Summary
نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول بسيطة لإنشاء مكتبة عشوائية متحولة عن تسلسل هدف ما. نظهر كيف يمكن أن يقترن هذا الأسلوب ، والتي تتم في الجسم الحي في كولاي ، مع تحديدات وظيفية لتطوير الأنشطة الأنزيمية جديدة.
Abstract
الجيل كفاءة التنوع الجيني تمثل أداة لا تقدر بثمن الجزيئية التي يمكن استخدامها لتسمية توليف الحمض النووي ، لإنشاء توقيعات الجزيئي فريدة من نوعها ، أو أن تتطور البروتينات في المختبر. هنا ، فإننا نقدم البروتوكول الذي يسمح للجيل من المكتبات (10> 11) كبير متحولة عن هدف تسلسل معين. ويستند هذا الأسلوب على تكرار ترميز ColE1 البلازميد التسلسل المطلوب من قبل متغير منخفضة الدقة من بوليميريز الحمض النووي الأول (LF - بول الأول). تحول الهدف البلازميد الى سلالة من mutator E. القولونية ومطلي على وسائل الاعلام الصلبة ، والغلة بين 0.2 و 1 الطفرات / كيلوبايت ، اعتمادا على موقع الجين المستهدف. تحقيق سرعات أعلى للطفرة التي بالتكرار هذه العملية من الطفرات. بالمقارنة مع طرق بديلة من الطفرات ، لدينا بروتوكول تبرز لبساطتها ، والأمر لا ينطوي على الاستنساخ أو PCR. وهكذا ، لدينا وسيلة مثالية لوضع العلامات طفرية البلازميدات أو غيرها من القوالب أنا بول أو لاستكشاف قطاعات واسعة من الفضاء تسلسل لتطور الأنشطة غير موجودة في الهدف الأصلي. لرقابة مشددة المكانية التي يمكن أيضا PCR أو عشوائية أساليب العرض قليل النوكليوتيد المستندة يمكن تحقيقه من خلال الاستنساخ اللاحقة من أجزاء معينة من المكتبة. هنا نقدم البروتوكولات توضح كيفية إنشاء مكتبة عشوائية متحولة وكيفية وضع المخدرات على أساس التحديدات في E. القولونية لتحديد الأنشطة البيوكيميائية المسوخ العارضة الجديدة.
Protocol
أولا انشاء المكتبات المسخ عشوائية
بول تتوسط الأول من بدء النسخ المتماثل ColE1 البلازميد (إعادة النظر في (1-3). يستند لدينا طريقة من الطفرات في وضع تسلسل الهدف في المتاخمة ColE1 البلازميد إلى الأصل أو النسخ ونشر ذلك في التعبير عن الخلايا منخفضة الدقة بوليميريز الحمض النووي الأول (LF بول الأول). LF - بول الأول هو الحمض النووي بوليميريز متحولة أنا ترميز three الطفرات التي تقلل من الاخلاص للتكرار ، أي I709N (في عزر A) ، A759R (في عزر B) وD424A (تعطيل تصحيح التجارب المطبعية) 4،5 . LF - بول وأعرب لي في سلالة كولاي ، JS200 ، التي لديها أليل حساسة للحرارة الأول بول (polA12) (6) بحيث LF - I بول يصبح النشاط الغالب عند 37 درجة مئوية المتماثل لل تسلسل الهدف في الخلايا تحت polA12 نتائج شروط تقييدية في توليد مكتبة متحولة عشوائي. الطفرات هي أكثر كفاءة في الثقافات المشبعة 4. ولأسباب لا تزال غير واضحة ، الطفرات غير مستمرة ، أي وتيرة الطفرة لا زيادة خطيا مع عدد للأجيال مرة واحدة تصل إلى ثقافة التشبع ، حتى لو سمح لتوسيع الخلايا في وسائل جديدة لذلك ، مما يزيد العبء تحور في المكتبة يتطلب تكرارية جولات من الطفرات والانتعاش البلازميد ، وهنا نقدم بروتوكولات لالطفرات أنا LF - بول. علما أنه تم البروتوكولات المقدمة هنا مبسطة إلى حد كبير بالنسبة إلى 4 الوصف الأصلي لدينا من أجل تسهيل عملية التكرار لتحقيق الطفرة المرجوة للتحميل (الشكل 1).
