Summary
폐 상피 세포는 생쥐의 호흡기로부터 격리하고 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스에서 교양 수 있습니다. 프로토콜이 환경 독소에 분자 반응을 연구하기 위해, culturing를 분리하고 주류 담배 연기 이러한 세포를 노출에 대해 설명합니다.
Abstract
폐 상피 세포는 호흡 생쥐의 넓이와 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)에서 양식에서 격리 수 있습니다. 프로토콜은 CS에 노출되는 상피 세포의 반응을 연구하기 위해 주류 담배 연기 (CS) 이러한 세포를 분리하고 노출에 대해 설명합니다. 마우스 기관, 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)로 완벽하게 차별화된 상피 세포에서 이러한 세포의 culturing, 문화에서 이러한 세포 보정 주류 CS의 배달에서기도 상피 세포의 분리 : 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다. 알리 문화 시스템은보다 밀접하게 일반 액체 문화 시스템보다 생리 설정을 닮은 그 조건 하에서 호흡기 상피 조직의 문화 수 있습니다. CS 노출하는 분자 및 폐 세포 반응의 연구는 인간의 건강에 대한 환경 대기 오염의 영향을 이해의 중요한 구성 요소입니다. 이 분야에서 연구 결과는 궁극적으로 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD), 주요 글로벌 건강 문제를 나타내는 다른 담배 관련 질병의 병인을 이해하는 방향으로 기여할 수 있습니다.
Protocol
전체 프로토콜은 동물의 조직, 세포 증식에 대한 50-10일, 공기 - 액체 인터페이스에서 세포 차별 화를위한 추가 10-14일에서 세포 isolations 2 일 필요합니다. 추가 하루 세포 노출과 샘플 수확이 필요합니다.
1. 마우스 상피 세포 Tracheobronchial (MTEC)의 분리.
참고 : 모든 절차를 아래에서 설명을 검토한 결과, 브리검 앤드 위민스 병원 / 하버드 메디컬 스쿨 지역에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
시작하기 전에 :
- 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어를 준비합니다. 250 ML 햄의 F12 기저 미디어 (Cellgro)는 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10 2 U/mL-10 2 MG / ML) 솔루션과 1000 X Fungizone 솔루션 250 μL의 2.50 ML를 추가합니다. 최대 4 주 4 ° C에 보관하십시오.
- 0.15 %의 Pronase의 솔루션을 준비합니다. 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어 10 ML 15 MG의 Pronase를 추가합니다. 신선한 확인 및 사용 전까지 얼음 계속.
- 깨끗한 작업 표면 살균 수술 악기 작은 동물 수술에 적합하고, 세포 isolations의 층상 조직 문화 후드를 준비합니다. 다른 모든 장비는 humidified CO 2 incubators, 추운 방, 탁상 세포 원심 분리기, 거꾸로 현미경, 그리고 일회용 플라스틱 피펫 문화 도자기를 포함한 동물 세포 배양을위한 표준으로 간주됩니다.
- 콜라겐을 준비 I 솔루션 (0.02 N 아세트산에 50 μg / ML). 12 잘 트랜 스웰 플레이트 (코닝)의 각 우물에 피펫 1.0 ML의 콜라겐 솔루션입니다. parafilm에 싸서 실온에서 평평한 표면에 밤새 서 보자.
- 상업에 사용할 마우스 변형 (남 6-8주 오래된 즉, C57Bl / 6)를 사용하여, 2 유도 마취법 같은 CO와 같은 안락사의 승인 방법을 사용하여 마우스를 안락사. 일반적으로 6 마우스는 씨앗 12 잘 트랜 스웰 플레이트를 충분한 세포를 (1.5-2.0 X 10 5 셀 / 마우스) 수율 것입니다.
- 필드를 소독 70 % EtOH 솔루션과 동물 시체 스프레이.
- 깨끗한 수술 가위와 메스로 tracheal 주위 피부를 제거하고, 기관을 폭로. 복부를 열고 가슴을 따라 잘라와 갈빗대를 제거합니다. 기관의 끝 부분이 노출 때까지 조직을 제거합니다.
- 얼음에 항생제를 포함하는 30 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔 관에 플레이스 tracheas.
