Summary
行为分析测量的运动功能，学习和记忆能力
Abstract
在遗传方式的进步使在涉及人类神经退行性疾病，利用果蝇作为模型系统1基因的研究。大多数这些疾病，包括老年痴呆症，帕金森氏症和亨廷顿氏病的特点是年龄依赖性，在学习和记忆功能和运动协调 2恶化。在这里，我们使用行为的分析 ，包括3负geotaxis检测和厌恶phototaxic抑制的测定（APS法）4,5，表明一些与人类神经退行性疾病相关的行为特征，可以在果蝇扼要。在负geotaxis检测，苍蝇的自然倾向对重力时，激动是用来研究基因或条件，可能会妨碍的运动能力。在APS分析，学习和记忆功能的测试正趋光飞行训练关联厌恶苦味轻，从而避免这种情况，否则自然的倾向，走向光明。培训后6个小时是用来评估记忆功能测试这些受过训练的苍蝇。使用这些检测，对发展神经退行性疾病的任何遗传或环境因素的贡献可以很容易地在果蝇研究。
Protocol
1。简介
在这段视频中，我们将展示两个行为实验用果蝇表现出测量运动和学习记忆功能，在神经退行性疾病的损害。首先，我们将呈现怎样的运动行为，可以使用负geotaxis检测。其次，我们将评估使用正趋光，进行培训，以联营公司与厌恶苦味的光，然后进行测试，6小时后，以评估记忆功能的果蝇的学习和记忆能力。最后，我们将讨论这些行为检测的影响和限制。
2。设备和试剂
- 飞行工作
- 立体声范围（蔡司）
- 推动了苍蝇的小画笔
- 果蝇的二氧化碳（CO 2）麻醉器具（Geneseesci公司）
- 负Geotaxis含量
- 28.5 × 95毫米的聚苯乙烯瓶（国会瓶，公司）
- 迷你报警定时器/秒表（VWR国际）
- Sharpie笔
- 胶带
- 厌恶的趋光性抑制法
- 奎宁盐酸盐（Sigma公司Aldrich公司; CAS编号：6119-47-7）
- 蒸馏水
- 按重量计算精确的稀释数字测量规模
- 快速断开连接器，高密度聚乙烯（NALGENE VWR目录号62868-021）
- 15 mL离心管中（VWR International的），从封闭式的2毫升大关，快速断开连接适配器适合光源
- 单通道200微升pipetter加载到过滤纸衬腔奎宁解决方案
- T -迷宫（简单的行为系统，图1）
- 铝箔
- 光源（蔡司）
- 与红色光灯。
- 滤纸
- 迷你报警定时器/秒表（VWR国际）
3。准备苍蝇
- 苍蝇标准玉米面琼脂糖蜜酵母中保持在25 ° C下12小时的光/暗周期。
- 处女蝇羽化当天的碳二氧化碳麻醉下被隔离。老化研究，果蝇维持在每小瓶20组，并转移到一个新的小瓶，每3天。重要的是使用来自同一父母老化研究的交叉的兄弟姐妹苍蝇，以减少遗传背景所产生的分歧。
- 对于这两种实验中，苍蝇是绝育手术和维持在10％小瓶苍蝇。行为上的性别差异是显着的，最好是不要混用雄性和雌性果蝇在一项研究中，作为数据可能很难解释和重现6。
- 负geotaxis检测，苍蝇到每小瓶10个组进行排序和测试麻醉后一小时。重要的是苍蝇从麻醉中完全恢复，因为这可能影响的运动活动。
- 为APS检测，各组的果蝇被放置在一个空聚苯乙烯小瓶水滤纸沾了六个小时前进行检测。这确保了苍蝇饿死之前检测和厌恶的味道会更加敏锐的。只是前进行检测，是摆在每个飞从一组十一个空的15ml离心管，然后封顶松散，以避免逃生。
4。负Geotaxis含量
- Geotaxis一般测十到二十组十个人同一基因型或治疗（100-200苍蝇每个基因型/治疗总）7。十大女性或男性苍蝇的CO 2麻醉设备和放置在一个单独的小瓶各组的排序群体。允许苍蝇从麻醉中恢复的至少一个小时。
- 准备为每个组的登山设备，这样两个空的聚苯乙烯瓶垂直面对对方磁带加入。重要的是要确保，小瓶的开口是完全相互对齐，提供一个苍蝇，甚至攀岩表面。
- 对于较低的小瓶，衡量一个8厘米以上的底部表面的垂直距离和标记每一瓶小瓶整个圆周周围绘制一个圆。
- 转移到下仔细地防止任何飞逃逸小瓶一组十个苍蝇。立即盖样品瓶和磁带，牢固地附近的联系开口较低的小瓶。允许苍蝇前进行检测，使其恢复到新的设置为1分钟。
- 轻轻拍打苍蝇瓶底部和措施的苍蝇，可以爬10秒8厘米以上的自来水后。
