Summary
फेफड़े के उपकला कोशिकाओं को चूहों के श्वसन पथ से अलग किया जा सकता है और विभेदित श्वसन उपकला के एक मॉडल के रूप में हवा तरल इंटरफेस पर सभ्य है. संवर्धन, अलग और मुख्यधारा सिगरेट के धुएं के इन कोशिकाओं को उजागर करने के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है, क्रम में इस पर्यावरण विष आणविक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन.
Abstract
फेफड़े के उपकला कोशिकाओं को चूहों के श्वसन पथ और विभेदित श्वसन उपकला के एक मॉडल के रूप में हवा तरल इंटरफेस (अली) में सभ्य से अलग किया जा सकता है. अलग और मुख्यधारा सिगरेट का धुआँ (सीएस) के लिए इन कोशिकाओं को उजागर करने के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है, क्रम में सीएस जोखिम को उपकला कोशिका प्रतिक्रियाओं का अध्ययन. माउस ट्रेकिआ, हवा तरल इंटरफ़ेस (अली) के रूप में पूरी तरह विभेदित उपकला कोशिकाओं पर इन कोशिकाओं के संवर्धन, और कैलिब्रेटेड मुख्यधारा सीएस की संस्कृति में इन कोशिकाओं को प्रसव से airway उपकला कोशिकाओं के अलगाव: प्रोटोकॉल तीन भागों से होते हैं. अली संस्कृति प्रणाली है कि और अधिक बारीकी से उनके साधारण तरल संस्कृति प्रणालियों की तुलना में शारीरिक सेटिंग समान शर्तों के तहत सांस epithelia की संस्कृति की अनुमति देता है. आणविक और फेफड़ों सीएस जोखिम के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन मानव स्वास्थ्य पर पर्यावरण वायु प्रदूषण के प्रभाव को समझने का एक महत्वपूर्ण घटक है. इस क्षेत्र में अनुसंधान के निष्कर्षों को अंततः क्रोनिक प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी), और अन्य तम्बाकू से संबंधित रोग है, जो प्रमुख वैश्विक स्वास्थ्य समस्याओं का प्रतिनिधित्व करते हैं के एटियलजि समझ की दिशा में योगदान कर सकते हैं.
Protocol
समग्र प्रोटोकॉल जानवर ऊतक, सेल प्रसार के लिए 5-10 दिनों, और हवा तरल इंटरफेस में सेल भेदभाव के लिए एक अतिरिक्त 10-14 दिनों से सेल isolations के लिए 2 दिन की आवश्यकता है. एक अतिरिक्त दिन सेल जोखिम और नमूने की कटाई के लिए आवश्यक है.
1. माउस Tracheobronchial उपकला कोशिकाओं (MTEC) के अलगाव.
नोट: नीचे वर्णित प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और संस्थागत पशु देखभाल और ब्रिघम और महिला अस्पताल / हार्वर्ड मेडिकल स्कूल के क्षेत्र में प्रयोग करें समिति ने मंजूरी दे दी.
शुरू हो रही से पहले:
- है हाम F12 एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया तैयार करें. करने के लिए 250 एमएल हाम F12 बेसल मीडिया (Cellgro) एक 100 एक्स पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (2 10 2 U/mL-10 मिलीग्राम / एमएल) समाधान और एक 1000 एक्स Fungizone समाधान के 250 μL 2.50 एमएल जोड़ने. 4 ° C से कम 4 हफ्तों के लिए स्टोर.
- Pronase 0.15% की एक समाधान तैयार है. है हाम F12 एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया के 10 एमएल 15 मिलीग्राम Pronase जोड़ें. ताजा करें और उपयोग करें जब तक बर्फ पर रहते हैं.
- एक स्वच्छ काम की सतह और बाँझ सर्जिकल उपकरणों छोटे पशु शल्य चिकित्सा के लिए उपयुक्त है, और सेल isolations के लिए एक lamellar ऊतक संस्कृति हुड तैयार. पशु सेल संस्कृति के लिए humidified सीओ 2 इन्क्यूबेटरों, ठंडे कमरे, tabletop सेल centrifuges, उलटा माइक्रोस्कोप, और डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक और संस्कृति के बर्तन सहित अन्य सभी उपकरण मानक माना जाता है .