المواد
- الخلايا : JS200 recA718 polA12 (TS) uvrA155 trpE65 خط الطول 11 - سولا
- JS200 WT بول الأول : التعبير عن نوع الخلايا JS200 البرية (WT) بول لي
- JS200 LF - بول الأول : التعبير عن الإخلاص JS200 المنخفضة (LF) بول لي
- سلالة قراءات : JS200 WT - I أو بول (للتكامل) سلالة تفتقر إلى نشاط معين
- الهدف البلازميد
- البلازميد يحتوي على الأصل من النسخ المتماثل مع ColE1 الجين المستهدف المستنسخة في
1. قبل الطفرات : إعداد الكهربائية الخلايا المختصة JS200 أنا LF - بول
- اختيار واحد JS200 مستعمرة LF - I من لوحة بول LB نمت عند 30 درجة (شروط متساهلة) بين عشية وضحاها C تحتوي على اختيار المضاد الحيوي المناسب لتحمل البلازميد LF - بول الأول (0.03mg / مل الكلورامفينيكول) ووضع مستعمرة في اختبار أنبوب يحتوي على 8 مل من LB مع الكلورامفينيكول. تنمو ثقافة عند 30 درجة مئوية وتهتز في 250rpm بين عشية وضحاها.
- في الصباح ، وتوسيع الثقافة عن طريق سكب مل 8 من JS200 بول LF - I في قارورة تحتوي على 400 مل LB مع الكلورامفينيكول. السماح للثقافة تنمو بمعدل 30 درجة مئوية في حين تهز 250rpm حتى يصل إلى 600 ألف من 0،4-0،7 (عادة 3 - 4H).
- مرة واحدة في بقيمة 600 ألف من 0،4-0،7 ، والبرد الثقافة على الجليد الرطب لمدة 15 دقيقة.
- نقل الثقافة إلى حاوية مبردة ملائمة لالطرد المركزي. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف ، ثم إضافة 10 مل من الجلسرين (على الجليد الرطب) معقمة ومبردة 10 ٪ إلى الحاوية وإعادة تعليق باستخدام خلايا ماصة المصلية.
- نقل الخلايا إعادة علقت في أنبوب مخروطي 50 مل. ملء أنبوب مخروطي يصل الى علامة 45 مل مع الجلسرين بنسبة 10 ٪ ومن ثم الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية و 4000rpm.
- تخلصي من طاف ، إضافة مل مرة واحدة ما بين 10 و 10 ٪ من الجلسرين للأنبوب مخروطي الشكل ، وإعادة تعليق الخلايا باستخدام ماصة المصلية أو العادي. مرة أخرى ، تملأ أنبوب مخروطي إلى علامة 45 مل مع الجلسرين بنسبة 10 ٪ وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية و 4000rpm. تكرار هذه العملية مرتين أكثر لإزالة كل آثار الأملاح.
- بعد الدوران النهائي ، وإعادة تعليق بيليه من الخلايا في جزء منه على قدم المساواة الجلسرين بنسبة 10 ٪ (أي اعادة تعليق 2 مل من الخلايا مع 2 مل من الجلسرين 10 ٪).
- قسامة ما بين 100 و 500 ميكرولتر ميكرولتر من الخلايا في أنابيب التخزين علقت عدة. سريع تجميد الخلايا على الثلج الجاف ومن ثم تخزينها في -80 درجة مئوية.
- قبل استخدام الخلايا الكهربائية المختصة التحولات ، أذاب الخلايا ببطء على الجليد.
2. الطفرات : تحويل هدف البلازميد
- 40 ميكرولتر ماصة للالكهربائية الخلايا المختصة JS200 أنا LF - بول وبين 250ng - 30 من الحمض النووي المستهدف البلازميد الى electroporation 2mm وكفيت الفجوة.
ملاحظة # 1 : يمكن إجراء عملية ColE1 GFP البلازميد التي تحتوي على طريق الطفرات في الجينات بالتوازي مع الهدف كمجموعة تحكم. بعد الانتهاء من قراءة هذه الخطوة ، يمكن مطلي GFP على لوحات تصور وآجار LB عن الطفرات. المستعمرات التي تظهر قاتمة مظلمة أو احتواء الطفرات تعطيل. - نبض الخليط في electroporator في 1800V. الاختيار ثابت الوقت (تي سي) لضمان ظروف electroporation موحدة لكل عينة ؛ مثالي T C = 5-6 ثوانى.