- 重复这个实验中，对同一组十倍允许为1分钟的休息时间，在每个审判。
- 记录每个组的苍蝇数量，通过为8厘米的标志总苍蝇的百分比。
5。厌恶的趋光性抑制含量（APS含量）
来自乐布雷斯和Buecher（2002）4改编，本实验利用果蝇正趋光行为，培养他们联想到与厌恶刺激（在这种情况下，苦味的奎宁） 。野生型果蝇的培训/调节阶段后，将能联想到点燃的面积和厌恶的味道，避免它。学习能力受损的果蝇会失败，使这个协会。此外，APS的检测也可以被用来衡量短期记忆功能的苍蝇已经受到训练有素的苍蝇以相同的测试后6小时空调，测试自己的能力，记住所学的任务5。
- 准备奎宁解决方案
- 奎宁盐酸溶解在蒸馏水中，使一个0.1M原液（1.98克于50ml蒸馏水）。在-20 ° C原液可保持长达一年的小等份
- 准备一个1微米的工作解决方案，在蒸馏水稀释的原液。
- 准备T -迷宫
- T -迷宫陷阱门和两个独立的商会，一个“黑暗”室，“点燃”室（图1）由中心柱。
- 商会准备：取两个15毫升塑料离心管中，并切成2毫升标记从底部封闭与手册年底看到。适合的两端连接适配器，并用封口膜密封连接。管端的适配器作为输入插槽鹅颈光源。与光源连接管和管将“点燃”室。包装用铝箔作为“黑马”商会的其他管。
- 加入180uL无论是蒸馏水或奎宁溶液过滤器在光室纸张和地点。
- 旋中心柱两侧的照明和黑暗商会组装T -迷宫，在中间封闭（图1）陷阱门。
- 插入点燃室的光源。
- 训练苍蝇的趋光性抑制与厌恶的刺激
- 拧下从T -迷宫暗腔，并转移到这个会议厅内飞，并立即拧暗管的迷宫。
- 关闭在房间里的灯和转向红灯。
- 允许飞往逐渐适应在30秒的暗腔，慢慢打开照亮源点燃室。慢慢打开活门分隔两院。
- 如果飞各界在10秒内点燃室，它被认为是积极的趋光，准备检测培训。在趋光性的失败表明在视觉系统的问题和苍蝇与负趋光性，需要从检测中排除。
- 厌恶的趋光性抑制（APS）培训，挖掘飞，表现出积极的趋光性暗腔，关闭活门和关灯。允许30秒的驯化。在这段时间内点燃室与奎宁溶液的滤纸。慢慢打开活门，并把灯打开。允许飞步行到奎宁涂点燃室。一分钟后，点选飞暗腔，并重复这9次以上。 （通常情况下，野生型果蝇避免点燃后3至5个培训试验室）。
- 训练结束后，立即将进行五个测试试验。在每个测试试验中，让训练有素的飞行，步行到点燃室，10秒后，指示灯会亮起。如果步行到点燃的小瓶，将被记录为“通行证”，这是相当于“通过加固任务教训”。合格率连续超过五年的审判记录，如下面图2为PC0（0小时后空调）所示。
- 评估在果蝇的短时记忆功能
- 每个飞行训练和初步的PC0录音后，放回其原来的食品瓶，并保持预留了六个小时。
- 六个小时的培训后，受每个飞5试验再像以前一样的方式，并记录的次数飞避免（通过）或进入（失败）点燃的小瓶。这个合格率记录为PC6（6小时后空调），这是短期记忆的一个指标。
6。数据的解释和统计分析
- 负Geotaxis含量
- 从这个实验中产生的原始数据，穿越8厘米的标志，在10秒后，各组的苍蝇数量。转换成百分比，并计算各组的平均合格率超过10节。
- 每组的平均合格率与平均值的标准误差（SEM）（基因型，治疗等）的数据用图形表示。
- 群体之间的差异然后可以被确定为显着性或不使用学生t检验或方差分析。
- 厌恶的趋光性抑制法
- 从这个实验的原始数据表示为每飞行的次数，避免点燃连续5试验室。的合格率的计算公式为总试验成功避免试验的百分比。以这种方式计算最低15％组苍蝇的平均合格率。
- 数据以图形方式表示为平均合格率的PC0（后立即空调;“学习”的指标）或PC6的平均合格率（后6小时空调;“记忆”的指标）与各自的扫描电镜。
- 与野生型和基因操纵良性“组（如绿色荧光蛋白的过度表达苍蝇）适当团体之间的学习和记忆指数比较。
7。代表性的成果
在这个视频实验中，我们正在评估在中枢神经系统的学习记忆和运动障碍，在果蝇中过表达的人类头，并比较他们的表现苍蝇高表达绿色荧光蛋白的。已被证明在果蝇神经元的过度表达人类头，导致大脑中的 8严重空泡，导致学习和记忆功能 9的重大赤字。如图2a所示，10日龄的男性或女性过度表达人类头苍蝇有显着的运动功能的赤字相比，年龄相匹配的绿色荧光蛋白过度表达的苍蝇。此外，这些果蝇没有关联苦味PC0合格率对照组相比，作为以及不能记住这个协会由PC6的合格率（图2B）下降所示。本实验进一步证实， 果蝇模型可以用来研究人类神经退行性条件，并扼要一些在人类和哺乳动物中观察到的行为表型。
