Summary
Eine Beschreibung eines Verfahrens zur Profilierung die Funktion der Mitochondrien in den Zellen ist. Die Mitochondrien-Profil generiert bietet vier Parameter der mitochondrialen Funktion, die in einem Experiment gemessen werden kann: basale Atemfrequenz, ATP-linked Atmung, Proton auslaufen und Reservekapazität.
Abstract
Die Fähigkeit, den Zellstoffwechsel zu messen und zu verstehen, mitochondriale Dysfunktion, hat Wissenschaftler aus aller Welt ihre Forschungsergebnisse zum Verständnis der Rolle der mitochondrialen Funktion in Fettleibigkeit, Diabetes, Alterung, Krebs, Herz-Kreislauf-Funktion und Sicherheit Toxizität vorab aktiviert.
Der Zellstoffwechsel wird der Prozess der Substrat-Aufnahme, wie Sauerstoff, Glukose, Fettsäuren und Glutamin, und der anschließenden energetischen Umwandlung durch eine Reihe von enzymatisch gesteuerten Oxidations-und Reduktions-Reaktionen. Diese intrazellulären biochemischen Reaktionen führen in der Produktion von ATP, der Freisetzung von Wärme und chemische Nebenprodukte, wie Laktat und CO 2 in die extrazelluläre Umgebung.
Der Sauerstoffverbrauch Rate - - oder OCR wertvolle Einblicke in den physiologischen Zustand der Zellen und die Veränderung des Status dieser Zellen kann durch Messung der Geschwindigkeit der Sauerstoff durch die Zellen, ein Indikator für die mitochondriale Atmung verbraucht gewonnen werden. Cells auch erzeugen ATP durch Glykolyse, dh: die Umwandlung von Glukose zu Laktat, unabhängig von Sauerstoff. In kultivierten Brunnen, wird Laktat die primäre Quelle von Protonen. Die Messung der Milchsäure indirekt über Protonen in den extrazellulären die Zellen umgebende Medium freigesetzt, die Ansäuerung des Mediums bietet die Extra-Cellular Ansäuerungsrate Ursachen hervorgerufen - oder ECAR.
In diesem Experiment werden C2C12 Myoblasten Zellen bei einer gegebenen Dichte in Seahorse Zellkulturplatten ausgesät. Die basale Sauerstoffverbrauch (OCR) und extrazelluläre Ansäuerung (ECAR) Preise sind gemessen zu den Ausgangswerten Preise zu etablieren. Die Zellen werden dann metabolisch gestört durch drei Zugänge verschiedener Verbindungen (in Folge), dass die bioenergetische Profil der Zelle zu verschieben.
Dieser Assay ist von einem klassischen Experiment, um zu beurteilen Mitochondrien abgeleitet und dient als Rahmen, mit denen komplexere Experimente an Verständnis sowohl physiologische und pathophysiologische Funktion der Mitochondrien Ziel zu bauen und auf die Fähigkeit von Zellen, um Stress und / oder Beleidigungen reagieren vorherzusagen.
Protocol
In diesem Experiment werden C2C12 Myoblasten Zellen bei einer gegebenen Dichte in Seahorse Zellkulturplatten ausgesät. Die basale Sauerstoffverbrauch (OCR) und extrazelluläre Ansäuerung (ECAR) Preise sind gemessen zu den Ausgangswerten Preise zu etablieren.
1. Cells Injection
Die Zellen sind metabolisch gestört durch drei Zugänge verschiedener Verbindungen (in Folge), dass die bioenergetische Profil der Zelle zu verschieben. Eine Gruppe wird als Kontrollgruppe dienen, mit fließendem Medien als Kontrolle "Verbindungen" aufgenommen.
- Die erste Injektion ist Oligomycin. Oligomycin hemmt die ATP-Synthese durch die Blockierung der Protonen-Kanal der F o Teil ATP-Synthase (Komplex V). In mitochondrialen Forschung ist es zum Zustand 3 (Phosphorylierung) Atmung verhindern. Mit Zellen, kann es verwendet werden, um den Prozentsatz der O2-Verbrauch gewidmet ATP-Synthese und der Prozentsatz der O2-Verbrauch benötigt, um die natürlichen Proton Leck in der inneren Mitochondrienmembran überwinden zu unterscheiden.
- Die zweite Injektion ist FCCP. FCCP (Carbonyl Cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) ist ein Ionophor, dass eine mobile Ionen-Träger ist. Es ist eine Entkopplung Agenten, weil es die ATP-Synthese gestört durch den Transport von Wasserstoff-Ionen über die Membran der Mitochondrien statt des Protons Kanal der ATP-Synthase (Komplex V). Dieser Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials führt zu einem schnellen Verbrauch von Energie und Sauerstoff ohne die Erzeugung von ATP. In diesem Fall wird sowohl OCR und ECAR erhöhen, OCR durch Entkopplung und ECAR wie die Zellen auf ihre Energiebilanz durch Glykolyse zu ATP zu erzeugen halten versuchen.