- استرداد خليط الخلية / الحمض النووي في 1 مل من مرق LB لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية (الدقةtrictive الشروط) تهتز عند 250 دورة في الدقيقة.
- لوحة 50 ميكرولتر من الثقافة الانتعاش على طبق بتري آجار LB 100mm مسبقا إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية ، وتحتوي على كل من الكلورامفينيكول تركيز مناسب من مضاد حيوي لهدف اختيار البلازميد.
ملاحظة : # 2 : تهدف إلى لوحة الخلايا في "قرب حديقة" التركيز. يتم تعريف "قرب حديقة" التركيز على عدد لا يحصى ولكن متميزة من المستعمرات (> 1000 المستعمرات / طبق 100mm). التخفيف مطلي ، إن وجدت ، وسوف يعتمد على كيفية الكهربائية المختصة الخلايا. إذا كانت الخلايا ليست غاية الكهربائية المختصة و "العشب القريب" لا يمكن تحقيقه عن طريق طلاء ثقافة الانتعاش "أنيق" ، ثم الطرد المركزي ثقافة الشفاء لمدة 2 دقيقة في 4000rpm ، صب قبالة طاف ، وإعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من مرق LB ولوحة الثقافة. - لاحتضان dishe بيتري (ق) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
3. الطفرات : الانتعاش البلازميد
- في اليوم التالي ، وغسل الأطباق بيتري التي pipetting 2 مل من مرق LB على الخلايا. نقل المستعمرات البكتيرية من أطباق بتري آجار LB LB إلى مرق ب "تنقية" أجبرتها على الفرار لوحة بقضيب تعقيم الزجاج على شكل مثلث. إضافة 1 مل من مرق LB الأولى ، جمع الغسيل وكرر الإجراء مع مل الثاني من مرق LB.
- عزل DNA البلازميد من غسل لوحة. (وهذا يشكل DNA البلازميد المكتبة).
ملاحظة # 3 : غسل جمعها من لوحة LB قد تكون كثيفة جدا لالإعدادية مصغرة في اكملها. إذا كان هذا هو الحال ، مصغرة الإعدادية الأقصى يخصص المبلغ مجموعة مصغرة الإعدادية الخاص (عادة ، وهذا ينطوي على تمييع يغسل الخاص OD = 1 و الإستعداد ~ 3 مل من ثقافة المخففة) أو مقياس يصل إلى الإعدادية ، ماكسي
4. التكرار
- تقييد 1μg من الحمض النووي للبلازميد معزولة مع انزيم التقييد الذي linearizes القوات اللبنانية بول أنا البلازميد ، ولكن لا قطع تستهدفها البلازميد (التكميلي الشكل 1).
- تنظيف هضم تقييد استخدام عدة لتنقية الحمض النووي.
مذكرة رقم 4 : هذه الخطوة تزيل كل آثار الإنزيم التقييد والعازلة والخمسين. هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على تركيز الملح منخفضة لتحولات الكهربائية المختصة لاحقة. - إعادة تحويل 30 250ng من الظهر المستهدفة البلازميد مقيدة في مكتبة جديدة JS200 الخلايا أنا LF - بول لوضع المكتبة من خلال جولات لاحقة من الطفرات.
ملاحظة # 5 : Linearizing للبول أنا البلازميد باستخدام انزيم التقييد يضمن فقط يحصل تحول الهدف البلازميد. - كرر البابين 2 و 3.
5. قراءات
- تقييد الحمض النووي البلازميد معزولة مع انزيم التقييد (ق) التي تستهدف كلا من linearizes البلازميد وأنا بول البلازميد. تشغيل هضم على agarose هلام 1 ٪ لضمان كمية ونوعية البلازميدات. تقييد ~ 400ng من الحمض النووي للبلازميد معزولة وعادة ما يكفي لتحليلها.
- تقييد 1μg من الحمض النووي للبلازميد معزولة مع انزيم التقييد الذي linearizes القوات اللبنانية بول أنا البلازميد ، ولكن لا قطع البلازميد التي تستهدفها.
- تنظيف هضم تقييد استخدام عدة لتنقية الحمض النووي.