- कोलेजन तैयार समाधान (50 .02 एन एसिटिक एसिड में μg / एमएल). पिपेट एक 12 अच्छी तरह से transwell प्लेट (Corning) में से प्रत्येक के कुएँ में 1.0 एमएल कोलेजन समाधान. Parafilm में लपेटें और दो कमरे के तापमान पर एक सपाट सतह पर रातोंरात खड़े.
- एक माउस वाणिज्यिक उपलब्ध तनाव (यानी, C57BL 6 / पुरुष 6-8 सप्ताह पुराना) का उपयोग करना, सह के रूप में 2 प्रेरित narcosis इच्छामृत्यु की एक विधि को मंजूरी दी का उपयोग चूहों euthanize. आमतौर पर 6 चूहों पर्याप्त कोशिकाओं (1.5-2.0 x 10 5 कोशिकाओं / माउस) एक 12 अच्छी तरह transwell थाली बीज उपज जाएगा.
- 70% EtOH क्षेत्र बाँझ समाधान के साथ पशुओं के शवों स्प्रे.
- साफ शल्य कैंची और स्केलपेल के साथ, tracheal क्षेत्र के आसपास त्वचा को हटा दें, और ट्रेकिआ बेनकाब. पेट खुला, उरोस्थि के साथ, कट और रिब पिंजरे हटायें. ऊतक निकालें ट्रेकिआ के अंत तक अवगत कराया है.
- 50 एमएल शंक्वाकार 30 एमएल है हाम F12 एंटीबायोटिक दवाओं बर्फ पर, जिसमें मीडिया से युक्त ट्यूब में प्लेस tracheas.
- एक बाँझ lamellar प्रवाह हुड में, एक बाँझ 100 मिमी 10 एमएल हाम F12 एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया युक्त पेट्री डिश tracheal ऊतक हस्तांतरण.
- धीरे बाँझ संदंश और शल्य कैंची के साथ संयोजी ऊतक टुकड़े करना.
- एक नया 100 मिमी पेट्री 10 एमएल है हाम F12 कुल्ला एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त मीडिया वाले पकवान tracheal ऊतक स्थानांतरण. लुमेन बेनकाब करने के लिए ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ tracheas कट.
- एक 50 एमएल 10 एमएल 0.15% Pronase समाधान युक्त ट्यूब tracheas स्थानांतरण और 4 में रात सेते डिग्री सेल्सियस
- दूसरे दिन, तैयार है:
- DNase मैं समाधान तैयार है. हाम F12 युक्त एंटीबायोटिक दवाओं के 10 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (BSA) स्टॉक समाधान की 2 एमएल, और कच्चे अग्नाशय DNase मैं के 10 मिलीग्राम जोड़ने के 1 एमएल -20 और aliquots दुकान मीडिया ° सी के 18 एमएल (पर thawed उपयोग करने से पहले बर्फ).
- हाम F12 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया तैयार करें. करने के लिए 200 एमएल हाम F12 बेसल मीडिया (Invitrogen) 50 एमएल गर्मी निष्क्रिय FBS, एक 100 एक्स पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (2 10 2 U/mL-10 मिलीग्राम / एमएल) समाधान है, और एक 1000 एक्स Fungizone समाधान के 250 μL 2.5 एमएल जोड़ने .
- MTEC मूल एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मध्यम तैयार. 475.5 एमएल DMEM/F12 बुनियादी मीडिया (Cellgro) 7.5 एमएल 1 एम HEPES समाधान, 200 मिमी glutamine समाधान, एक 7.5% NaHCO 3 समाधान, एक 100 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 5 एमएल 2 एमएल के 10 एमएल, 500 μL जोड़ने एक 1000 एक्स Fungizone समाधान
- तैयार MTEC medium/10% FBS. MTEC बुनियादी एंटीबायोटिक दवाओं युक्त माध्यम के 45 एमएल, 5 एमएल गर्मी निष्क्रिय FBS जोड़ने.
- धीरे ट्यूब (1.8 चरण) 10-12 बार, रॉक और तब यह 4 पर 30-60 मिनट के लिए खड़े दो डिग्री सेल्सियस
- 10 एमएल है हाम F12 ट्यूब और 12 बार रॉक के लिए 20% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया जोड़ें.
- 3 15 एमएल शंक्वाकार 10 एमएल है हाम F12 20% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया युक्त ट्यूबों तैयार.
- Pronase समाधान से tracheas निकालें, एक तरफ बर्फ पर इस समाधान की स्थापना. पहली शंक्वाकार हाम F12 युक्त ट्यूब tracheas स्थानांतरण और ट्यूब 12 बार पलटना. इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएँ.