图1。 T -迷宫设置厌恶的趋光性抑制法。整体APSA连接“点燃”猎鹰管，衬有滤纸和左侧（在箔覆盖）的“暗”管，一个活门分隔光源实验的实验装置。 B.在训练和测试阶段，飞在黑暗中商会和陷阱门开了，在点燃室后，指示灯会亮起。
图2。代表从反面geotaxis和使用APS实验结果苍蝇与泛神经驱动器的高表达绿色荧光蛋白或的头。负geotaxis检测，10天岁的男性（蓝色列）或女性（红色柱）苍蝇高表达绿色荧光蛋白表现出较高的登山活动，比头高表达苍蝇。 B. 20日龄雌性果蝇高表达绿色荧光蛋白表现出更好的学习（PC0）和内存（PC6）比头高表达苍蝇的功能。
Discussion
既是消极geotaxis和APS检测强有力的行为分析来衡量运动器官或遗传或环境操纵产生的学习和记忆能力的变化。不过，也有一些有待进一步优化这些实验的缺点。
在负geotaxis检测，某些基因的突变可以使果蝇严重的运动功能障碍。苍蝇在这种情况下，难以攀登的墙壁，在搅拌后的重力。直接测量运动的其他行为分析，可能更为合适。这些实验包括翻正反射行为的措施瘫痪，并检获10和11 optomotor行为记录失去运动协调。
在APS法，第一个障碍，可随机点燃室门口停不前进的苍蝇。这将成为一个问题，如果老龄化研究的条件之一，因为旧的苍蝇一般较不活跃，往往会停下来休息很长一段时间。在这种情况下，实验者提供机械性刺激，以促进运动，这并不总是有效的的。其次，可能有人会说，去点燃室从积极的趋光性的损失结果失败。这是很少见的情况下，由于以前的工作表明，苍蝇回头光响应一旦负强化是删除4。第三，接触厌恶刺激的持续时间可能会有所不同从审判审判。这种变化通常可以减少浸泡滤纸包围室的内壁，以防止苍蝇避免奎宁。此外，实验者可以确保每个飞行花费足够的时间增加金额另有说明1分钟的时间花费在会议厅内，用滤纸接触。
总之，负面geotaxis和APS检测评估行为赤字的快速和简单的方法和定量表示运动功能和果蝇的学习和记忆能力。这些检测建模在果蝇的人类神经退行性条件，特别是在有用的。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢查尔斯Luetje博士提供的T -迷宫和行为房间。这项工作是由美国心脏协会（遐），国立神经系统疾病和中风格兰特R01NS64269（RGZ），和皮尤慈善信托基金（RGZ）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Vial | Capitol Vial, Inc. | 28Fly | 28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb. |
| Dissecting Stereoscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1432-979 | 2 branches goose-neck light guide (12V/30W) |
| Quinine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 6119-47-7 | Dissolve in distilled water. |
| Quick Disconnect Connectors | Nalge Nunc international | 62868-021 | High-Density Polyethylene |
| T-Maze | Simple Behavioral Systems | ||
| Single-channel 200 μL pipette | Eppendorf | 022443305 |
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