- تحويل مكتبة يقتصر الهدف البلازميد الى سلالة قراءات لتوصيف الطفرات.
II. الشاشة متحولة والتحليل باستخدام لوحات النمو سمة التدرج.
من أجل توضيح كيف يمكن أن يقترن التنوع الواسع الجينية موجودة في مكتباتنا إلى مجموعة وظيفية ، وهنا نقدم بروتوكولا لمكافحة المخدرات والمستندة إلى التحديدات وظيفية في الجسم الحي في E. القولونية. ويستند هذا الأسلوب على النمو على طول الانحدار المخدرات على أجار الصلبة. هذا يسمح للتوصيف عينات متعددة في وقت واحد (حتى 12) على مجموعة من التركيزات ، وتوفير مجموعة واسعة ديناميكية من العلاج بالعقاقير واحد. ميزة أخرى هي أن قراءات غير الخطية من هذا الاختبار مخازن الخلافات المعتدلة في البقاء ، ضمن مجموعة 2 مرات. وبالتالي ، فإن هذا الفحص السمسة مقاومة يوفر وسيلة قوية وسريعة لتحديد المكتبات ومتحولة لتحديد الشخصية المظهرية من المسوخ الفردية. التين. 2 يبين مثالا لكل من هذه الاستخدامات : لوحة مجموعة مختارة من معارض فردية من المسوخ مكتبة الاكسدة الإنسان ABH2 demethylase. ويتم اختيار المستعمرات تزايد وزن فوق عتبة لزيادة الحماية من السمسة التي يسببها عامل مزج بالميثيل سلفونات الميثان الميثيل (MMS) 7. لوحة باء يظهر مثال التدرجات المستخدمة لتوصيف استنساخ الفردية. يظهر مستوى المقاومة للسيفوتاكسيم الجيل الثالث من السيفالوسبورينات المضادات الحيوية على التدرج لأجار WT - β اكتاماز ومدد لمدة الطيف المسوخ ، وR164H E104K R164S G267R 4. علما أن الاعتماد على قوة التأثيرات الملاحظة ، فإن أكثر من لوحة واحدة قد تكون ضرورية لالكميات الكافية : في حين أن التدرج 0.4mg/ml يسمح للمقارنة مباشرة للاستنساخ السيطرة ، ومستوى مقاومة أقوى متحولة لا يمكن إلا أن تنشأ باستخدام تركيزات أعلىtration من سيفوتاكسيم (4mg/mL).
المواد
- معدات
- 100x100x15mm مربع أطباق بتري (فيشر العلوم 0875711A #)
- 100mm طبق بيتري الجولة
- 25x75x1mm شريحة المجهر والزجاج (فيشر الكيمياء # 1255015)
- تخرج 50 مل أنبوب
- وسائل الاعلام
- آجار LB : ذاب ومعايرتها في حمام الماء عند 56 درجة مئوية
ملاحظة # 6 : درجة الحرارة وسائل الإعلام قد تؤثر على الاستقرار ، وبالتالي نشاط المخدرات أو مجمع يجري فحصها. - آجار الناعمة : ذاب ومعايرتها في حمام مائي إلى 42 درجة مئوية
- آجار LB : ذاب ومعايرتها في حمام الماء عند 56 درجة مئوية
1. بناء على التدرج
- علامة ten الممرات ، متباعدة بشكل متساو عبر واحد من حافة الجزء السفلي من طبق بيتري مربع.
- مكان الطبق على المنحدر بحيث يتم رفع الحافة السفلية ملحوظ 7mm ؛
ويمكن استخدام عشب كثيف أو كائن مسطح الأخرى كدعم لرفع الطبق. صب 25 مل من الحارة (~ 56 درجة مئوية) آجار LB تمتزج جيدا مع التركيز المناسب للعامل في اختيار الطبق ميلا. هذه هي الطبقة السفلية من التدرج. تأكد من أن أغار LB المعاطف بالتساوي طبق بتري بحيث مرتفعة ، في نهاية ملحوظ في صحن يحتوي على ~ 1MM من آغار LB ويحتوي الجزء خفضت ~ 8MM من آغار LB. ثم أغار تسمح لتعيين لمدة 10-15 دقيقة.
