мозга:
- Все мыши исследований требует, чтобы местные ACC (животных комитета Care), IACUC (Институциональные уходу и использованию животных комитет) или эквивалентного утверждения процедуры обработки мыши.
- Все процедуры, такие как идентификация и взвешивание животных должно проводиться в биологических кабинета безопасности (BSC) и в МРТ Unit. Животные переданы в автоклавируемый пластиковый контейнер и транспортируются на МРТ камеры индукции.
- Мыши под наркозом в камере предварительно нагретого индукции с использованием 4% изофлуран и 4 л / мин кислорода. Животные полностью под наркозом, когда они не реагируют на лапу крайнем случае. Мех из груди удаляется с помощью удаления волос (НАИР) в случае необходимости для обеспечения лучшего контакта с ЭКГ и мониторинга температуры устройств, которые были встроены в пользовательский сани. Ева мазь (Слезы Naturale PM) наносится на глаза, чтобы предотвратить высыхание, и приблизительно 0,3 мл физиологического раствора вводят подкожно для поддержания гидратации.
- Gd-DTPA-BMA (OmniScan) можетбыть использована, если функция повышения контрастности желательно. Если Б-г-DTPA должен быть использован, он будет разбавляться в солевом растворе (конечный объем 300uL) и вводят в разовой дозе 1 ммоль / кг до начала сессии MR через IP.
- Мыши затем загружены в отдельных санях, иммобилизованных с головой ремни и скользить в открытый 50 мл коническую трубку (рис. 3). До 7 живых мышей могут быть проверены за один раз. После того как все животные будут загружены с физиологическими мониторинга связаны, установить изофлуран уровне в отверстие магнита до 2% и уровень кислорода до 8 л / мин.
- Конические трубы монтируются в системы стыковки (рис. 1) предназначен для размещения мышей равномерно в каждой катушки РФ расположен в центре отверстие магнита. После загрузки изофлуран может быть сведена к 0.9-2%. ЭКГ и температуры отслеживаются на каждом животном в течение всего сканирования. Животные в тепле в течение сканирования с помощью теплого воздуха в помещении.
- Продолжительность каждого трехмерного сканирования составляет около 3 часов. Детали следующим образом: быстрый спиновое эхо с TR 2300 мс и TEeff из 36 мс. Эхо поезд длиной 8 с 1 средний. Готовое изображение разрешением 125 мкм (рис. 4).
- Когда сканирование завершено, животные удаляются от магнита и выгружается в теплой камере индукции заполнены на 100% кислорода. Животные переданы в пластиковых герметичных контейнерах и транспортировались с соблюдением BSC. Они расположены на теплую без сквозняков клетку и позволил, чтобы оправиться от наркоза.
2. Несколько мыши бывших естественных изображений мозга:
Независимость от артефактов движения, фиксированный МРТ достигается высокое разрешение, чем жить изображений. Высокого разрешения, трехмерные наборы данных обеспечивают максимальную гибкость при извлечении количественной информации и позволяют автоматизированного анализа изображения. Пользовательских РЧ катушки массив был разработан для параллельного приобретения 16 с высоким разрешением наборов данных MR основных в черепе мозг мыши в ночь сканирование сессий.
16-Coil бывших естественных изображений мозга Array:
На заказ 16-катушки соленоида массив был создан, чтобы изображение 16 образцов одновременно. Такая конструкция улучшает ранее прототипа использована для изображения трех образцов одновременно в 60 мм набор градиент вставки. 8-поворот катушки электромагнита при более ран на концах, чтобы обеспечить равномерную чувствительность в пределах 10% по сравнению с длиной 26 мм и индивидуально экранированными модульными отсеками внутри (Idziak и Haeberlen, 1982). 16 отсеков катушки монтируются к раме (рис. 5), которая позиционирует катушки внутри градиента и зажимы его на месте с помощью пневматических мочевого пузыря, чтобы минимизировать движение.
Несколько мыши бывших естественных шагов визуализации головного мозга:
- Открытые полости грудной клетки и вставить иглу (или безопасности Крылатые инфузионный набор, 25G X 3 / 4) в левый желудочек сердца наркозом мыши (с помощью внутрибрюшинного введения кетамина (150 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) . Cut правого предсердия.
- Transcardiac перфузии на одном уровне с 30 мл комнатной температуре 1 X PBS + 1 мкл / мл гепарина (1000 USP ед / мл) + 2 мМ ProHance со скоростью примерно 100 мл / час.