- 멸균 층상 흐름 후드에서 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 멸균 100mm 페트리 접시에 tracheal 조직을 전송합니다.
- 부드럽게 무균 포셉, 외과 가위로 결합 조직을 해부하다.
- 린스에 항생제를 포함한 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 새로운 100mm 페트리 접시에 tracheal 조직을 전송합니다. 루멘을 폭로 수직 축을 따라 tracheas 컷.
- 10 ML 0.15 %의 Pronase 솔루션을 포함하는 50 ML 튜브에 tracheas을 전송하고 4 박 품어 ° C.
- 두 번째 날에는 미리 준비하십시오 :
- DNAse I 솔루션을 준비합니다. 항생제는 -20 1 ML aliquots하고 저장하십시오 10 MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA) 재고 솔루션 2 ML, 그리고 원유 췌장 DNAse I. 10 밀리그램을 추가 포함 햄의 F12 미디어 ° C 18 ML하려면 (에 해동 사용하기 전에 얼음).
- 20% 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어를 준비합니다. 200 ML 햄의 F12 기저 미디어 (Invitrogen)는 50 ML 열 inactivated FBS, 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10 2 U/mL-10 2 MG / ML) 솔루션, 그리고 1000 X Fungizone 솔루션 250 μL의 2.5 ML를 추가 .
- 항생제를 포함하는 MTEC 기본 매체를 준비합니다. 위해 475.5 ML DMEM/F12 기본 미디어 (Cellgro)는 7.5 ML 1 M HEPES 솔루션, 200 MM의 글루타민 솔루션, 7.5 % NaHCO 3 솔루션, 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 5 ML 2 ML 10 ML, 500 μL를 추가 1000 X Fungizone 솔루션
- MTEC medium/10 % FBS를 준비합니다. 항생제를 포함하는 MTEC 기본 매체 45 ML하기 위해, 5 ML 열을 inactivated FBS를 추가합니다.
- 부드럽게 튜브 (1.8 단계에서) 10-12 번, 바위 그리고 그것이 4 30~60분에 대한 독립하자 ° C.
- 튜브와 바위 12 회 20 % FBS와 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 추가합니다.
- 20% FBS와 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 세 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다.
- 얼음이 솔루션을 별도로 설정 Pronase 솔루션에서 tracheas를 제거합니다. 햄의 F12를 포함하는 첫번째 원뿔 관에 tracheas을 전송하고 관에게 12 번 반전. 이 과정 두 번 더 반복합니다.
- 한 50 ML 튜브로 단계 1.13에서 세 supernatants와 Pronase 솔루션을 결합합니다. 나머지 조직을 폐기하십시오.
- 10 4 분 ° C, 그리고 뜨는 폐기를 위해, 1400rpm에서 원심 분리기 (A - 4-62 로터가 장착된 Eppendorf 5810R의 원심 분리기 390 XG).
- 부드럽게 한 ML DNAse 솔루션에서 펠렛을 (100-200 μL / 기관) resuspend얼음에 5 분 알을 품다.
- 5 4 분 ° C, 그리고 뜨는 폐기에 대한 1400rpm (390 XG)에서 원심 분리기.
- 10% FBS를 포함하는 8 ML MTEC 매체에있는 세포 펠릿을 Resuspend
- Primaria 판에 플레이트 세포 현탁액 (팔콘). 37 품어 ° 95 %의 공기 분위기에서 C, 5 시간 (주 : 이것은 섬유아 세포에 대한 부정적인 선택 단계)에 대한 5 % CO 2.
- 접시의 세포 현탁액을 모아서 4 ML MTEC 10 % FBS를 포함하는 두 접시와 린스. 풀 세포 현탁액하고 50 ML 원뿔 관에 함께 씻는다.
- cytospin과 셀 카운팅 1 ML을 보존. 5,000 RPM (Eppendorf 5415D)에서 5 분 탁상 원심 분리기의 회전. 나머지 뜨는 500 μL와 resuspend 펠렛을 제거합니다. Trypan 블루 중요한 염색법의 방법을 사용하여 셀 카운팅 100 μL를 사용합니다. cytospin 분석 100 μL 4 aliquots을 절약
- 4, 1400rpm (390 XG)에서 나머지 15 ML의 세포 현탁액을 스핀 ° C, 10 분.