ملاحظة # 7 : للحصول على عملاء اختيار مسعور ، ويمكن إضافة بالسطح 0.1 ٪ (B مستحلب مضاد الرغوة) إلى آجار LB لتسهيل التعليق والتوزيع الموحد للمخدرات. إضافة إلى بالسطح آغار LB العقيمة دافئة مع قوي يهز قبل إضافة عامل التحديد. ينبغي للتعليق بالسطح كما ضباب غرامة قطرات صغيرة ، قطرات كبيرة تشير وسائل الإعلام حار جدا ، وربما تمنع توزيع موحد للدواء الاختبار. - بعد أول 25 مل من آجار LB قد تصلب ، يتم نقل الطبق على سطح مستو. المقبل ، يتم صب 25 مل من آجار LB دون اختيار وكيل لتراكب آجار LB first السطح. هذه هي الطبقة العليا من التدرج. تأكد من أن أغار LB يغطي كامل سطح الطبقة السفلية. مع تغطية منحرف غطاء للتهوية ، والسماح لمجموعة أجار لمدة 10-15 دقيقة.
ملاحظة # 8 : يكون على بينة من المخاطر المحتملة الهباء الجوي والتطاير من مجمع اختبار ؛ تصب في التدرجات غطاء السلامة الكيميائية أو البيولوجية إذا المنصوص عليها في متطلبات السلامة الكيميائية.
ملاحظة # 9 : يجب استخدام أطباق التدرج داخل 4H للحفاظ على التدرج من المخدرات أو اختبار تركيز مركب.
2. ختم نقل البكتيريا
- وينبغي أن تكون لينة آغار معايرتها إلى 42 درجة مئوية. نقل 2 مل من السائل آغار الناعمة في غطاء أو أسفل طبق بيتري الجولة 100mm. 40 ميكرولتر ماصة للثقافة البكتيرية في آغار الناعمة ثم مزيج بواسطة هزاز لوحة.
ملاحظة # 10 : مرحلة النمو ثقافة جرثومية قد تؤثر ردها على المخدرات أو مجمع الاختبار. وينبغي استخدام الثقافات في مرحلة السجل أو الثقافات بين عشية وضحاها في المرحلة ثابت مع تناسق لتحقيق نتائج موحدة. كثافة الخلايا ويمكن أيضا نتائج الانحراف النسبي ، وبالتالي يجب أن تضعف جميع الثقافات لأنها تطابق القيم الكثافة 600. وينبغي أن تضعف الثقافات بين عشية وضحاها أن يكون هناك 600 ألف كثافة أقل من 1.0 - معطف طويل من حافة الزجاج شريحة المجهر مع خليط آغار الناعمة. ثم ، محاذاة حافة الشريحة المغلفة مع علامة أسفل (من الأقل إلى تركيز عال) على طبق التدرج ، تلمس الشريحة لسطح آغار. لمسة ناعمة غير كافية لنقل الشريط من آغار الناعمة على السطح التدرج. ثم يتم تعيين الشريحة المخصصة للتنظيف وإعادة استخدامها.
- كرر هذه العملية ، للفترة المتبقية من العينات الجرثومية. وينبغي أن تدرج على عينات مرجعية كل طبق التدرج إذا كان يتم تشغيل تدرجات متعددة.
- احتضان قمة طبق التدرج بين عشية وضحاها إلى أسفل عند 37 درجة مئوية. قد مرات ودرجات حرارة الحضانة تختلف عن قراءات مختلفة سلالات بكتيرية ولكن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية هو عادة كافية للنمو مرئية.
3. تصوير وتحليل النمو
- التصوير : بعد نمو بين عشية وضحاها ، ويمكن تصويرها مباشرة أو تدرجات الثابتة وملطخة حل 0.2mg / مل أكريدين البرتقالية في EtOH 95 ٪ ، لتعزيز التباين. والمحتضنة لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، في حل تلوين ، ثم تغسل مع EtOH 95 ٪ ثم والتقط أكثر من مربع ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة # 11 : احرص على عدم مطاردة من المستعمرات لوحة الصخور ولكن ليس الحل تلطيخ ويغسل أكثر من لوحة وإزالة الحلول من الزوايا. - لتحليل النمط الظاهري من البلازميدات متحولة الفردية ، هو تطبيع المسافة النمو ضد الانحدار في مستوى تركيز على كل التدرج. ويمكن بعد هذه القيم النسبية يمكن مقارنتها عبر التدرجات.