- Фиксация проходить с 30 мл 4% PFA (комнатной температуры) + 2 мМ ProHance на 100 мл / час.
- Обезглавьте и снять кожу, нижнюю челюсть, уши, хрящевой кончик носа.
- Место оставшиеся строении черепа у 4% PFA + 2 мм ProHance течение ночи при 4 ° C.
- Трансфер в 1X PBS + 0,02% азида натрия + 2 мм ProHance.
- Высокое разрешение трехмерной МРТ в 7 Тесла происходит между 4 дня и не более 2,5 месяцев после перфузии. Мозги помещаются в 16-канальная катушка массива (рис. 5).
- Изображений параметры следующие: быстрое спиновое эхо с TR 325 мс и TEeff 30 мс, эхо поезда длиной 6 с 4 средних. Окончательный изображений изотропным разрешением 32 мкм (рис. 6) и длительность проверки составляет около 12 часов.
- После сканирования, место черепа в 10% формалине + 2 мм ProHance для сохранения.
3. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Системы мыши нагрузки. "Загрузки массив" и "мышь улей", связанных с общей железнодорожной системы стекловолокна.
Рисунок 2. Индукции камеры.
Рисунок 3.) Сани, демонстрируя встроенные датчики контроля и подголовника. б) под наркозом мыши на санях с подголовником прилагается. Сани сборки легко скользит в центрифуге трубки.
Рисунок 4. в естественных условиях несколько изображений мозга от одного 3 часа трехмерного сканирования.
Рисунок 5. 16-канальной катушки массив для сканирования 16 фиксированных образцов мозга.
Рисунок 6. Представитель экс-живом мозге изображения.
Discussion
И в естественных условиях и бывших естественных мыши систем визуализации изображения нескольких предметов в один раз, чтобы увеличить пропускную способность визуализации исследований значительно без увеличения изображения времени. Изображения мозга как в естественных условиях и бывших естественных нескольких мышей методы визуализации, имеют высокое качество и пригодны для фенотипирование крупных и мелких структур в мозге мыши соответственно.
Чтобы свести к минимуму время на подготовку животного нескольких образцов, распараллеливание процессов имеет первостепенное значение. Например, развитие индукции камеры позволило индукции нескольких образцов одновременно, и сани уже синхронизированы применения ЭКГ и датчиков температуры в то время как орган по стандартизации позиционирования. Кроме того, наши бывшие естественных изображений система позволяет нам приобретать высоким разрешением трехмерные изображения 16 фиксированных весь мозг в одно время, которое идеально подходит для высокой пропускной исследования фенотипирование.
Возможные ограничения в нашей системе естественных изображений включают неспособность индивидуально управлять анестезией и температуры для каждой мыши. При необходимости индивидуального контроля анестезии может быть реализован с добавлением эксклюзивных анестезии испарители для каждой мыши. Еще одним ограничением в системе естественных изображений является то, что сканирование ограничивается мышей, которые являются менее чем приблизительно 32 граммов. Однако, есть план в настоящее время увеличение размера клубка для размещения больших животных.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа является частью мышь изображений центр (MICE) в госпитале для больных детей и Университета Торонто.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP (AErrane) | Baxter Internationl Inc. | CA2L9108 | |
| NAIR | Church & Dwight Co. | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | DIN 02082519 | |
| Omniscan (gadodiamide injection USP) | GE Healthcare | J-110A | |
| Custom Sleds | Dazai Research Instruments | ||
| PBS w/o Ca and Mg | Wisent Inc. | 311-010-CL | |
| Heparin 10000USP/10ml | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02264315 | |
| ProHance (gadoteridol injection USP) | Bracco Diagnostics | 11181 | |
| Parafolmadehyde (powder) | Sigma-Aldrich | P-6148-500g | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| Formalin 10% | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Bock, N. A., Konyer, N. B., Henkelman, R. M.
- Dazai, J., Bock, N. A., Nieman, B. J., Davidson, L. M., Henkelman, R. M., Chen, X. J. Multiple mouse biological loading and monitoring system for MRI. Magn. Reson. Med. 52, 709-715 (2004).
- Spring, S., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Sexual dimorphism revealed in the structure of the mouse brain using three-dimensional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 35, 1424-1433 (2007).
- Idziak, S., Haeberlen, U. Design and construction of a high homogeneity rf coil for solid-state multiple-pulse NMR. J. Magn. Reson. 50, 281-288 (1982).