2. 에어 리퀴드 인터페이스에서 전파 및 MTEC의 분화
retinoic 산 주식 솔루션을 준비합니다. 증권 솔루션 A : 95 % EtOH에 5 MM 주식 솔루션을 만들기 위해 어둠 속에서 Retinoic 산성 (미스터 300.44 g / 몰)을 나가는거야. -80에서 호일 포장 튜브에 저장 ° C. 필요에 따라, 50 μL 증권에게, 500 μL BSA 솔루션 (100 MG / ML)와 49.5 ML 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)을 추가하여 재고 솔루션 B를 (5 μm의) 준비합니다. 호일에 저장소가 최대 4 주 동안 -80 ° C에서 튜브를 감쌌다.
retinoic 산성을 포함하는 MTEC 확산 매체를 준비합니다. 항생제를 포함하는 45.7 ML MTEC 기저 미디어로, 2.5 ML 열 - inactivated FBS, 1 ML Retinoic 산 주식 B, 250 μL 인슐린 솔루션 (4 MM HCL 2 MG / ML의 인슐린), 250 μL 표피 성장 인자 솔루션 (/ 5 μg을 추가 1 MG / ML BSA가 들어있는 HBS의 ML EGF), 200 μL 소 뇌하수체 추출 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 15 MG / ML), 50 μL 트랜스페린 솔루션 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 5 MG / ML 트랜스페린 ), 50 μL 콜레라 독소 솔루션 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 100 MG / ML). 최종 미디어 준비를 소독 필터와 준비 2 일 이내에 사용합니다.
- 트랜 스웰 플레이트에서 콜라겐 솔루션을 제거, 5 분 후드 아래에 서서하게하고, PBS로 2 회 씻는다.
- 다음 원심 분리는 물론 당 7.5 X 10 4 -1.0 X10 5 세포의 도금을 촉진하는 확산 미디어 (500 μL)의 적절한 볼륨에있는 세포 펠렛을 resuspend. 트랜 스웰 폴리 카보 네이트 막 삽입의 혀끝의 표면에 피펫 500 μL 세포 현탁액. 트랜 스웰의 기초 구획으로 확산 미디어 1.5 ML를 추가합니다.
- 37 빠져들 MTEC 문화를 품어 ° 95 % 공기가 들어있는 humidified 인큐베이터에서 C, 7-10 일 동안 5 % CO 2.
- 미디어에게 처음을 변경하기 전에 3 일 기다려. 매일 미디어를 변경합니다. 전극 (EVOM Ohmvoltometer, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다)를 사용 transepithelial 세포 저항의 육안 검사 및 측정에 의해 문화를 모니터링합니다.
- 세포가 합류 나타나고 상피 저항 1000 Ω / cm 2에 도달하면, 세포가 ALI에서 차별화하는 준비가되어 있습니다.
- 2 % NuSerum을 포함 MTEC 기저 미디어를 준비합니다. 2퍼센트 V / V.의 최종 농도 MTEC 기본 매체 NuSerum 추가 사용하기 전에 1 X 10 -7 M의 최종 농도 retinoic 산성 주식 B를 추가합니다. 신선한 준비 2 일 이내에 사용합니다.
- 세포 꼭대기의 미디어를 제거하고 2% Nuserum 및 retinoic 산성을 포함하는 750 μL MTEC 기초 매체와 기저 미디어를 대체하여, 10-14 일 동안 차별을 허용합니다. 기초 미디어를 변경하고 MTEC는 매일 2 % NuSerum를 포함하는으로 혀끝의 측면을 씻으십시오.
3. 교양 상피 세포에 담배 연기의 응용
- CS 셀 노출 시스템 (EMI 인 스트 루먼트, 피츠버그, PA)를 사용하는 주류 담배 연기에 트랜 스웰 문화의 혀끝의 측면을 폭로. 장치의 사진을 위해 그림 1을 참조하십시오. 기술 사양 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오. 간단히 기기는 통풍 노출 챔버에 연결된 폴리 프로필렌 라인에 주류 연기 그리기 ~ 7-8 퍼프 각 담배를 피우는 연동 펌프로 구성되어 있습니다. 노출 챔버는 물을 순환하여 ° 37 C를 유지하고, 가스 라인 5 % CO 2 분위기에서 관리하고 있습니다. 세포는 켄터키 3R4F 연구 참조 필터 담배 (담배 연구소, 켄터키 대학, 렉싱턴, KY)를 사용하여 연기에 노출 될 수 있습니다. 일반적으로 세포는 총 미립 물질 (TPM)의 100-200 밀리그램 / m 3을 항복, 1-2 담배 연기에 노출되어 있습니다. 컨트롤 문화가 동등한 노출 기간 동안 실내 공기에 노출되어 있습니다.