ملاحظة # 12 : اعتمادا على طبيعة تأثير السامة للخلايا ، ويمكن ملاحظة حافة حادة أو حافة أكثر انتشارا (قارن مثلا لوحات A و B في الشكل 2). في حالة حواف منتشر ، فإنه من المستحسن لقياس س الحافةو النمو المستمر ، والمستعمرات الفردية تميل إلى إظهار التباين المتزايد. - لاختيار مكتبة ، يتم عزل المستعمرات الفردية التي تنمو عند تركيزات أعلى من النوع البري السيطرة الأبوية والتسلسل لتحديد الطفرات التي تسهم في زيادة الحماية.
III. ممثل النتائج :
الشكل 1. المقارنة المباشرة بين السائل والبروتوكولات الطفرات الطلاء ، والطلاء مباشرة الطفرات بروتوكول المقدمة هنا (أسفل) هو أسرع وأقل يتطلب خطوات من الأصلي لدينا بروتوكول الطفرات السائل (العلوي). عندما يتم استخدام GFP كمراسلة ، والاختلافات في مضان تدل على الحاضر التنوع الجيني في المكتبة. عادة دورة واحدة من النتائج الطفرات في مستعمرات 12-18 ٪ مع انخفاض ملحوظ في مستويات مضان.
الشكل 2. المقايسات التدرج المقاومة. لوحة مختارة لمقاومة متزايدة لMethanesulfonate ميثيل (MMS). تم اختيار المكتبات البلازميد من ABH2 demethylase الاكسدة الإنسان للمقاومة متزايدة لMMS. وتظهر هذه المكتبات يمثلون اثنين اثنين وأربعة من التكرارات بروتوكول الطفرات مقارنة اكتب البرية الوالدية (WT) ، وناقلات فارغة (Δ). الخط الأبيض يدل على عتبة أعلاه والتي تم عزل المستعمرات متحولة الفردية للتحليل المظهري أخرى. سيفوتاكسيم حماية الفريق باء ، مما يدل على النشاط β - اكتاماز الموسعة الطيف. R164H وE104K G267R R164H ، واثنين من المسوخ اكتاماز بيتا التي سبق تحديدها بعد LF - وترد لي بول الطفرات جانب لاختيار aztreonam 4 ، على 0.4μg/mL والتدرج سيفوتاكسيم 4μg/mL. علما بأن من النوع البري β - اكتاماز الانزيم لا يمنح الحماية النسبية للخلايا إبداء ناقلات فارغة ، Δ. ولذلك ، فإن هذه المسوخ تمثل تطور نشاط البيوكيميائية الجديدة 8،9.
الشكل 3. تردد طفرة كدالة للمسافة واحدة من أوري (د) ، وأظهرت وتيرة الطفرة بعد دورة واحدة من الطفرات الطلاء المباشر لمدة 100 سنة مضت فترات نسبة إلى تبديل RNA / DNA من أصل ColE1 من تكرارها. لا تمثل المنطقة الواقعة بين 1600 و 2400 بسبب β - اكتاماز لا يمثل هدفا محايدة. النقاط خارج اكتاماز β - 200 تمثل فترات الغليان نظرا لانخفاض وتيرة العام طفرة في هذا المجال. وقد ظهر هذا الاتجاه (المعادلة ذات الحدين ، مع 0.41 = R 2) كخط.
الشكل 1 التكميلية. I - LF بول بول تحتوي على البلازميد أنا. تسلسل (FastA الشكل). تسلسل المعلومات لتحديد انزيم التقييد الصحيح (ق) لاستخدامه عند linearizing للبول أنا البلازميد إما للتكرار (جيل الطفرة مكتبة خطوة عشوائية 4) أو قراءات (الخطوة 5). باء ملامح الخريطة العامة وتقييد البلازميد ، و وتعرض الموقع للأصل pSC101 من النسخ المتماثل ، علامة مقاومة الكلورامفينيكول (CAT) ، وجين بول LF - I. يشار إلى موقع من المواقع قيد واحد كذلك.