- 1.13 कदम से एक 50 एमएल ट्यूब में तीन supernatants के साथ Pronase समाधान का मिश्रण. शेष ऊतक त्यागें.
- 4 में 10 मिनट ° सी, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए, 1400rpm पर अपकेंद्रित्र (Eppendorf 5810R एक A-4-62 रोटर के साथ सुसज्जित अपकेंद्रित्र 390 XG).
- धीरे 1 एमएल DNase समाधान में गोली (100-200 μL / ट्रेकिआ) resuspendऔर बर्फ पर 5 मिनट सेते हैं.
- 1400rpm (390 XG) पर 5 मिनट 4 बजे ° सी, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए अपकेंद्रित्र.
- 8 एमएल MTEC 10% FBS युक्त मध्यम में सेल गोली Resuspend
- प्लेट Primaria प्लेट्स पर सेल निलंबन (फाल्कन). 37 में सेते ° C 95% हवा के माहौल में, 5 बजे (नोट: इस fibroblasts के लिए एक नकारात्मक चयन कदम है) के लिए 5% सीओ 2.
- प्लेटों से सेल निलंबन लीजिए और प्लेटें 4 एमएल MTEC 10% FBS युक्त के साथ दो बार कुल्ला. पूल सेल निलंबन और एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक साथ washes.
- Cytospin और सेल गिनती के लिए 1 एमएल संरक्षण. +५००० Rpm (5415D Eppendorf) में 5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में स्पिन. शेष सतह पर तैरनेवाला में 500 μL और resuspend गोली निकालें. सेल Trypan ब्लू महत्वपूर्ण धुंधला विधि का उपयोग कर की गणना के लिए 100 μL का प्रयोग करें. 100 μL के cytospin विश्लेषण के लिए 4 aliquots संरक्षण
- शेष 15 एमएल सेल निलंबन स्पिन 1400rpm (390 XG), 4 बजे ° C 10 मिनट के लिए.
2. प्रचार और एयर तरल इंटरफेस MTEC के भेदभाव
Retinoic एसिड शेयर समाधान तैयार. स्टॉक समाधान: अंधेरे में retinoic एसिड (श्री 300.44 छ / mol) वजन 95% EtOH में 5 मिमी शेयर समाधान बनाने के लिए. एक पन्नी में लिपटे ट्यूब -80 पर स्टोर ° सी. के रूप में की जरूरत है, 50 μL शेयर ए, 500 μL BSA (100 मिलीग्राम / एमएल) समाधान और 49.5 एमएल हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) जोड़कर स्टॉक समाधान बी (5 सुक्ष्ममापी) तैयार है. एक पन्नी में स्टोर -80 ° सी में 4 सप्ताह के लिए ट्यूब में लपेटा.
MTEC प्रसार retinoic एसिड युक्त मध्यम तैयार. 45.7 एमएल MTEC बेसल एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया के लिए, 2.5 एमएल गर्मी निष्क्रिय FBS, 1 एमएल retinoic एसिड स्टॉक बी, 250 μL इंसुलिन समाधान (2 मिलीग्राम / 4 मिमी एचसीएल में इंसुलिन एमएल), 250 μL Epidermal वृद्धि कारक (5 / μg समाधान जोड़ने 1 मिलीग्राम / एमएल BSA युक्त HBS में एमएल EGF), 200 μL गोजातीय पिट्यूटरी निकालने (15 मिग्रा / HBS से युक्त 1 मिलीग्राम / एमएल BSA में एमएल), 50 μL transferrin समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल HBS युक्त 1 मिलीग्राम / एमएल BSA में transferrin ), 50 μL हैजा विष समाधान (100 मिलीग्राम / HBS से युक्त 1 मिलीग्राम / एमएल BSA में एमएल). अंतिम मीडिया तैयारी बाँझ फ़िल्टर और तैयारी के 2 दिनों के भीतर उपयोग करें.
- Transwell प्लेटों से कोलेजन समाधान निकालें, हुड के अंतर्गत 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ, और पीबीएस दो बार से धो.
- निम्नलिखित centrifugation प्रसार मीडिया (500 μL) के एक उचित मात्रा में सेल गोली resuspend 7.5 x 10 अच्छी तरह से प्रति 4 -1.0 x10 5 कोशिकाओं के चढ़ाना की सुविधा . पिपेट transwell polycarbonate झिल्ली डालने के शिखर सतह पर 500 μL सेल निलंबन. Transwell के बेसल डिब्बे प्रसार मीडिया के 1.5 एमएल जोड़ें.