- TPM은 TE와 함께 제공된 제조 업체의 프로토콜에 따라 측정됩니다- 10C 흡연 기계 (티그 기업). 간단히, 필터 (Pallflex)은 지속적인 흐름 펌프 (샘플링 단위)로 연기 챔버의 샘플링 포트에서 선도적인 샘플링 튜브에 인라인 스테인레스 스틸 홀더에 배치됩니다. 유출 관은 가스 미터 (건식 가스 미터, ONM61, 67, AEM)로 샘플링 장치를 연결합니다. 필터는 가스 샘플링 전후 무게입니다. 전체 자료 MG의 필터에 예금이 샘플 공기의 총 볼륨의 정상화이다.
- 세포는 다음 어느 시점 (즉, 0-24 시간) 게시물 표준 셀 분석 절차에 대한 노출 (즉, 서양 immunoblot 분석, mRNA 분석, 등) 또는 현미경 (즉, 공촛점 또는 전자 현미경)에서 수확한 수 있습니다. 문화 미디어는 또한 크린 시토킨 또는 세포 독성의 assays에 대한 LDH 릴리스에 대한 분석하실 수 있습니다.
4. 대표 결과
ALI에서 성공 상피 분리, 증식, 그리고 차별화는 조약돌 형태로 그대로 monolayer를 얻을 것입니다. 건강 문화 Transepithelilal 세포 저항은 약 1000년부터 2000년까지 Ω / cm 2되어야합니다. 그림 2는 제어 조건과 담배 연기에 노출된 후 상피 세포와 솜털 표시에 대한 스테인드 마우스 호흡기 상피 세포 monolayer을 묘사. 그림 3은 ultrastructure와 속눈썹의 형태를 묘사, 건강 MTEC 문화의 대표적인 전자 micrographs를 보여줍니다.
그림 1. 세 단계, 격리 단계, 전파 단계, 공기 - 액체 인터페이스 (구조)에서 차별화 무대를 통해 상피 세포의 진행의 준비. 상피 세포들은 가라 앉 문화 분아 따위에 의해 번식 transwells에 씨앗을 마우스 기관에서 고립, 그리고 그들이 완전히 차별화하는 공기 - 액체 인터페이스로 변환됩니다. 실험은 일반적으로 지속적인 문화의 24 일 당일에 실시하고 있습니다. 사진은 주류 담배 연기에 교양 세포의 노출을위한 모델 시스템을 묘사. 트랜 스웰 알리 문화 시스템은 온도, 습도 및 CO 2를위한 제어하는 사용자 정의 모듈 담배 연기 전달 시스템 내부에 배치됩니다.
그림 2 상피 세포 문화는 고정 및 스테인드 핵에 대한 (Hoechst 33258), F - 굴지 (녹색, 알렉사 - 플루어 488 - 복합 Phalloidin)되었습니다. 그리고 속눈썹 마커 acetylated α - tubulin (빨간색, Cy3 - 복합 이차 항체). 하단 패널 4 시간 담배 연기 (2 담배, 150 MG / m 3)에 노출 후 촬영 상피 세포의 동일한 이미지를 보여줍니다. (B) 락트 산 탈수소 효소 (LDH) 출시 24 시간으로 표시 담배 연기의 다양한 복용에 노출된 후 기저 매체 측정되었다.