| مكتبة | المباشرة التصفيحات | سائل (1 اليوم) | سائل (3 أيام) | |
| الطفرات (#) | 95 | 40 | 142 | |
| استنساخ متسلسلة | 288 | 96 | 190 | |
| إجمالي التغطية (BP) | 182000 | 102000 | 213000 | |
| التكرار الطفرة (X10 3 BP) | 0.52 | 0.39 | 0.67 | |
| التكرار د <1000 (X10 3 BP) | 0.92 | 0.41 | 0.70 |
الجدول 1. ترددات الموجات الطفرة (كما أعرب عدد الطفرات / BP) ل<أي د ، 1000 في غليان 1000 المتاخمة للتبديل RNA / DNA ، لبروتوكولات الطفرات ثلاثة : الطلاء المباشر ، وتشبع السائل (1) ، وhypersaturation السائل ( 3 أيام).
| المباشرة التصفيحات | سائل | ||
| الطفرات (#) | 95 | 182 | |
| الطيف (٪) | |||
| ألف إلى زاي | ألف إلى زاي | 6.3 | 19.2 |
| T إلى C | 4.2 | 3.8 | |
| C لT | G لA | 27.4 | 13.7 |
| C لT | 35.8 | 35.2 | |
| ألف إلى T | ألف إلى T | 5.3 | 8.2 |
| تي إلى A | 5.3 | 7.1 | |
| T لG | T لG | 1.1 | 1.1 |
| ألف إلى جيم | 0.0 | 2.2 | |
| G لT | G لT | 1.1 | 2.7 |
| C إلى A | 2.1 | 2.7 | |
| C لG | C لG | 2.1 | 1.1 |
| G لC | 5.3 | 2.7 | |
| Indels | انس | 3.2 | 0.0 |
| ديل | 1.1 | 0.0 | |
| A إلى N | 11.6 | 29.7 | |
| G لN | 33.7 | 19.2 | |
| T لN | 10.5 | 12.1 | |
| C لN | 40.0 | 39.0 | |
| TS | 73.7 | 72.0 | |
| تلفزيون | 22.1 | 28.0 | |
| Indels | 4.2 | 0 |
الجدول 2. قياسات طفرة في الطلاء مباشرة والطفرات السائل. الجدول ويعرض عدد من الطفرات لاحظ (في العدد) وطيف الطفرة (في المائة) بعد دورة واحدة من الطفرات. يتم تقسيم الطيف بنسبة أزواج مكملة ، من خلال التغييرات النوكليوتيدات ، ونوع من الطفرات.
Discussion
هذا المقال يقدم بروتوكول الطفرات التي تسمح للجيل من المكتبات الكبيرة متحولة عشوائي دون الحاجة لاستنساخ أو PCR. ويستند هذا الأسلوب على تكرار الخطأ ، المعرضة للترميز البلازميد سلسلة من الفائدة. أنتجت حجم زعيم حبلا وسيطة من الناحية النظرية ، ينبغي أن الطفرات تقتصر إلى حد كبير إلى غليان 100-300 يقع المصب على الفور من الحمض النووي الريبي التبديل / الحمض النووي ، التي أنا بول 2،10. وجدنا أن وفقا للشروط الواردة في هذا البروتوكول ، وأنا بول الطفرات تحدث في جميع أنحاء البلازميد ، على الرغم من تراجع في وتيرة والمسافة من الزيادات أوري البلازميد (الشكل 3). هذه النتيجة تعني أن الانتقال أو "تبديل" من أنا لبول بول الثالث خلال تكرار ColE1 البلازميد هو أكثر بكثير مما ذكر سابقا تدريجيا ، على الأقل في ظل ظروفنا التجريبية 2 ، وتتفق مع دراسات سابقة يشير الى التكرار الوظيفي بين بول وبول لي ثالثا 11.