- 37 में जलमग्न MTEC संस्कृतियों सेते ° सी, एक humidified 95% हवा युक्त इनक्यूबेटर में 7-10 दिनों के लिए 5% सीओ 2 .
- मीडिया पहली बार बदलने से पहले तीन दिन रुको. मीडिया हर दूसरे दिन बदलें. दृश्य निरीक्षण और transepithelial सेल प्रतिरोध की माप एक इलेक्ट्रोड (EVOM Ohmvoltometer, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL) का उपयोग कर के द्वारा संस्कृतियों मॉनिटर.
- जब कोशिकाओं को मिला हुआ दिखाई देगा और उपकला प्रतिरोध Ω 1000 / 2 सेमी तक पहुँचता है, कोशिकाओं अली में अंतर के लिए तैयार हैं.
- MTEC बेसल 2% NuSerum युक्त मीडिया तैयार करें. 2% वी / वी. के अंतिम एकाग्रता MTEC बुनियादी मध्यम NuSerum जोड़ें 1 एक्स 10 -7 एम के अंतिम एकाग्रता के लिए उपयोग करने से पहले retinoic एसिड स्टॉक बी जोड़ें. ताजा तैयार है और 2 दिनों के भीतर उपयोग करें.
- सेल 10-14 दिनों के लिए अंतर करने के लिए शिखर मीडिया को हटाने और 750 μL MTEC बेसल 2% Nuserum और retinoic एसिड युक्त मीडिया के साथ बेसल मीडिया की जगह द्वारा, अनुमति दें. बेसल मीडिया बदलें और MTEC हर दूसरे दिन 2% NuSerum युक्त के साथ शिखर की ओर धोने.
3. सिगरेट के धुएं के संवर्धित उपकला कोशिकाओं के लिए आवेदन
- मुख्यधारा सिगरेट धूम्रपान करने के लिए सीएस सेल जोखिम प्रणाली (ईएमआई उपकरण, पिट्सबर्ग, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) का उपयोग transwell संस्कृतियों के शिखर की ओर बेनकाब. तंत्र की तस्वीर के लिए चित्रा 1 देखें. विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तकनीकी विशिष्टताओं के लिए तालिका देखें. संक्षेप में, उपकरण एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप है जो ~ 7-8 कश प्रत्येक सिगरेट फूँकती है कि एक दिए जोखिम कक्ष से जुड़ा है एक polypropylene लाइन में मुख्यधारा के धुएं में ड्राइंग के होते हैं. जोखिम कक्ष 37 में बनाए रखा है ° C पानी परिसंचारी द्वारा, और एक गैस लाइन पर 5% सीओ 2 का माहौल बनाए रखा . कोशिकाओं केंटकी 3R4F अनुसंधान संदर्भ फिल्टर सिगरेट (तम्बाकू अनुसंधान संस्थान, विश्वविद्यालय केंटकी, Lexington, KY) का उपयोग कर धूम्रपान करने के लिए संपर्क किया जा सकता है है. आमतौर पर कोशिकाओं को 1-2 सिगरेट से धूम्रपान करने के लिए उजागर कर रहे हैं, कुल बात कण (TPM) 100-200 मिलीग्राम / 3 मीटर उपज है. नियंत्रण संस्कृतियों एक बराबर जोखिम अवधि के लिए कमरे में हवा के लिए उजागर कर रहे हैं.
- TPM ते साथ निर्माता आपूर्ति प्रोटोकॉल के अनुसार मापा जाता है10c रहित मशीन (Teague उद्यम). संक्षेप में, एक फिल्टर (Pallflex) एक नमूना धूम्रपान कक्ष पर एक निरंतर प्रवाह पंप (नमूने इकाई) नमूने बंदरगाह से प्रमुख ट्यूब पर एक इनलाइन स्टेनलेस स्टील धारक में रखा है. एक बहिर्वाह ट्यूब एक गैस मीटर (ड्राई मीटर गैस, ONM61, 67, AEM) के लिए नमूने इकाई जोड़ता है. फिल्टर गैस नमूने के पहले और बाद तौला है. कुल सामग्री मिलीग्राम में फिल्टर पर जमा नमूना हवा की कुल मात्रा के लिए सामान्यीकृत है.