FCCP Behandlung kann verwendet werden, um den "Ersatz" respiratory Kapazität von Zellen, die als die quantitative Unterschied zwischen maximaler unkontrollierte OCR und der anfänglichen basalen OCR definiert ist zu berechnen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Aufrechterhaltung der einige freie Atemwege Kapazität auch unter den Bedingungen der maximalen physiologischen oder pathophysiologischen Stimulus ein wichtiger Faktor der Definition der Vitalität und / oder das Überleben der Zellen ist. Die Fähigkeit von Zellen auf Stress unter den Bedingungen der erhöhten Energiebedarf reagieren, ist in einem großen Teil von der bioenergetischen Kapazität der Mitochondrien beeinflusst. Diese bioenergetischen Kapazität wird durch verschiedene Faktoren, einschließlich der Fähigkeit der Zelle an das Substrat zu Mitochondrien und die Funktionsfähigkeit der Enzyme in Elektronentransport beteiligt liefern-vermint abschrecken - In der dritten Injektion wird Rotenon, ein Komplex I-Inhibitor, zu den Zellen gegeben. Dies wird heruntergefahren mitochondriale Atmung und ermöglichen sowohl die mitochondriale und nicht-mitochondriale Fraktionen beitragen, um die Atmung zu berechnen. Man wird beobachten, eine Abnahme der OCR Folge gestörter Funktion der Mitochondrien, mit einem gleichzeitigen Anstieg der ECAR wie die Zelle verlagert, um eine glykolytischen Staat, um ihre Energiebilanz zu erhalten
Rotenon ist ein mitochondrialen Inhibitor, der die Übertragung von Elektronen von der Fe-S-Zentrum in Komplex I zu Ubichinon (Coenzym Q) verhindert. Diese Hemmung der Komplex I verhindert, dass die potentielle Energie in NADH davon entfernt, in nutzbare Energie in Form von ATP umgewandelt.
2. Reagenzien und Materialien
- Oligomycin, FCCP und Rotenon Solutions (Seahorse Mito Stress Test Kit)
- DMEM Laufen Media (Seahorse # 100965-000)
- DMSO (Sigma D8418)
- Destilliertes Wasser (Gibco 15230-170)
- Calibration-Puffer (Seahorse Bioscience)
3. Wachstumsmedium
- 500 ml DMEM (Gibco 11965-092)
- 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
- 5 mL Penn / Strep (Gibco 15140-122)
- 5 ml Natriumpyruvat (Sigma S8636)
- 5 mL Glutamax (Gibco 35050-061)
4. Seeding-Protokoll
- Die Zellen werden in XF96 Zellkulturen Platten mit 10.000 Zellen / well in 100 ul Wachstumsmedium ausgesät und in 37 ° C-Inkubator mit 10% CO 2.
- Cells wird den XF96 Zellkulturplatte innerhalb von 1 Stunde zu halten.
- Assay-Zellen in XF96 24 Stunden nach der Aussaat.
5. Vorbereitung der Assay-Vorlage
- Mit dem Assay-Assistenten (Anhang I), erzeugen eine Vorlage mit der folgenden Gruppe Layout:
Abbildung 1. Nun Grid-Layout zu identifizieren Spalte und Gruppenzugehörigkeiten
6. Compound Vorbereitung
- Bereiten Sie die folgenden Verbindungen in XF DMEM Assay Medien wie folgt:
10 uM Oligomycin, 30,0 uM FCCP, 20,0 uM Rotenon,
Diese Konzentrationen stellen die 10X Verdünnung vorgenommen, wenn die Verbindungen in den Brunnen eingespritzt wird. Die Arbeitsgruppe Konzentrationen sind:
1 uM Oligomycin, 3,0 uM FCCP, 2,0 uM Rotenone
7. Medien ändern und Cell Preparation
8. Loading Sensor Cartridge
- Warm-Verbindungen auf 37 ° C vor dem Laden Fühlerpatrone und laden Sie die Verbindungen in den Injektor-Ports wie folgt:
- Spalten 1-4: Laden 16, 18, und 20 ul des XF Assay Medien (DMEM) in den Anschlüssen A, B und C sind.
- Spalten 5-12:
Lade 16 ul der Oligomycin in Häfen A
Last 18 ul der FCCP in Häfen B
Legen Sie 20 uL Rotenon in Häfen C
9. Protokoll-Befehle
| Befehl | Zeit (min) | Port |
| Kalibrieren | ||
| Äquilibrieren | ||
| Loop Start | 3X | |
| Mischung | 3 | |
| Warten Sie | 2 | |
| Messen | 3 | |
| Loop End | ||
| Injizieren | A | |
| Loop Start | 2X | |
| Mischung | 3 | |
| Warten Sie | 2 | |
| Messen | 3 | |
| Injizieren | B | |
| Loop Start | 2X | |
| Mischung | 3 | |
| Warten Sie | 2 | |
| Messen | 3 | |
| Injizieren | C | |
| Loop Start | 2X | |
| Mischung | 3 | |
| Warten Sie | 2 | |
| Messen | 3 | |
| Ende |
Tabelle 1. Protocol-Befehle
Discussion
Dieser Assay ist von der klassischen Experiment, um die Funktion der Mitochondrien-Sonde abgeleitet und dient als Rahmen, mit denen bis zu komplexeren Experimenten an Verständnis verschiedene Veränderungen im Zellstoffwechsel, die Funktion der Mitochondrien, und die allgemeine Bioenergetik Ziel zu bauen.