وصف بروتوكول لدينا الأصلي الطفرات في الثقافات السائل (4). هذا البروتوكول غلة 0.41 الطفرات / كيلو ل<أي د ، 1000 في غليان 1000 المتاخمة للRNA / DNA التبديل (الجدول 1). Hypersaturation من خلال ترك السائل في الثقافة شاكر لمدة 3 أيام دون إضافة أية وسيلة إعلامية جديدة ترفع من وتيرة التحول إلى 0.70 الطفرات / كيلوبايت ولكن النتائج في الغلة البلازميد الفقيرة جدا (أقل من 1 ٪ مقارنة مع اليوم 1 ، والبيانات لا تظهر) ( الجدول 1). هنا نقدم مبسطة مبنية على بروتوكول الطلاء مباشرة على التحول من هدف البلازميد على أجار الصلبة في 37 درجة مئوية (الشكل 1). هذا الإجراء ينتج أكبر تردد وجود طفرة / دورة من الطفرات (0.92 الطفرات / كيلو لد <1000) ، ويسهل كثيرا التكرار. الظروف المتغيرة للثقافة وسائل الاعلام الصلبة يؤثر أيضا على الطيف الطفرة (الجدول 2). الطفرات الطلاء مباشرة يقلل من التباين بين ملحوظ التكميلية استبدال قاعدة الزوج ينظر في الثقافة السائل (قارن C → T → G مقابل ألف وألف → → T G مقابل C). من ناحية أخرى ، أنتجت أكثر من الطلاء مباشرة indels (من 0.5 ٪ إلى أقل من 4 ٪) وانخفض عدد والطفرات التي → G - 3 أضعاف ، مما أدى إلى زيادة تمثيل G / C الطفرات (74 ٪). عموما ، فإننا نعتقد أن أكبر البساطة وزيادة الكفاءة للبروتوكول الطلاء مباشرة المعروضة هنا تفوق الفوائد من الطيف تحور قليلا أكثر توازنا التي تنتجها الطفرات السائل.
ضمن هدف البلازميد ، لا تقتصر على الطفرات الناتجة عن اسلوبنا في تسلسل الهدف المنشود. ومع ذلك ، ينبغي أن تطور الأنشطة البيوكيميائية الرواية تعتمد على الطفرات في الجينات المستهدفة ، لأنها تمثل النوعية بدلا من مجرد تغيير كمي. وهكذا ، والجمع بين الطفرات دينا البلازميد مع الفرز من المسوخ على لوحات التدرج تستفيد من نقاط القوة في نظامنا (مكتبات كبيرة وتوافر الاختيار) للتطور الخصائص الكيميائية الحيوية الجديدة. تطبيقات أخرى من الطفرات العشوائية مثل تحسين الأنشطة القائمة أو الأنزيمية العشوائي مجالات محددة من الجينات لا تتطلب الاستنساخ التالية الطفرات العشوائية. في هذه الحالة ، بعد أن المكتبة في البلازميد في مقابل منتج PCR التضخيم يحسن كفاءة الاستنساخ عن طريق تسهيل التضخيم والتقييد.
باختصار ، علينا أن نظهر بروتوكول بسيطة لإنشاء مكتبة عشوائية متحولة عن الجينات المستهدفة نظرا إلى أن تبرز لبساطتها والتنوع من مكتبات تم إنشاؤها. نظهر كيف يمكن أن يقترن هذا الأسلوب مع التحديدات الفنية لتطوير كفاءة الأنشطة البيوكيميائية جديدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لدينا في الجسم الحي ولدت المكتبات تكون مستنسخة بسهولة ، مما يتيح للموقع المحدد الطفرات أو التحسين من الأنشطة القائمة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل الجائزة CA116429 K08 - 04 لمولودية ومنحة من قهر السرطان الآن (قلق) الأساس # 8501
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| carbenicillin | Cellgro | 46100R6 | 0.1mg/ml final |
| tetracycline | Fisher Scientific | BP7640 | 0.05mg/ml final |
| chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final |
| LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB Broth Miller | Difco Laboratories | 244620 | |
| Soft Agar | Difco Laboratories | 214580 | Made in house |
| Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A38401-1 | |
| Antifoam B emulsion | Sigma-Aldrich | A5757 | |
| Glycerol | Acros Organics | 332030025 | |
| 100x100x15mm sq dish | Fisher Scientific | 0875711A | |
| 100mm rnd dish | Fisher Scientific | 0875712A | |
| Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2mm gap tubes | Molecular BioProducts | 5520 | |
| Zippy mini prep kit | Zymo Research Corp. | D4020 |
References
- Camps, M. Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression. Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).
- Itoh, T., Tomizawa, J. Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).
- Polisky, B. ColE1 replication control circuitry: sense from antisense. Cell. 55, 929-932 (1988).
- Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).
- Shinkai, A., Loeb, L. A. In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection. J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).
- Uyemura, D., Lehman, I. R. Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation. J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).
- Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases. Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).
- Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S.
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).
- Itoh, T., Tomizawa, J. FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).
- Bryan, S. K., Moses, R. E. Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees. C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).