그림 3. 마우스 tracheal 상피로부터 분리된 상피 세포의 공기 - 액체 인터페이스 문화는 전송 전자 현미경에 의해 (TEM) 솜털이있는, 기초, 비 솜털이있는 세포 1의 특성을 몇 가지 subtypes의 구별. 이러한 세포는 pseudostratified 호흡 상피를 typify. 그림 레이블에 해당하는 : BB : 기초 신체, : axoneme, M : mitochondria, N : 핵, S : 기판 (폴리 카보 네이트 막), MV : microvili
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Discussion
마우스 tracheal 상피 세포의 격리를 나타내는 프로토콜 1. 당신이 외의 프로토콜에서 적응하고, 다른 수정 2-3. 것입니다 어떤 프로토콜 설명 셀 isolations와 마찬가지로 가장 중요한 부분은 엄격한 무균 기술을 사용하여 세균이나 곰팡이 병원균의 오염을 방지하는 것입니다. 두 번째 중요한 단계는 fibroblast의 tracheas주의 절개로 피할 수있는 문화의 오염, 그리고 1.19 단계에서 설명한대로 부정적인 선택을 방지하는 것입니다. 문화가, 모니터링 씻어과 문화 미디어가 초기 72시간 보육 다음 매일 보충함되어있는 문화가 완전히 ALI의 개시로부터 약 2 주 구별해야합니다.
대부분 만성 담배 연기 노출로 인한 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD)는, 주요 글로벌 건강 문제가 4-7 대표하고 있습니다. COPD는 진보적인 기류 제한, 파괴 폐포 손실 (폐기종), 그리고 담배 연기 4-7로 폐의 염증 반응 과장이 특징입니다. 연구의 수많은 CS로 모델 폐 세포 응답을 시도하는 폐포, 기관지, 그리고기도 상피 세포 시스템을 사용하고 있습니다. 이러한 연구의 대부분은 상피 세포 또는 변형 라인 (즉, 비스 - 2B)에서 실시되었으며, 심판 예제 8-11를 참조하십시오. ALI 트랜 스웰 문화 시스템은 종래의 액체 수 있습니다 (잠수) 문화 1-3에서 제공하는 수있는 그것보다기도가 그들의 생리 방향으로 가까운 형태로 폐 상피 세포의 문화. 추천 프로토콜 마우스 tracheal 차 문화 1이 시스템의 응용 프로그램을 설명했지만, 원칙적으로 다른 기본 상피 세포 (예, 마우스 타입 II 상피 세포, 인간 기관지 상피 세포 등)를 적용할 수 있습니다. 셀 문화 생활 일반 CS의 응용 프로그램은 아마도 더 밀접하게 일반적으로 CS 노출 12-15의 세포 연구에 사용되는 수성 담배 연기 추출물 (CSE)의 응용 프로그램을보다 CS에 인간의 노출을 대략 모델을 나타냅니다. CSE는 전체 연기의 많은 화학 성분이 부족 주류 연기의 가용성 분수를 나타냅니다. 두 CS 노출 시스템 제한이 있지만, CSE는 단일 준비가 여러 실험에 사용할 수 있기 때문에,보다 쉽게 보정되는 장점을 가지고 있으며, 먹이지는 희석 15-16에 의해 이루어진다. 반면에, 우리는 여기 TPM 측정을 기반으로 주류 연기 배달 quantifying하는 방법을 포함합니다. 독소에 노출되는 분자 및 세포 반응의 해설은, 특히 CS는이 문서에 exemplified, 폐의 만성 질환의 병인 특히, 인간의 건강에 대한 대기 오염의 영향에 대한 이해를 더욱 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 귀중한 전문 기술 지원 및 박사 Shivraj Tyagi에 대한 Emeka Ifedigbo 감사합니다. 우리는 또한 현미경 도움을위한 하버드 NeuroDiscovery 센터를 주셔서 감사합니다. 이 작품은 힐레어 램, 그리고 AMK 최에게 수여 NIH 보조금, R01 - HL60234, R01 - HL55330, R01 - HL079904에 부여 09PRE2250120 Predoctoral 미국 심장 협회가 일부 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine |
| Pen/strep | Lonza Inc. | 17-602E | |
| Pronase | Roche Group | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| Collagen I | BD Biosciences | 354236 | From rat tail |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | From Bovine Pancreas |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Without Ca++ or Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | Bovine Pancreas |
| Apo-transferrin (human) | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Vibrio Cholerae |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | Corning | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon BD | 353803 | |
| Pallflex membrane | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector. This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com). |
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References
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