- कोशिकाओं तो किसी भी समय बिंदु (यानी, 0-24 बजे) मानक सेल विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के लिए पोस्ट जोखिम (यानी, पश्चिमी immunoblot विश्लेषण, mRNA विश्लेषण, आदि) या माइक्रोस्कोपी (यानी, confocal या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) पर काटा जा सकता है. संस्कृति मीडिया भी साइटोकिन्स या cytotoxicity assays के लिए LDH रिलीज के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
सफल उपकला अलगाव, प्रसार, अली और भेदभाव एक cobblestone आकारिकी के साथ एक अक्षुण्ण monolayer उपज चाहिए. स्वस्थ संस्कृतियों के Transepithelilal सेल प्रतिरोध 1000-2000 लगभग Ω / 2 सेमी होना चाहिए. चित्रा 2 माउस नियंत्रण की शर्तों के तहत और सिगरेट का धुआँ प्रदर्शन के बाद उपकला कोशिका और cilia मार्करों के लिए दाग श्वसन उपकला कोशिकाओं की एक monolayer दर्शाया गया है. चित्रा 3 स्वस्थ MTEC संस्कृतियों के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन micrographs से पता चलता है, cilia और आकारिकी ultrastructure चित्रण.
चित्रा 1 उपकला कोशिकाओं तीन चरणों, एक अलग कदम, प्रचार मंच, और हवा तरल इंटरफेस (योजना) में भेदभाव चरण के माध्यम से आय की तैयारी. उपकला कोशिकाओं माउस ट्रेकिआ, transwells जहां वे जलमग्न संस्कृति में पैदा पर वरीयता प्राप्त से अलग कर रहे हैं, और फिर हवा तरल अंतरफलक जहां वे पूरी तरह से अंतर में परिवर्तित. प्रयोगों आमतौर पर निरंतर संस्कृति के 24 वें दिन पर आयोजित की जाती हैं . चित्र मुख्यधारा सिगरेट के धुएं के संवर्धित कोशिकाओं के प्रदर्शन के लिए एक मॉडल प्रणाली दर्शाया गया है. एक transwell अली संस्कृति प्रणाली एक कस्टम मॉड्यूलर सिगरेट का धुआँ वितरण प्रणाली जो तापमान, नमी और सीओ 2 के लिए नियंत्रित किया जाता है के अंदर रखा गया है.
चित्रा 2 तय उपकला सेल संस्कृतियों और दाग नाभिक के लिए (33,258 Hoechst), एफ actin (हरा, Alexa Fluor 488 संयुग्मित Phalloidin) और cilia मार्कर acetylated α-ट्यूबिलिन (लाल, Cy3 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी). . कम पैनल 4 घंटे सिगरेट का धुआँ (2 सिगरेट, 150 मिलीग्राम / 3 मीटर) के लिए प्रदर्शन के बाद लिया उपकला कोशिकाओं के बराबर चित्र दिखाते हैं. (बी) लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिलीज (LDH) सिगरेट के धुएं के अलग खुराकों के रूप में इंगित करने के लिए प्रदर्शन के बाद 24 घंटे बेसल माध्यम से मापा गया था.
चित्रा 3. माउस tracheal उपकला से अलग उपकला कोशिकाओं के एयर तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों कई उपप्रकारों में अंतर है कि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के द्वारा रोमक, बेसल, और गैर रोमक 1 कोशिकाओं की विशेषताओं है. इन कोशिकाओं pseudostratified श्वसन उपकला में पाई जाती है. चित्रा लेबल के अनुरूप: bb: बेसल शरीर, एक axoneme, मीटर: mitochondria, n: नाभिक, एस: सब्सट्रेट (polycarbonate झिल्ली), mv: microvili
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Discussion
माउस tracheal उपकला कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन प्रोटोकॉल तुम एट अल के प्रोटोकॉल से अनुकूल है. 1, और दूसरों को 2-3 से संशोधनों के साथ. किसी भी प्रोटोकॉल का वर्णन सेल isolations के साथ के रूप में, सबसे महत्वपूर्ण पहलू सख्त सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर करके बैक्टीरियल या फंगल रोगज़नक़ों से संक्रमण से बचने है. एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम fibroblast संस्कृतियों के संदूषण, जो tracheas के सावधान विच्छेदन के द्वारा बचा जा सकता है है और नकारात्मक चयन के रूप में 1.19 चरण में वर्णित से बचने के है. बशर्ते कि संस्कृतियों निगरानी कर रहे हैं, धोए, और संस्कृति मीडिया प्रारंभिक 72 घंटे ऊष्मायन के बाद हर दूसरे दिन मंगाया, संस्कृतियों पूरी तरह से अली की दीक्षा से लगभग दो सप्ताह में अंतर होना चाहिए.