Alle Verbindungen in diesem Experiment verwendet werden, sollten für die Konzentration, die maximale Wirkung stellt optimiert werden. Das heißt, man muss getrennte Titration Experimente durchführen, um diese Werte zu ermitteln. Dies ist besonders wichtig mit FCCP, wie die Titrationskurve neigt dazu, ziemlich scharf, und zu viel FCCP kann tatsächlich abnehmen Reaktionen in OCR. Typische Bereiche (Endkonzentrationen) zu testen wäre:
- 0,1 bis 1,0 ug / ml Oligomycin
- 0,1 bis 5,0 uM FCCP
- 0,1 bis 1,0 uM Rotenone
Beachten Sie, dass die Antworten auf jede Verbindung über (vor allem FCCP) von der Assay-Media-Komposition (Basistyp, [Glukose], [Pyruvat], Anwesenheit / Abwesenheit von BSA, usw.) beeinflusst wird. Ferner, wenn die XF-Assay Medien Zusammensetzung geändert wird, wird die Optimierung müssen neu durchgeführt werden. Das Vorhandensein und die Konzentration von Pyruvat ist besonders wichtig bei der Erlangung der maximalen Lungenkapazität durch FCCP. Seahorse Bioscience hat in einer Reihe von Zelllinien beobachtet, dass Unterlassung von Pyruvat die Fähigkeit der Zellen auf maximal reagieren (über dem Ausgangswert) auf FCCP hebt. In der Regel sollte die Konzentration von 1-10 mM Pyruvat getestet, um die optimale Konzentration von Pyruvat zu verstehen, um eine maximale Atmung zu erhalten. Beachten Sie, dass [Pyruvat] UND [Glukose] muss möglicherweise "cross-Titration", die optimal media Bedingungen für das Experiment zu erhalten.
Typische Ergebnisse dieses Experiments sind unten in ein Diagramm, das OCR-Zeit und eine andere Darstellung ECAR gegen die Zeit dargestellt:
Abbildung 2. OCR gegen die Zeit
Abbildung 3. ECAR gegen die Zeit
Hier beobachteten wir die erwarteten Antworten in OCR und ECAR wie die Zellen mit jeder Verbindung behandelt werden. Für Oligomycin, OCR als Folge der Blockierung der ATP-Synthese in Mitochondrien Complex V. Da die Zellen nicht in der Lage ATP über OXPHOS synthetisieren, sie Glykolyse zurückgreifen, um ihre Forderung nach ATP erfüllen abnimmt, so beobachten wir eine Zunahme in ECAR. Wie zuvor gezeigt, wirkt FCCP als Entkopplung Agenten. Da die Zellen nun überwunden werden muss das Proton Leck über die innere Membran der Mitochondrien erhöht OCR signifikant mehr O2 verbraucht wird, um die überschüssige Protonen wieder Pumpe über den mitochondrialen Membran. Schließlich hemmt Rotenon mitochondrialen Komplex I und Komplex III verbunden, die bewirkt, dass der Fluss der Elektronen in der Elektronen-Transportkette einzustellen und damit den Verbrauch von O2 wird drastisch reduziert.
Abbildung 4. Respiration Parameter
Über die zu erwartenden Veränderungen in Atmung und ECAR, kann eine Reihe von respiratorischen Parameter aus diesen Daten gewonnen werden. Dies ist in der obigen Abbildung zusammengefasst:
Hier sehen wir, dass wir Informationen über die basale Atmung der Zellen, der prozentuale Anteil der O2-Verbrauch gewidmet ATP-Produktion sowie die Höhe gewidmet Aufrechterhaltung des Protonengradienten (durch H + Leck) zu erhalten. Ferner können wir die maximale Atemfrequenz unter den Bedingungen der entkoppelten Atmung (manchmal auch als Ersatz Atemkapazität genannt) zu erhalten und schließlich können wir die Menge der O2-Verbrauch nicht durch mitochondriale Prozesse zu bestimmen.
Eine rasch wachsende Zahl von Studien beschäftigen diese mitochondriale Profil zellulären Bioenergetik bewerten, mitochondriale Dysfunktion und die Fähigkeit von Zellen, um Stress und / oder Beleidigungen reagieren vorherzusagen. Für weitere Informationen und Details zu diesem experimentellen Methode und die Idee der freien Atemkapazität finden Sie beziehen sich auf die folgenden Veröffentlichungen 1-8.
Disclosures
Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers und David A. Ferrick sind Mitarbeiter von Seahorse Bioscience, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel vorgestellten produziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
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