क्रोनिक प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी), जो मोटे तौर पर पुरानी सिगरेट का धुआँ जोखिम के कारण होता है के लिए एक प्रमुख वैश्विक स्वास्थ्य समस्या को 4-7 का प्रतिनिधित्व करने के लिए जारी है. सीओपीडी, प्रगतिशील airflow सीमा, विनाशकारी वायुकोशीय हानि वातस्फीति (), और सिगरेट 4-7 धूम्रपान करने के लिए फेफड़ों के अतिरंजित भड़काऊ प्रतिक्रियाओं द्वारा विशेषता है. अध्ययन की एक बड़ी संख्या वायुकोशीय, ब्रोन्कियल, और airway उपकला सेल प्रणाली का इस्तेमाल किया है मॉडल फेफड़ों सीएस सेल प्रतिक्रिया करने का प्रयास. इन अध्ययनों से कई उपकला कोशिका या बदल लाइनों (यानी, ब्यास-2b) में आयोजित किया गया है, उदाहरण के लिए 8-11 refs देखें. अली transwell संस्कृति प्रणाली फैशन है कि airway में जो पारंपरिक तरल (जलमग्न) संस्कृति 1-3 से प्रदान किया जा सकता है की तुलना में उनके शारीरिक उन्मुखीकरण के लिए करीब है में फेफड़े के उपकला कोशिकाओं की संस्कृति की अनुमति देता है. हालांकि विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल माउस tracheal प्राथमिक 1 संस्कृतियों के लिए इस प्रणाली के आवेदन का वर्णन है, सिद्धांत रूप में अन्य प्राथमिक उपकला कोशिकाओं (यानी माउस प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं, मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं, आदि) लागू किया जा सकता है. रहते मुख्यधारा सीएस के सेल संस्कृतियों के लिए आवेदन एक मॉडल है कि शायद और अधिक बारीकी से जलीय सिगरेट का धुआँ निकालने (सीएसई), जो आमतौर पर 12-15 जोखिम सीएस के सेलुलर अध्ययन में प्रयोग किया जाता है के आवेदन की तुलना में सीएस के लिए मानव जोखिम approximates का प्रतिनिधित्व करता है. सीएसई मुख्यधारा धूम्रपान कि पूरे धुएं के कई रासायनिक घटकों का अभाव के एक घुलनशील अंश का प्रतिनिधित्व करता है. जबकि दोनों सीएस जोखिम सिस्टम सीमाएं हैं, सीएसई अधिक आसानी से कैलिब्रेटेड किया जा रहा का लाभ है, के बाद से एक भी तैयारी के कई प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और dosing 15-16 मन्दन द्वारा हासिल की है. दूसरी ओर, हम यहाँ मुख्यधारा धूम्रपान TPM माप पर आधारित प्रसव बढ़ाता के लिए एक विधि शामिल हैं. विष जोखिम के लिए आणविक और सेलुलर प्रतिक्रियाओं की व्याख्या, विशेष रूप में सीएस के रूप में इस लेख में उदाहरण, फेफड़ों के पुराने रोगों के एटियलजि में विशेष रूप से मानव स्वास्थ्य पर वायु प्रदूषण के प्रभाव की समझ, आगे होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता और डॉ. शिवराज त्यागी के लिए बहुमूल्य विशेषज्ञता के लिए Emeka Ifedigbo धन्यवाद. हम भी माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए हार्वर्ड NeuroDiscovery केंद्र धन्यवाद. इस काम के हिस्से में एक अमेरिकन हार्ट हिलैरे, लाम, और NIH अनुदान, R01 HL60234, R01 HL55330, R01-HL079904 AMK चोई के लिए सम्मानित किया अनुदान 09PRE2250120 predoctoral एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine |
| Pen/strep | Lonza Inc. | 17-602E | |
| Pronase | Roche Group | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| Collagen I | BD Biosciences | 354236 | From rat tail |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | From Bovine Pancreas |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Without Ca++ or Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | Bovine Pancreas |
| Apo-transferrin (human) | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Vibrio Cholerae |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | Corning | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon BD | 353803 | |
| Pallflex membrane | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector. This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com). |
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References
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
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